陳愛(ài)平,張擁軍

軍團(tuán)菌是一種革蘭氏陰性兼性細(xì)胞內(nèi)寄生菌,廣泛存在于各種水體環(huán)境中,包括江、河、湖泊、冷卻塔水、溫泉、噴泉、加濕器、自來(lái)水等,已經(jīng)分離鑒定至少59種,超過(guò)70個(gè)血清群。與人類疾病關(guān)系最密切的是嗜肺軍團(tuán)菌(Legionellapneumophila,LP),以血清1型軍團(tuán)菌(LPl)引發(fā)的軍團(tuán)菌肺炎最為常見(jiàn),占85%;非嗜肺軍團(tuán)菌(非LP)引起人類感染的有米克戴德軍團(tuán)菌(L.micdadei)、博杰曼軍團(tuán)菌(L.bozemanae)、杜莫夫軍團(tuán)菌(L.dumoffii)、長(zhǎng)灘軍團(tuán)菌(L.longbeachae)等[1-4]。

細(xì)菌全基因組(WGS)是精準(zhǔn)鑒定生物遺傳多樣性的方法。運(yùn)用各種生物信息學(xué)軟件、生物學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù),結(jié)合菌株的流行病學(xué)背景資料進(jìn)行生物信息學(xué)分析,能夠從多個(gè)角度較全面揭示病原菌的遺傳特征。基于基因組序列的流行病學(xué)分析已經(jīng)廣泛運(yùn)用于病原菌的分型鑒定,WGS更加全面、準(zhǔn)確地描述不同來(lái)源分離株的遺傳特征,精準(zhǔn)確定菌株的克隆性和遺傳相關(guān)性,揭示疫情相關(guān)菌株的傳染來(lái)源、傳播途徑和流行規(guī)律等,已經(jīng)成為傳染病疫情分析、研判中重要的技術(shù)手段和趨勢(shì)[1,5]。

本文通過(guò)生物信息學(xué)分析16株軍團(tuán)菌參考菌株基因序列,了解臨床和外環(huán)境分離的軍團(tuán)菌、LP1與非LP之間的基因組特征,全面比較不同菌株的毒力因子、耐藥基因、遺傳差異和種系發(fā)生關(guān)系,從而深入認(rèn)識(shí)不同軍團(tuán)菌的遺傳特征、遺傳聯(lián)系以及潛在的致病性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用參考菌株 從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇基因組序列完整、背景清楚、不同種以及不同來(lái)源(臨床、外環(huán)境)的16株軍團(tuán)菌代表性參考菌株。選用的外環(huán)境非LP都是已知對(duì)人類有潛在致病性的。下載全長(zhǎng)基因組序列,菌株信息見(jiàn)表1。包括5株LP1臨床參考菌株:D-5387、Lens、NY23、Philadephia-1、Paris,3株 外 環(huán) 境LP1參 考 菌 株:Yu237、BJ-9、SZ2012007,4株不同種的外環(huán)境非LP參考菌株:NCTC11533、FDAARGOS_200、NCTC11988、NCTC11983,4株米克戴德臨床參考菌株:2014LM、LMI、NZ2015、NZ2016。

表1 16株軍團(tuán)菌參考菌株信息一覽表Tab.1 List of 16 Legionella species reference strains

表1 (續(xù))

1.2 軍團(tuán)菌參考菌株全基因組功能注釋 分別將16株參考菌株基因組序列導(dǎo)入RAST(Rapid Annotation using Subsystem Technology,https://rast.nmpdr.org/)服務(wù)器[6],逐一進(jìn)行在線分析,下載各自的基因組注釋結(jié)果并進(jìn)行比較。

1.3 軍團(tuán)菌參考菌株多基因組比對(duì) 運(yùn)用MAUVE軟件(version 20150226),選擇16株中的9株參考菌株進(jìn)行多基因組比對(duì)[7]。對(duì)于存在多個(gè)重疊群記錄的基因組序列,運(yùn)用Mauve軟件的move contigs功能,以線性的參考菌株P(guān)hiladephia-1全基因組序列(GenBank登錄號(hào):NC_002942)作為參照,對(duì)這些基因組重疊群進(jìn)行重排,最終以重排后的序列在MAUVE里完成多基因組比對(duì)。

