謝 輝,劉中凱,耿永強(qiáng),馮建萍,多杰昂欠,金 星

在鼠疫疫源地監(jiān)測(cè)中,當(dāng)動(dòng)物鼠疫處于流行末期或靜息期,由于鼠疫菌毒力減弱或完全喪失,不能致動(dòng)物死亡,但存在于動(dòng)物體內(nèi),由于菌量減少,若按一般常規(guī)培養(yǎng)基分離鼠疫菌比較困難,因此進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)必須要求特別敏感的增菌培養(yǎng)基分離鼠疫菌,而且自然界鼠疫菌一般從自斃動(dòng)物體內(nèi)分離,由于自斃動(dòng)物腐敗,從一個(gè)污染的材料中分離鼠疫耶爾森菌(鼠疫菌),受變形桿菌、革蘭氏陽(yáng)性菌的影響鼠疫菌分離困難[1]。因此研制及應(yīng)用一種分離鼠疫耶爾森氏菌的選擇培養(yǎng)基,可以提高鼠疫菌的分離率,是野外鼠疫監(jiān)測(cè)現(xiàn)場(chǎng)及實(shí)驗(yàn)室研究的關(guān)鍵技術(shù)?，F(xiàn)有鼠疫菌的選擇培養(yǎng)基主要有龍膽紫培養(yǎng)基,在實(shí)際工作中,這2種培養(yǎng)基分離污染材料中的鼠疫菌效果不理想,本研究根據(jù)鼠疫菌培養(yǎng)特性,在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入可以刺激鼠疫菌生長(zhǎng)的生化試劑和抑制變形桿菌及革蘭氏陽(yáng)性菌的試劑,研制出2種選擇敏感培養(yǎng)基(1%枸椽酸鈉選擇培養(yǎng)基和4%十二烷基硫酸鈉選擇培養(yǎng)基),通過(guò)實(shí)驗(yàn)菌株在以上2種培養(yǎng)基的生長(zhǎng)測(cè)試,并收集野外材料現(xiàn)場(chǎng)分離,比較2種選擇敏感培養(yǎng)基對(duì)于鼠疫菌的檢出性能和檢測(cè)效果,初步評(píng)價(jià)其應(yīng)用效果。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 腐敗材料 搜集野外動(dòng)物材料(旱獺,犬)共5份,其中1號(hào)和4號(hào)旱獺僅剩股骨殘骸,2號(hào)、3號(hào)旱獺及5號(hào)犬臟器高度腐敗,但仍保留心、肝、脾、肺,各臟器均有不同程度潰爛。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)菌株 耶爾森氏菌屬的鼠疫疫苗株(EV菌株)、假結(jié)核耶爾森菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌以及野外腐敗材料常見(jiàn)雜菌:變形桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、A群鏈球菌均由鼠疫菌專業(yè)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 儀器設(shè)備 Synbiosis Proto col3全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)器,英國(guó)Symbioses公司;低氧細(xì)胞工作站H45 HEPA,英國(guó)DWS公司;Ⅱ級(jí)B2型生物安全柜,賀利氏HERAsafe生物,德國(guó)Heraus公司,中國(guó)細(xì)菌濁度標(biāo)準(zhǔn)管(批號(hào)2018-1)由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。

1.2 方 法

1.2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備 赫氏瓊脂,含牛肉消化液200 m L,水800 m L,蛋白胨10 g,瓊脂14 g,乳糖10 g,調(diào)p H7.2～p H7.4。對(duì)照培養(yǎng)基:1%溶血赫氏培養(yǎng)基,將基礎(chǔ)培養(yǎng)基121℃高壓滅菌30 min后冷卻至50℃左右,冷卻后加入10%脫纖維兔溶血,混勻后傾注平皿。

1.2.2 龍膽紫培養(yǎng)基 龍膽紫0.1 g加無(wú)水乙醇2 m L溶解后,加蒸餾水至90 m L,121℃高壓滅菌30 min高壓滅菌后冷卻至50℃加入新鮮血液10 m L,混合后取10 m L加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基1 L,制備成含有1/10萬(wàn)龍膽紫溶血瓊脂培養(yǎng)基。

