王耀霞 孔凡強(qiáng) 程宏霞 范前業(yè) 朱斌 丁海燕▲
1.青島大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部,山東青島 266003;2.上海醫(yī)藥集團(tuán)青島國風(fēng)藥業(yè)股份有限公司,山東青島 266510
鐵是人體中重要的礦物質(zhì)元素之一,其含量在人體中約占0.004%,它參與人體多種生命活動,對機(jī)體的代謝過程發(fā)揮著極其重要的作用,鐵元素缺乏導(dǎo)致的貧血稱之為缺鐵性貧血[1]。世界上25%以上的人群患有貧血癥,而缺鐵性貧血是最常見的貧血癥之一,占貧血癥患者總數(shù)的50%以上[2-3]。其中妊娠期婦女及兒童由于對營養(yǎng)及微量元素需求量大,是缺鐵性貧血的高發(fā)人群[4-5]。
臨床上常用的口服補(bǔ)鐵劑已發(fā)展了三代,第一代是以硫酸亞鐵為代表的無機(jī)亞鐵鹽類;第二代是以富馬酸亞鐵、琥珀酸亞鐵等為代表有機(jī)亞鐵鹽類;第三代是以大分子螯合鐵為代表的新型補(bǔ)鐵劑。第一代和第二代補(bǔ)鐵劑由于其生物利用度較低、易產(chǎn)生較大的胃腸道副作用和細(xì)胞膜損傷,限制了其臨床應(yīng)用;第三代新型補(bǔ)鐵劑雖然可以降低胃腸道副作用,但還存在一些鐵鹽螯合物體內(nèi)生物利用度低,造價較高等問題[6-9]。目前以多糖鐵復(fù)合物(polysaccharide-iron complex,PIC)為代表的第三代口服補(bǔ)鐵劑,由于具有良好的溶解性及較高的體內(nèi)生物利用度成為近年來研究的熱點(diǎn)[10-11]。PIC 的合成方法以化學(xué)合成法為主[12],有研究人員采用該方法合成出孔石莼多糖鐵復(fù)合物[13]、滸苔多糖鐵復(fù)合物[14]、當(dāng)歸多糖鐵復(fù)合物[15]等,進(jìn)一步研究也表明PIC 的合成并非簡單的物理吸附而是穩(wěn)定絡(luò)合反應(yīng)[16]。目前市售的多糖鐵復(fù)合物膠囊,元素鐵含量高達(dá)150 mg/粒,在消化道能以分子形式被吸收。在臨床上,由于其具有良好的有效性和安全性,常用于妊娠期女性鐵缺乏癥和缺鐵性貧血的治療[17-18]。臨床研究數(shù)據(jù)表明,相對于其他口服鐵劑,多糖鐵復(fù)合物膠囊的胃腸道反應(yīng)等不良反應(yīng)發(fā)生率更低[19-22]。
多糖鐵復(fù)合物膠囊雖上市多年,但各國藥典均未收載該品種,對于口服固體制劑而言,溶出度檢測是評價藥物制劑劑量和日常監(jiān)管的一個重要指標(biāo)[23]。雖然有文獻(xiàn)報(bào)道了該制劑溶出度的檢測方法,但消解過程較為繁瑣,且耗時較長[24]。本研究建立了一種鄰菲羅啉法測定多糖鐵復(fù)合物膠囊溶出度的方法,該方法簡單、快速、準(zhǔn)確度高。
708-DS 型溶出儀(美國Agilent);UV-2700i 型可見紫外分光光度計(jì)(日本島津);XS205 型電子天平[梅特勒-托利多(上海)有限公司,精密度:0.000 1 g];ME-4001 型電子天平[梅特勒-托利多(上海)有限公司,精密度:0.1g];S201 型PH 計(jì)(梅特勒);H1650-W醫(yī)用離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司,離心半徑為50 mm);HH 數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國宇儀器制造有限公司)。