1.4 基于16S r RNA基因的軍團(tuán)菌參考菌株種系發(fā)生 在RAST服務(wù)器確定本研究16株參考菌株的16S r RNA基因在全基因組中的位置,運(yùn)用BioEdit軟件(version 7.2.5)編輯所有菌株的16S r RNA基因序列,隨后,運(yùn)用MEGA軟件(version 7.0.21)中最大似然法進(jìn)行遺傳進(jìn)化和種系發(fā)生分析。

1.5 軍團(tuán)菌參考菌株毒力因子生物信息分析 選擇16株中7株參考菌株,在VFDB(Virulence Factor of Pathogenic Bacteria)(http://www.mgc.ac.cn/VFs/)服務(wù)器上運(yùn)用VFanalyzer在線分析菌株所有潛在的毒力因子,導(dǎo)出結(jié)果并進(jìn)行比較。

1.6 軍團(tuán)菌耐藥基因生物信息分析 在CARD(The Comprehensive Antibiotic Resistance Database)(https://card.mcmaster.ca/genomes)服務(wù)器上分別預(yù)測(cè)分析16株參考菌株的耐藥基因,導(dǎo)出每個(gè)菌株耐藥基因預(yù)測(cè)結(jié)果并進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 軍團(tuán)菌參考菌株全基因組的功能注釋 16株參考菌株基因組大小(3.13～4.23)Mbp。GC含量38.2%～41.7%,其 中8株LP1菌 株GC含 量38.2%～38.4%,4株臨床分離的米克戴德GC含量40.5%～40.6%,4株 外 環(huán) 境 非LP菌 株GC含 量37.1%～41.7%。RAST服務(wù)器的特色就是將功能相似或相關(guān)的基因合并稱為亞系統(tǒng),16株參考菌株亞系統(tǒng)數(shù)量265～387個(gè),最少的是參考菌株2014LM,其余菌株數(shù)量均為380個(gè)左右。編碼基因(CDSs)數(shù)量在3018～3954,最少的菌株是NCTC11533,最多的菌株是NCTC11988。詳見(jiàn)表2。

表2 軍團(tuán)菌參考菌株全基因組主要特征Tab.2 Genomic characterization of Legionella reference strains

2.2 軍團(tuán)菌參考菌株多基因組比對(duì) 對(duì)16株參考菌株中的9株運(yùn)用MAUVE進(jìn)行多基因組比對(duì)分析,結(jié)果顯示4株LP1(D-5387、Pairs、Yu237、BJ-9)之間顯示一致的局部共線區(qū)(Locally Collinear Blocks,LCBs)結(jié)構(gòu),包括LCBs大小、數(shù)量以及排列位置。2株臨床分離的L.micdadei(2014LM、LMI)LCBs結(jié)構(gòu)也相對(duì)一致。3株外環(huán)境分離的非LP(NCTC11533、FDAARGOS_200、NCTC11988)之間基因組大小差異大;相對(duì)于LP1和臨床分離的L.micdadei基因組,外環(huán)境分離的非LP基因組內(nèi)部存在較多的非保守區(qū)域。詳見(jiàn)圖1。

圖1 軍團(tuán)菌參考菌株多基因組比對(duì)結(jié)果Fig.1 Multiple genome alignment of selected Legionella reference strains

2.3 軍團(tuán)菌參考菌株基于16S r RNA基因的種系發(fā)生 16株參考菌株全長(zhǎng)16S r RNA基因序列,利用MEGA軟件繪制種系發(fā)生樹(shù)。8株LP1屬于同一個(gè)主分枝,細(xì)分為3個(gè)小分枝;4株外環(huán)境分離的非LP有2個(gè)分枝,其中一個(gè)分枝跟LP1的遺傳距離較近;4株臨床分離的米克戴德在同一個(gè)主分枝上,相對(duì)于LP1參考菌株,跟非LP參考菌株(NCTC11533)的遺傳關(guān)系較近。詳見(jiàn)圖2。

圖2 16株軍團(tuán)菌參考菌株16S r RNA基因的種系發(fā)生Fig.2 Phylogenetic analysis of 16S r RNA genes for 16 Legionella reference strains

