唐冰璇，陳 嫻，蔣海燕，曾 奧

（湖南省微生物研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410009）

中草藥是天然藥物，因其低殘留、毒副作用小和抑/殺菌效果明顯且不易產(chǎn)生抗藥性，有些還能提高養(yǎng)殖動(dòng)物的免疫功能和抗病能力，從而備受人們的關(guān)注[1-3]。如板藍(lán)根[4-5]、金銀花[6-7]和黃連[8-10]等具有提高動(dòng)物細(xì)胞分泌干擾素、提高免疫細(xì)胞及肝臟網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬作用的功效，因而能有效地抑制病毒的復(fù)制；黃芩[11-12]等對(duì)金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌和溶血性鏈球菌等革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌都有殺滅和抑制作用等。國(guó)內(nèi)已有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)中草藥對(duì)畜禽養(yǎng)殖的常見(jiàn)致病菌具有不同程度的抑菌作用。因此，該部分研究對(duì)26種中草藥對(duì)畜禽養(yǎng)殖中4類致病菌(大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、葡萄球菌和巴氏桿菌)的抑制作用進(jìn)行檢測(cè)，為進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)用于畜禽養(yǎng)殖的中草藥發(fā)酵制劑提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)用中草藥

板藍(lán)根、地榆、藿香、防風(fēng)、金銀花、艾葉、丹參、烏梅、貫仲、五味子、馬齒莧、虎杖、秦皮、魚(yú)腥草、柯子、下青葉、夏枯草、五倍子、黃芩、黃連、黃芪、大黃、連翹、柴胡、黃柏、山楂購(gòu)買(mǎi)自養(yǎng)天和藥店。

1.1.2 試驗(yàn)菌株

實(shí)驗(yàn)中用到的細(xì)菌由本院實(shí)驗(yàn)室從畜禽中分離和鑒定，包括致病菌大腸桿菌DH5α、產(chǎn)毒大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、低毒巴氏桿菌（巴氏桿菌439）、中毒巴氏桿菌（巴氏桿菌2010）和強(qiáng)毒巴氏桿菌（巴氏桿菌2011），以及生理菌株副干酪乳桿菌和枯草芽孢桿菌。

1.1.3 培養(yǎng)基

大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和巴氏桿菌用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)；金黃色葡萄球菌和沙門(mén)氏菌用營(yíng)養(yǎng)肉湯(含2%NaCl)培養(yǎng)；副干酪乳桿菌用MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)。所有培養(yǎng)基均購(gòu)自廣東環(huán)凱生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 中草藥制備方法

各藥物超微粉的制備：采用BFM-T6BI型貝利粉碎機(jī)分別對(duì)藥物進(jìn)行粉碎，在-10℃～15℃下粉碎15min，過(guò)200目篩，即得各味藥物超微粉體。

采用超微藥物浸提法提取中藥的有效成分，分別取板藍(lán)根、藿香等26味超微中草藥20g，各加入無(wú)菌蒸餾水200 mL浸泡24 h，藥液過(guò)濾，再將濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至20mL，此時(shí)各超微藥物的最終濃度為1 g/mL。將得到的超微藥液經(jīng)高壓滅菌鍋121℃滅菌15 min后，4℃保存，備用。

1.2.2 菌懸液的制備

受試致病菌株復(fù)蘇后分別接種于斜面培養(yǎng)基上,28℃培養(yǎng)24 h,用無(wú)菌生理鹽水洗脫,至菌懸液濃度為107CFU/mL，備用。

1.2.3 培養(yǎng)基擴(kuò)散法

取致病菌菌懸液100 μL涂布于固定培養(yǎng)基平板上,然后在培養(yǎng)基上打孔,

孔徑約5 mm,孔間距離≥2 cm,向孔中注入中草藥藥液(每孔注入50 μL),每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)3個(gè)平行組,置28℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后觀察抑菌圈大小(游標(biāo)卡尺檢測(cè)圈直徑)。抑菌圈直徑≥20 mm為極度敏感：++++；15 mm≤抑菌圈直徑＜20 mm為高度敏感:+++；10 mm≤抑菌圈直徑＜15 mm為中度敏感：++；無(wú)抑菌圈或抑菌圈直徑＜10 mm為低敏或耐藥：+。

1.2.4 二倍稀釋法

根據(jù)抑菌圈結(jié)果，采用常量肉湯二倍稀釋法測(cè)定中藥超微藥液最低抑菌濃度，每種中藥超微藥液取10支試管，每管加入1 mL菌懸液和9 mL肉湯和藥物原液的混合液，配制成1 g/mL、500 mg/mL、250 mg/mL、125 mg/mL、62.5mg/mL、31.25 mg/mL、15.62 mg/mL、7.81mg/mL、3.91 mg/mL以及0 mg/mL（不加藥液對(duì)照）藥物濃度的混合液體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)24 h，以濁度為指標(biāo)檢查試管中有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，以不顯示濁度、細(xì)菌不生長(zhǎng)的那一管的超微藥液濃度作為MIC值。