1.2.3 1號(hào)培養(yǎng)基(4%十二烷基硫酸鈉選擇培養(yǎng)基) 十二烷基硫酸鈉4 g,紅霉素0.5 mg,膽鹽3號(hào)5 g,阿莫西林12.5 mg,甘露醇1 g,中性紅0.03 g)。2號(hào)培養(yǎng)基(1%枸櫞酸鈉選擇培養(yǎng)基) 去氧膽酸鈉1 g,枸櫞酸鈉1 g,枸櫞酸鐵1 g。將以上2種選擇培養(yǎng)基試劑分別經(jīng)121℃高壓滅菌30 min后冷卻至50℃的1000 m L基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,即組成不同的選擇培養(yǎng)基,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 鼠疫耶爾森氏菌在3種選擇培養(yǎng)基生長(zhǎng)能力的測(cè)定 將鼠疫EV菌株28℃培養(yǎng)48 h,制成濃度為1000個(gè)菌/m L菌懸液,取0.1 m L分別接種以上3種選擇培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基,置于28℃溫箱培養(yǎng)24～48 h,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,觀察記錄平板單個(gè)菌落生長(zhǎng)情況。

1.2.5 3種培養(yǎng)基敏感性及特異性檢測(cè) 將各實(shí)驗(yàn)菌株(耶爾森氏菌屬的鼠疫EV菌株、假結(jié)核耶爾森菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌)、野外腐敗材料常見(jiàn)雜菌(變形桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、A群鏈球菌)制成菌懸液,根據(jù)比濁管稀釋成1000個(gè)菌/m L菌懸液,取0.1 m L涂布到4種培養(yǎng)基上,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,28℃孵箱培養(yǎng)24～48 h,觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。

1.2.6 腐敗動(dòng)物材料鼠疫菌分離培養(yǎng) 采集腐敗動(dòng)物臟器材料(旱獺和犬的股骨、肝、脾),分別接種3種選擇培養(yǎng)基,28℃孵箱培養(yǎng)24～48 h,觀察鼠疫菌生長(zhǎng)及分離情況。在各選擇培養(yǎng)基上挑選可疑鼠疫菌菌落經(jīng)鼠疫噬菌體實(shí)驗(yàn)確診為鼠疫菌,以上實(shí)驗(yàn)均以1%溶血赫氏培養(yǎng)基為對(duì)照培養(yǎng)基。

1.2.7 菌落計(jì)數(shù) 參考《GB 4789.2—2016,菌落總數(shù)測(cè)定》。

2 結(jié)果

2.1 鼠疫菌在3種選擇培養(yǎng)基的生長(zhǎng)情況及特異性檢測(cè) 1號(hào)培養(yǎng)基中的鼠疫耶爾森氏菌、假結(jié)核耶爾森氏菌和小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌生長(zhǎng)良好,均為玫紅色菌落,鼠疫菌發(fā)育成熟,菌落中心呈淡紅色(見(jiàn)圖1)。金黃色葡萄球菌和鏈球菌不生長(zhǎng),大腸埃希氏菌生長(zhǎng)受抑制,菌落計(jì)數(shù)少。變形桿菌的彌漫性生長(zhǎng)受抑制,呈單個(gè)菌落;2號(hào)培養(yǎng)基可見(jiàn)大腸埃希氏菌生長(zhǎng),其它各實(shí)驗(yàn)菌株生長(zhǎng)均受抑制;鼠疫菌在龍膽紫培養(yǎng)基上生長(zhǎng),菌落稍隆起,半透明略帶藍(lán)灰色,鏡下觀察鼠疫菌菌落形態(tài)不典型,生長(zhǎng)緩慢,變形桿菌在龍膽紫培養(yǎng)基上生長(zhǎng)受抑制,呈單個(gè)菌落,大腸埃希氏菌長(zhǎng)滿整個(gè)平板。結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 鼠疫菌在選擇培養(yǎng)基和赫氏培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況Fig.1 Yersinia pestis growth in selective medium and Hexcelite medium

表1 鼠疫菌在4種培養(yǎng)基生長(zhǎng)情況Tab.1 Growth of Yersinia pestis in four culture media