2.4 軍團(tuán)菌參考菌株毒力因子比較 毒力因子是細(xì)菌致病性的重要因素,VFDB是目前功能最齊全的毒力因子數(shù)據(jù)庫(kù)。對(duì)16株中的7株參考菌株運(yùn)用VFDB服務(wù)器進(jìn)行在線分析,分別檢索可能存在的毒力因子類別和毒力因子。結(jié)果發(fā)現(xiàn)共計(jì)存在11類毒力因子類別。

臨床分離的LP1(D-5387、Philadephia-1、Paris)攜帶的毒力因子類別和毒力因子數(shù)量比外環(huán)境分離的LP1(Yu237)和 非LP(FDAARGOS_200、NCTC11983)參考菌株要多。

臨床分離的米克戴德2014LM攜帶的脂肪酸代謝和內(nèi)毒素毒力因子類別,在其它參考菌株中未發(fā)現(xiàn)。

外環(huán)境非LP(FDAARGOS_200、NCTC11983)攜帶的壓力適應(yīng)毒力因子類別,在其它參考菌株中未發(fā)現(xiàn)。

細(xì)菌分泌系統(tǒng)是重要的毒力因子。7株軍團(tuán)菌參考菌株中與分泌系統(tǒng)有關(guān)的毒力因子,除了Yu237缺失Dot/Icm T4BSS外,其余菌株都攜帶有Dot/Icm T4BSS、Lsp T2SS、Lvh T4ASS和T4BSS效應(yīng)蛋白4種毒力因子,數(shù)量分別為23～24、8～11、3～11和3～35個(gè);其中3株臨床分離的LP1攜帶的T4BSS效應(yīng)蛋白毒力因子數(shù)量為31～35個(gè),其它參考菌株數(shù)量3～5個(gè)。詳見(jiàn)表3。

表3 軍團(tuán)菌參考菌株毒力因子比較Tab.3 Comparison of virulence factors for selected Legionella reference strains

2.5 軍團(tuán)菌參考菌株耐藥基因比較 CARD數(shù)據(jù)庫(kù)是常用的全面分析細(xì)菌耐藥性的平臺(tái)。分別將16株參考菌株基因組導(dǎo)入CARD平臺(tái)分析,檢索參考菌株可能攜帶的耐藥基因(表4)。發(fā)現(xiàn)16株均攜帶有可對(duì)氟喹諾酮類、四環(huán)素類抗生素產(chǎn)生耐藥的adeF耐藥基因。2株臨床LP1(Yu237、Paris)和1株外環(huán)境LP1(BJ-9)攜帶有Lpe A、LpeB耐藥基因,可對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素產(chǎn)生耐藥。2株外環(huán)境非LP(FDAARGOS_200、NCTC11983)攜帶有FEZ-1耐藥基因,可對(duì)碳青霉烯類、頭孢菌素、青霉烷類抗生素產(chǎn)生耐藥。

表4 軍團(tuán)菌參考菌株耐藥基因Tab.4 Antimicrobial resistance genes in Legionella reference strains

3 討論

軍團(tuán)菌是機(jī)會(huì)致病菌,廣泛分布于外環(huán)境水體,特定的菌種也存在于潮濕的土壤中;軍團(tuán)菌能夠在真核的吞噬細(xì)胞中寄生和復(fù)制,阿米巴是其主要的自然宿主[8-10]。阿米巴為軍團(tuán)菌提供雙重的作用:一是提供細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的小生態(tài),二是保護(hù)細(xì)菌免于外環(huán)境中抗生素、化學(xué)物質(zhì)、熱、滲透性等損害[11]。由于病原體和宿主之間緊密的關(guān)系,軍團(tuán)菌和原蟲(chóng)通過(guò)基因水平轉(zhuǎn)移(HGT)交換遺傳物質(zhì),尤其在長(zhǎng)期共進(jìn)化中存在真核到原核的基因水平轉(zhuǎn)移[8,12],其主要證據(jù)就是軍團(tuán)菌基因組中存在各種真核功能的效應(yīng)蛋白和亞基[13-15]。本文對(duì)參考菌株進(jìn)行全基因組注釋和多基因組比對(duì)結(jié)果都提示,不同種軍團(tuán)菌無(wú)論基因組大小、CDCs數(shù)量、GC含量以及LCBs結(jié)構(gòu)都存在著差異;說(shuō)明軍團(tuán)菌不同種間基因組差異大。有文獻(xiàn)報(bào)道軍團(tuán)菌基因組之間存在高度的變異和分化,而宿主阿米巴充當(dāng)了軍團(tuán)菌進(jìn)化的熔爐[15-17]。