2 結(jié)果與分析

2.1 26種中草藥對(duì)致病菌的抑制效果

如表1所示，26種中草藥對(duì)大腸桿菌（DH5α為工程菌，產(chǎn)毒大腸桿菌為致病菌）的抑菌效果，地榆、防風(fēng)、烏梅、五味子、黃連對(duì)兩種大腸桿菌均表現(xiàn)出一定的抑菌效果，其中貫仲、柯子和大黃還對(duì)產(chǎn)毒大腸桿菌屬有抑菌效果。由此也可看出，同一中草藥對(duì)同一屬不同種細(xì)菌的抑制效果存在差異，DH5α的耐藥性強(qiáng)于產(chǎn)毒大腸桿菌。

表1 26種中草藥對(duì)大腸桿菌的抑菌效果

如表2所示，26種中草藥對(duì)巴氏菌屬的抑菌效果(3種菌均為致病菌)，地榆、防風(fēng)、烏梅、柯子、五倍子、大黃、連翹和山楂均對(duì)巴氏桿菌有抑制作用，其中貫仲和柴胡對(duì)巴氏桿菌439；黃連和黃柏對(duì)巴氏桿菌439和巴氏桿菌2011也表現(xiàn)出抑菌效果，因此可得出在耐藥性方面：巴氏桿菌2010＞巴氏桿菌2011＞巴氏桿菌439。

表2 26種中草藥對(duì)巴氏菌屬的抑菌效果

根據(jù)表3結(jié)果，地榆、防風(fēng)、烏梅、貫仲、五味子、柯子、五倍子、黃連、大黃和山楂對(duì)兩屬致病菌均表現(xiàn)出抑制作用，同時(shí)，丹參、黃芩、黃連、連翹、柴胡對(duì)金黃色葡萄球菌也具有抑制作用。金黃色葡萄球菌相對(duì)較為敏感，其中烏梅、五味子和大黃對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC分別達(dá)到62.50 mg/mL、62.5 mg/mL和31.25 mg/mL。

表3 26種中草藥對(duì)金黃色葡萄球菌和沙門(mén)氏菌的抑制效果

與前面的致病菌不同，副干酪乳桿菌為益生菌，枯草芽孢桿菌為一種無(wú)致病性的安全微生物，兩種菌均可用于開(kāi)發(fā)畜禽養(yǎng)殖中草藥發(fā)酵制劑。由表4可知，板藍(lán)根、地榆、柯子、五倍子、黃連和大黃對(duì)副干酪乳桿菌表現(xiàn)出一定的抑菌效果，地榆、丹參、烏梅、五倍子、虎杖、五味子、黃連、大黃和連翹對(duì)枯草芽孢桿菌具有抑制作用。

表4 26種中草藥對(duì)副干酪乳桿菌和枯草芽孢桿菌的抑制效果

3 討論

有關(guān)中草藥在畜禽養(yǎng)殖方面應(yīng)用已有諸多報(bào)道，曲徑等[13]報(bào)道顯示，艾葉、黃連、黃柏、地榆、柴胡對(duì)巴氏桿菌均有抑制作用，這與本研究結(jié)果類似，不同之處在于艾葉的抑制效果，其原因可能是艾葉起抑制效果的有效成分易溶于醇，而水提難以溶出其有效成分；其次，本研究結(jié)果顯示，而巴氏桿菌2010對(duì)黃連黃柏表現(xiàn)出極強(qiáng)的耐藥性，說(shuō)明黃連黃柏的抑制效果對(duì)同一屬不同種和不同株的巴氏桿菌存在差異，巴氏桿菌2010如此強(qiáng)的耐藥性有待于進(jìn)一步的研究。

乳酸菌作為益生菌，同時(shí)乳酸菌本身也具有抑制其他細(xì)菌生長(zhǎng)的作用，一般鮮有報(bào)道中草藥對(duì)乳酸菌的抑制效果[14]。本研究結(jié)果顯示，具有較強(qiáng)抑制作用的中草藥（柯子、五倍子、黃連、大黃和黃柏）同樣對(duì)乳酸菌具有抑制作用，但相對(duì)于其他菌，能夠抑制乳酸菌生長(zhǎng)的中草藥較少。該結(jié)果可為乳酸菌和中草藥的合理應(yīng)用提供依據(jù)。

4 結(jié)論

綜述上述結(jié)果，大青葉、夏枯草、黃芪、秦皮、魚(yú)腥草、馬齒莧、艾葉、金銀花、藿香和板藍(lán)根對(duì)被檢致病菌沒(méi)有抑制效果；地榆、防風(fēng)、烏梅、五倍子、五味子、柯子、山楂等對(duì)各致病菌均有抑制效果。結(jié)合中草藥對(duì)枯草芽孢桿菌和副干酪乳桿菌的抑制效果，可選擇貫仲、黃芩和柴胡這一類（對(duì)致病菌具有抑制作用，而對(duì)無(wú)毒菌株無(wú)抑制作用）中草藥，抑或選擇大青葉、夏枯草、秦皮、魚(yú)腥草、馬齒莧、艾葉和金銀花（對(duì)致病菌和無(wú)毒菌株均無(wú)抑制作用）用于開(kāi)發(fā)畜禽養(yǎng)殖中草藥發(fā)酵制劑，這些結(jié)果為后續(xù)枯草芽孢桿菌和副干酪乳桿菌發(fā)酵中草藥研究提供參考。