2.2 選擇敏感培養(yǎng)基敏感性的測(cè)定 鼠疫菌在龍膽紫培養(yǎng)基和2號(hào)培養(yǎng)基敏感性差,鼠疫EV菌液濃度為10－7時(shí),未見(jiàn)鼠疫菌生長(zhǎng),1號(hào)培養(yǎng)基在10－8時(shí)依然有菌生長(zhǎng),其敏感性與赫氏培養(yǎng)基一致,見(jiàn)表2。

表2 鼠疫耶爾森氏菌在各培養(yǎng)基敏感性檢測(cè)結(jié)果Tab.2 Sensitivity tests of Yersinia pestis in each medium

2.3 臟器檢驗(yàn)結(jié)果 應(yīng)用選擇培養(yǎng)基檢測(cè)腐敗材料中鼠疫菌,結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 選擇培養(yǎng)基檢測(cè)腐敗材料結(jié)果Tab.3 Selective medium for detection in spoiled materials

3 結(jié) 論

鼠疫菌的分離是所有鼠疫預(yù)防和控制工作的前提和核心,對(duì)于任何從鼠疫監(jiān)測(cè)現(xiàn)場(chǎng)帶回的鼠疫宿主動(dòng)物或動(dòng)物遺骸,鼠疫專業(yè)人員會(huì)盡一切努力分離鼠疫菌,并保存鼠疫菌種[2],分離鼠疫菌的基礎(chǔ)是選擇適合的培養(yǎng)基并能快速挑選目的菌。傳統(tǒng)分離鼠疫基礎(chǔ)培養(yǎng)基是赫氏培養(yǎng)基,鼠疫菌在赫氏培養(yǎng)基上通過(guò)低倍顯微鏡能見(jiàn)灰白色小菌落,鏡下可見(jiàn)菌落中心隆起、表面有黃褐色粗糙顆粒,邊緣不整齊呈薄而透明的花邊狀,為典型鼠疫菌成熟菌落形態(tài)[3],這需要專業(yè)人員憑豐富的經(jīng)驗(yàn)、扎實(shí)的專業(yè)知識(shí)來(lái)辨別鼠疫菌并根據(jù)鼠疫菌噬菌體裂解實(shí)驗(yàn)來(lái)確定鼠疫菌。但在實(shí)際工作中,由于鼠疫菌在不同因素影響下其形態(tài)表現(xiàn)為多樣性[4];自然界存在不被噬菌體裂解的鼠疫菌[5],因此僅從菌落形態(tài)及噬菌體裂解實(shí)驗(yàn)進(jìn)行判斷易漏診。本研究是結(jié)合鼠疫菌特異性酶的特征,在赫氏消化液基礎(chǔ)上研制鼠疫菌選擇敏感培養(yǎng)基,這其中,赫氏消化液用于增菌[6-7],1號(hào)培養(yǎng)基含0.5%膽鹽,具有高度特異性,含有甘露醇同時(shí)具有鑒別作用[8]。

通過(guò)對(duì)3種選擇培養(yǎng)基敏感性和特異性檢測(cè),可以看出3種選擇培養(yǎng)基中,龍膽紫培養(yǎng)基和1號(hào)培養(yǎng)基對(duì)鼠疫菌的生長(zhǎng)和選擇能達(dá)到基本檢出的要求,1號(hào)培養(yǎng)基可以檢出10－1個(gè)菌/m L,敏感性高于龍膽紫培養(yǎng)基,與基礎(chǔ)培養(yǎng)基無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P值和統(tǒng)計(jì)方法)。鼠疫菌株在1號(hào)培養(yǎng)基經(jīng)28℃培養(yǎng)24 h即可生長(zhǎng)發(fā)育成熟,菌落呈玫紅色,具備鼠疫菌典型結(jié)構(gòu)(菌落花邊大,中央顆粒粗糙),變形桿菌、大腸埃希氏菌及革蘭氏陽(yáng)性桿菌生長(zhǎng)均受抑制,結(jié)果顯示該培養(yǎng)基特異性好。龍膽紫培養(yǎng)基是分離鼠疫菌常用選擇性培養(yǎng)基,可以抑制變形桿菌和革蘭氏陽(yáng)性菌,但大腸埃希氏菌在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好,并且抑制鼠疫菌的正常生長(zhǎng),據(jù)此龍膽紫選擇培養(yǎng)基在野外污染嚴(yán)重材料的鼠疫菌培養(yǎng)中應(yīng)用不理想,只適于實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物感染試驗(yàn)或污染不嚴(yán)重時(shí)鼠疫菌的分離[9],例如在鼠疫菌的毒力測(cè)定等實(shí)驗(yàn),鼠疫菌在2號(hào)培養(yǎng)基生長(zhǎng)發(fā)育差,菌落呈灰白色,與其它雜菌不易區(qū)分,不適于鼠疫菌分離培養(yǎng)。