同種的軍團(tuán)菌GC含量基本相同;多基因組比對(duì)提示LP1和L.micdadei各自的基因組保守區(qū)域LCBs的大小、數(shù)量以及排列位置基本相同,種內(nèi)基因組的大小差異較小;16S r RNA基因的種系發(fā)生樹(shù)顯示8株LP1和4株L.micdadei各自屬于一個(gè)種系進(jìn)化分支;以上結(jié)果都說(shuō)明軍團(tuán)菌基因組種內(nèi)相對(duì)保守;但是種系發(fā)生樹(shù)也提示主要致病型別LP1存在種內(nèi)基因組變異分化現(xiàn)象。軍團(tuán)菌不同的種具有獨(dú)立遺傳的保守核心基因組,同時(shí)能夠選擇性獲得潛在提高毒力的基因[12],是軍團(tuán)菌種內(nèi)基因組相對(duì)保守、種間差異大的生物學(xué)基礎(chǔ)。LP種內(nèi)存在基因重組,是推動(dòng)LP遺傳分化的主要因素,但是LP和其它軍團(tuán)菌種間DNA重組事件很少發(fā)生[10,12]。外環(huán)境分離的不同血清型的非LP軍團(tuán)菌GC含量、基因組大小都存在較大差異,相對(duì)于臨床分離的LP1和L.micdadei,外環(huán)境菌株基因組中間有較多的非保守區(qū)域。外環(huán)境存在大量的可以整合到軍團(tuán)菌的外源DNA[12],導(dǎo)致可能有更多的基因水平轉(zhuǎn)移事件發(fā)生,因此不致病的軍團(tuán)菌比致病的軍團(tuán)菌的遺傳分化更多[18]。

16S r RNA基因是細(xì)菌上編碼核糖體RNA(r RNA)相對(duì)應(yīng)的DNA序列,存在于所有細(xì)菌的基因組中,由高度變異區(qū)域、可變區(qū)域和保守區(qū)域構(gòu)成,可以作為生物的進(jìn)化距離和關(guān)聯(lián)性的標(biāo)志,是研究細(xì)菌種系發(fā)生最常用的遺傳標(biāo)志[19-21]。本研究中,16株參考菌株16S r RNA基因種系發(fā)生分析結(jié)果顯示,相同的軍團(tuán)菌種的不同參考菌株都有各自的主進(jìn)化分支,證實(shí)了16S r RNA基因作為遺傳標(biāo)志的可靠性。

臨床最常見(jiàn)的致病軍團(tuán)菌種LP1攜帶的毒力因子類別和數(shù)量比其它的參考菌株更多,提示軍團(tuán)菌的致病能力跟毒力因子緊密相關(guān)。在眾多的毒力因子中對(duì)軍團(tuán)菌的分泌系統(tǒng)及其效應(yīng)蛋白研究較多。軍團(tuán)菌適應(yīng)細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外不同的環(huán)境是通過(guò)不同的分泌系統(tǒng)及其分泌的效應(yīng)蛋白實(shí)現(xiàn)的。其中高度保守的IVB分泌系統(tǒng)(type IVB secretion system-T4BSS)也稱為Dot/Icm T4BSS分泌系統(tǒng)[16,22],對(duì)軍團(tuán)菌適應(yīng)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境以及細(xì)胞內(nèi)復(fù)制非常關(guān)鍵,Dot/Icm T4BSS橫跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移300多種細(xì)菌的效應(yīng)蛋白進(jìn)入宿主細(xì)胞[10,16,22-23];同時(shí)阻止溶酶體對(duì)細(xì)菌的降解并從宿主細(xì)胞獲得營(yíng)養(yǎng)[11]。本研究中臨床LP1均攜帶Dot/Icm T4BSS;同時(shí)攜帶的T4BSS效應(yīng)蛋白毒力因子數(shù)量明顯多于其它參考菌株。有文獻(xiàn)報(bào)道軍團(tuán)菌編碼大量的效應(yīng)蛋白,很多只存在于LP,不同的軍團(tuán)菌種中具有較大的差異[11,24],具有高度變異蛋白結(jié)構(gòu)域的效應(yīng)蛋白具有種的特異性[12];結(jié)果也提示我們T4BSS效應(yīng)蛋白跟LP1的致病能力緊密相關(guān),軍團(tuán)菌在宿主細(xì)胞環(huán)境中分泌效應(yīng)蛋白是其在細(xì)胞內(nèi)生存以及產(chǎn)生致病力的關(guān)鍵因素[25-26]。菌株Yu237缺失Dot/Icm T4BSS,與先前報(bào)道Dot/Icm T4BSS在LP軍團(tuán)菌中是高度保守的結(jié)果不符[10-11],由于本研究挑選的菌株是序列完整的全基因,可能原因是菌株來(lái)源的差異導(dǎo)致結(jié)果的不同。