多糖鐵復(fù)合物膠囊(上海醫(yī)藥集團(tuán)青島國風(fēng)藥業(yè)股份有限公司,181115、181116、181117);標(biāo)準(zhǔn)鐵溶液(規(guī)格:1 000 μg/ml,貯存于1.0 mol/L 硝酸介質(zhì)中,國家有色金屬及電子材料分析測試中心,定值日期:2018 年11 月5 日);鹽酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,20180223);鹽酸羥胺(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,20170124);1,10-菲啰啉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,20171013);三水合乙酸鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,20171013);冰醋酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,20160728);磷酸二氫鉀(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,20171107);氫氧化鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,20150324);十二烷基硫酸鈉(天津市大茂化學(xué)試劑廠,20170901);試劑均為分析純。
2.1.1 試液1 mol/L 鹽酸溶液:精密量取9 ml 濃鹽酸,置100 ml 容量瓶中,用純化水定容,搖勻,得試液Ⅰ。10%鹽酸羥胺溶液:取鹽酸羥胺10.0 g,精密稱定,置100 ml 量瓶中,加純化水溶解并定容,搖勻,得試液Ⅱ。pH 4.5 醋酸緩沖液:取三水合乙酸鈉18.0 g,精密稱定,置1 000 ml 容量瓶中,加適量水使溶解,再精密量取冰醋酸9.8 ml,置容量瓶中,加水定容,搖勻,得試液Ⅲ。0.1%菲啰啉溶液:取1,10-菲啰啉0.1 mg,精密稱定,置100 ml 量瓶中,加純化水溶解并定容,搖勻,得試液Ⅳ。
2.1.2 對照品儲備液 精密量取10.0 ml 標(biāo)準(zhǔn)鐵溶液,移入100 ml 容量瓶中,用純化水定容,搖勻備用。
2.1.3 空白溶液 精密量取1 ml 純凈水,移入100 ml容量瓶中,再依次加入1 ml 試液Ⅰ、2 ml 試液Ⅱ、5 ml試液Ⅲ和5 ml 試液Ⅳ,用純化水定容,搖勻,即得。
2.1.4 供試品溶液 在900 ml 溶出介質(zhì)中加入1 粒多糖鐵復(fù)合物膠囊,按照溶出度測定方法操作,即得供試品溶液。
參考文獻(xiàn)[24]中的溶出度試驗(yàn)條件,對消解方法進(jìn)行研究,確立本品的溶出度測定方法:取本品置沉降籃中,按照《中華人民共和國藥典》2020 版四部[25]通則溶出度與釋放度測定法第二法進(jìn)行,以900 ml 1%十二烷基硫酸鈉的pH 7.5 磷酸二氫鉀溶液為溶出介質(zhì),溶出介質(zhì)溫度為(37±0.5)℃,轉(zhuǎn)速為100 r/min,30 min 時取溶出液5 ml 置離心管中,將離心管放入離心機(jī)中,3 000 r/min 離心10 min,精密量取離心后的上清液1 ml,移入100 ml 量瓶中,加入1 ml 試液Ⅰ,密封,置90℃水浴中加熱10 min,取出,放冷,加入2 ml 試液Ⅱ,搖勻,靜置10 min,再加入試液Ⅲ和5 ml 試液Ⅳ,搖勻,靜置5 min,用純凈水定容,搖勻,靜置10 min。按照《中華人民共和國藥典》2020 版四部[25]通則0401,照紫外-可見光光度法測定吸光度,計(jì)算每粒膠囊的溶出量。
精密量取對照品儲備液1.0 ml,置100 ml 量瓶中,按“2.2”項(xiàng)下方法操作,制備1 μg/ml 的對照品溶液。另取空白溶液、供試品溶液,分別在400~700 nm處進(jìn)行掃描,結(jié)果顯示,在510 nm 處對照品溶液和供試品溶液均有最大吸收,但空白溶液在此處無吸收,本檢測方法專屬性良好。
精密量取對照品儲備液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 ml,分別置100 ml 量瓶中,按照“2.2”項(xiàng)下方法,即得0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 μg/ml 的系列對照品溶液,照紫外-可見分光光度法,在510 nm 波長處測定其吸光度。以鐵離子濃度(C)為橫坐標(biāo),吸光度(A)為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示,鐵離子濃度在0.1~2.0 μg/ml 范圍內(nèi),吸光度與濃度具有良好的線性關(guān)系,線性回歸方程為A=0.202 5C+0.000 66,(r2=0.999 9)。