3種選擇培養(yǎng)基應(yīng)用于動(dòng)物疫情的檢測(cè),1號(hào)培養(yǎng)基與龍膽紫培養(yǎng)基的檢出結(jié)果符合率為100%。由于野外動(dòng)物材料腐敗,其中01和04旱獺只剩股骨殘骸,對(duì)照培養(yǎng)基各臟器變形桿菌彌漫性生長(zhǎng),覆蓋少許鼠疫菌,導(dǎo)致分離困難,應(yīng)用1號(hào)選擇培養(yǎng)可抑制變形桿菌彌漫性生長(zhǎng),玫紅色鼠疫菌生長(zhǎng)良好,極易挑選。龍膽紫培養(yǎng)基上鼠疫菌亦可檢出,但生長(zhǎng)緩慢,培養(yǎng)24～48 h依然為初級(jí)菌落。狗臟器培養(yǎng)顯示攜帶噬菌體合并雜菌污染,赫氏培養(yǎng)基上無(wú)法挑選鼠疫菌,通常需應(yīng)用抗噬菌體血清培養(yǎng)基分離鼠疫菌,但在野外無(wú)法制備,本研究應(yīng)用1號(hào)選擇敏感培養(yǎng)基,鼠疫菌24 h發(fā)育成熟,菌落呈玫紅色,結(jié)構(gòu)典型,能抑制雜菌生長(zhǎng),鼠疫菌易于挑選,不足之處在于鼠疫菌分離后依然攜帶噬菌體,所以分離后需在專業(yè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行抗噬菌體血清培養(yǎng)基進(jìn)一步分離培養(yǎng)后菌株方能保存。實(shí)際檢測(cè)可看出1號(hào)培養(yǎng)基效果優(yōu)于龍膽紫培養(yǎng)基。

01號(hào)培養(yǎng)基是筆者自主研發(fā)的顯色培養(yǎng)基,該培養(yǎng)基是利用顯色培養(yǎng)基的原理[10-12],使用中性紅為顯色底物,在鼠疫菌特異性酶作用下酵解甘露醇產(chǎn)酸[13],中性紅指示劑在酸性環(huán)境中產(chǎn)生紅色集團(tuán)附著于菌落上,使鼠疫菌菌落顯示紅色,同時(shí)添加抑制變形桿菌和革蘭氏陽(yáng)性菌的試劑,十二烷基硫酸鈉,紅霉素,膽鹽3號(hào),阿莫西林,對(duì)變形桿菌、大腸桿菌和革蘭氏陽(yáng)性菌抑制作用強(qiáng),適用于檢驗(yàn)腐敗和雜菌污染的動(dòng)物材料,而且生長(zhǎng)的鼠疫菌菌落典型,易于挑選,在野外材料鼠疫菌分離有實(shí)際意義,使用該培養(yǎng)基應(yīng)注意耶爾森氏菌屬中與鼠疫菌近源的假結(jié)核桿菌、小腸結(jié)腸炎菌都具有能發(fā)酵甘露醇的特異性酶,在實(shí)際應(yīng)用中分離疑似菌后應(yīng)做噬菌體裂解實(shí)驗(yàn)和鼠疫核酸檢測(cè)以確證。

利益沖突:無(wú)

引用本文格式:謝輝,劉中凱,耿永強(qiáng),等.一種選擇敏感培養(yǎng)基對(duì)腐敗材料檢測(cè)鼠疫耶爾森氏菌檢測(cè)的應(yīng)用效果[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2022,38(10):906-909,930.DOI:10.3969/j.issn.1002－2694.2022.00.134