參考菌株的毒力因子分析顯示均有2型分泌系統(tǒng)(T2SS)和IVA分泌系統(tǒng)(Lvh T4ASS),其中T2SS毒力相關(guān)因子的數(shù)量在菌株間差異不大,Lvh T4ASS毒力因子在臨床分離的LP1和米克戴德中的種類和數(shù)量比外環(huán)境分離的非LP菌株要多。T2SS有助于軍團(tuán)菌生物膜的形成,以及細(xì)菌在阿米巴和巨噬細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和抑制感染細(xì)胞的細(xì)胞因子反應(yīng)等功能[11]。Lvh T4ASS主要作用是幫助軍團(tuán)菌在特定的環(huán)境下生長(zhǎng),如低溫、水壓、β-內(nèi)酰胺抗生素、過(guò)氧化氫、漂白水等,同時(shí)保護(hù)LP不受巨噬細(xì)胞免疫應(yīng)答產(chǎn)生的活性氧自由基的損害[10]。

軍團(tuán)菌培養(yǎng)條件嚴(yán)苛,生長(zhǎng)緩慢,國(guó)內(nèi)外關(guān)于軍團(tuán)菌耐藥情況的研究比較少,軍團(tuán)菌的耐藥情況可能被低估。臨床基本上基于經(jīng)驗(yàn)性用藥,首選的藥物是包括氟喹諾酮類(環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星)、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素(阿奇霉素)和四環(huán)素類的藥物(多西環(huán)素)[27];沒(méi)有快速和準(zhǔn)確的用藥指導(dǎo)方案,降低了抗生素的治療效率。參考菌株的耐藥基因分析發(fā)現(xiàn)16株參考菌株都攜帶有adeF耐藥基因,對(duì)氟喹諾酮類、四環(huán)素類抗生素有潛在的耐藥風(fēng)險(xiǎn)。部分?jǐn)y帶有LpeA、LpeB、FEZ-1耐藥基因,可能對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類、碳青霉烯類、頭孢菌素、青霉烷類抗生素產(chǎn)生耐藥。臨床上已經(jīng)有發(fā)現(xiàn)對(duì)氟喹諾酮類耐藥的LP菌株[28-29],也有報(bào)道在軍團(tuán)菌中發(fā)現(xiàn)β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素抗性基因[12]。運(yùn)用全基因組生物信息分析技術(shù),可以快速對(duì)可能的耐藥基因進(jìn)行預(yù)測(cè),對(duì)臨床治療提供輔助參考。

綜上所述,本文運(yùn)用基于細(xì)菌全基因組序列的生物信息學(xué)分析,對(duì)16株軍團(tuán)菌參考菌株的基因組結(jié)構(gòu)、功能進(jìn)行了全面的解析,深入認(rèn)識(shí)了軍團(tuán)菌的致病性和遺傳進(jìn)化特征,有助于未來(lái)開(kāi)展基因組流行病學(xué)研究,促進(jìn)軍團(tuán)菌病的防控。

利益沖突:無(wú)

引用本文格式:陳愛(ài)平,張擁軍.16株軍團(tuán)菌全基因組比較及重要毒力因子分析[J].中國(guó)人獸共患病學(xué) 報(bào),2022,38(10):854-861.DOI:10.3969/j.issn.1002－2694.2022.00.137