圖1 對照品溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線圖
按照“2.2”項(xiàng)下方法,由同一分析人員同法制備6 份供試品溶液并對其進(jìn)行紫外測定,6 次檢測結(jié)果的RSD 為2.73%。
對照品溶液穩(wěn)定性:按照“2.3”項(xiàng)下制備對照品溶液,室溫下放置,分別于0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 h依法檢測,結(jié)果顯示對照品溶液的RSD 為0.44%,提示室溫下8 h 內(nèi),對照品溶液的穩(wěn)定性良好。
供試品溶液穩(wěn)定性:按照“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,室溫下放置,分別于5、10、20、30、60、90、120 min 依法檢測,結(jié)果顯示,對照品溶液的RSD 為0.55%。提示室溫條件下2 h 內(nèi),供試品溶液的穩(wěn)定性良好。為方便操作,本實(shí)驗(yàn)選擇將供試品溶液放置10 min 后測定吸光度值。
精密稱取多糖鐵復(fù)合物膠囊(181115)內(nèi)容物,用溶出介質(zhì)配成約含鐵150 μg/ml 的溶液,精密量取0.5 ml 樣品溶液9 份,分別置100 ml 量瓶中,加入“2.1”項(xiàng)下對照品儲備液0.4、0.6、0.8 ml 各三份,按“2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液,依法檢測,計(jì)算回收率,結(jié)果見表1。平均回收率為99.30%,平均RSD 為1.03%,提示在該溶出條件及測定條件下,方法的準(zhǔn)確度良好。
表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果
取3 批多糖鐵復(fù)合物膠囊(每批各6 粒),按“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行溶出度測定,同時對應(yīng)的溶出液按文獻(xiàn)[24]中的消解方法進(jìn)行,依法檢測溶出度,檢測結(jié)果見表2。
表2 兩種方法下多糖鐵復(fù)合物膠囊溶出度比較
本研究方法經(jīng)過專屬性、線性、重復(fù)性、溶液穩(wěn)定性、回收率試驗(yàn)等方法學(xué)驗(yàn)證,結(jié)果良好,適合多糖鐵復(fù)合物膠囊的溶出度測定。
鄰菲羅啉法測定多糖鐵復(fù)合物膠囊溶出度的原理是在酸性條件下,多糖鐵復(fù)合物發(fā)生消解,鹽酸羥胺將解離出的Fe3+還原成Fe2+,F(xiàn)e2+與1,10-菲啰啉結(jié)合生成化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的紅色絡(luò)合物,通過測定紅色絡(luò)合物的吸光度,計(jì)算多糖鐵復(fù)合物膠囊的溶出量。本方法的優(yōu)點(diǎn)在于:①在多糖鐵復(fù)合物消解過程中使用鹽酸替換硫酸作為消解劑,避免了濃硫酸使用過程中的危險性;②消解過程中提高反應(yīng)溫度至90℃,確保多糖鐵復(fù)合物被完全消解的同時,縮短了反應(yīng)時間,對于檢測過程更具可操作性;③在Fe3+被鹽酸羥胺還原成Fe2+后的溶液中加入少量的pH 4.5 醋酸緩沖液,即可使?jié)M足Fe2+與1,10-菲啰啉結(jié)合生成穩(wěn)定的紅色絡(luò)合物的條件,避免了醋酸緩沖液的過量加入。
[通訊作者]過對3 個批次的市售多糖鐵復(fù)合物膠囊溶出結(jié)果測定,本研究方法與文獻(xiàn)方法溶出結(jié)果相當(dāng),同時本研究方法不僅操作簡便、可靠,縮短測定時間,減少時間成本,而且可以大幅減少試劑的用量,降低物質(zhì)成本的同時更加有利于環(huán)境保護(hù)。