吳子涵，陳澤平，劉震宇，季扶云，萬世園，鄭志

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，安徽 合肥，230009)

由有機(jī)凝膠乳液、雙層乳液、Pickering乳液等構(gòu)建的乳液系統(tǒng)可以提高脂溶性營養(yǎng)成分的穩(wěn)定性[1]。Pickering乳液是一種由固體顆粒穩(wěn)定的乳液輸送系統(tǒng)，具有穩(wěn)定性強(qiáng)、抗奧氏熟化、安全性好等優(yōu)點(diǎn)[2]。在食品領(lǐng)域，已有文獻(xiàn)報(bào)道將蛋白質(zhì)Pickering乳液用于營養(yǎng)物質(zhì)的傳送，認(rèn)為其較厚的界面顆粒層可以起到保護(hù)屏障的作用，確保被封裝的營養(yǎng)成分免受化學(xué)降解[3]。Pickering乳液的穩(wěn)定性主要與液滴的特性密切相關(guān)，液滴間的相互作用是決定乳液穩(wěn)定性的最主要因素。鹽離子可以通過靜電屏蔽作用影響乳液液滴間的相互作用力，從而影響乳液的穩(wěn)定性。DELAHAIJE等[4]研究發(fā)現(xiàn)，NaCl濃度為150 mmol/L時(shí)，乳液發(fā)生絮凝，乳液的粒徑顯著增加，乳液貯藏穩(wěn)定性降低。同時(shí)食品體系中一般含有鈉鹽和鈣鹽，而蛋白質(zhì)及其穩(wěn)定的乳液又易受環(huán)境中鹽離子的影響，因此研究鹽離子對Pickering乳液的穩(wěn)定性于食品乳液體系具有十分重要的意義。

蛋白質(zhì)纖維聚集體是指在遠(yuǎn)離等電點(diǎn)pH值和低離子強(qiáng)度條件下，對蛋白質(zhì)進(jìn)行長時(shí)間的熱處理，形成的富含β-折疊結(jié)構(gòu)的微米級或納米級絲狀纖維。由于纖維聚集體獨(dú)特的絲狀結(jié)構(gòu)和較高的橫縱比，使其在乳液形成和穩(wěn)定方面表現(xiàn)出優(yōu)異的性能[5]。相比于β-乳球蛋白，β-乳球蛋白原纖維具有優(yōu)越的乳化活性和更高的穩(wěn)定性[6]。大豆分離蛋白是一種資源豐富且氨基酸全面的蛋白質(zhì)，富含天門冬氨酸和谷氨酸，容易形成蛋白纖維[7]。然而，關(guān)于大豆蛋白纖維聚集體制備Pickering乳液以及蛋白纖維聚集體Pickering乳液對生物活性物質(zhì)包埋穩(wěn)定性的研究較少報(bào)道。

β-胡蘿卜素是類胡蘿卜素的一種，存在于很多果蔬之中，具有抗癌、抗氧化和預(yù)防心血管疾病等功能[8]。β-胡蘿卜素是一種脂溶性營養(yǎng)成分，在氧、熱及光存在的條件下，容易發(fā)生氧化降解，導(dǎo)致其在運(yùn)輸、儲(chǔ)存、食品應(yīng)用等方面受到了很大的限制[9]。目前，β-胡蘿卜素多以乳液的形式裝載，與傳統(tǒng)乳液相比，Pickering乳液具有更強(qiáng)的穩(wěn)定性可以更好包埋β-胡蘿卜素。本研究利用酸熱處理制備大豆分離蛋白纖維聚集體，探究蛋白濃度、油相比例和NaCl濃度對蛋白纖維聚集體乳液制備及其穩(wěn)定性的影響，同時(shí)研究該纖維聚集體乳液在不同離子濃度下對β-胡蘿卜素的包埋效率及貯藏穩(wěn)定性的影響，研究結(jié)果可為大豆分離蛋白纖維聚集體在包埋活性物質(zhì)中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脫脂豆粕，山東禹王公司；β-胡蘿卜素，上海麥克林生化科技有限公司；大豆油，益海嘉里金龍魚糧油食品股份有限公司；其他試劑均為分析純。

Fluko-FA25高速剪切乳化劑機(jī)，上海Fluko公司；Nicolet67傅里葉變換紅外光譜儀，美國Thermo公司；JEM-1400flash透射電子顯微鏡，日本電子公司；F97 Pro熒光光譜儀，上海棱光技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大豆分離蛋白(soy protein isolated, SPI)的提取

參考王金梅等[10]的方法，以料液比1∶15(g∶mL)向低溫脫脂豆粕加入去離子水，調(diào)節(jié)pH值為8并攪拌3 h，8 000×g離心30 min后，取上清液過濾，并將濾液pH值調(diào)節(jié)至4.5。以6 500×g離心30 min，取沉淀。水洗沉淀2次，加水溶解并將其pH值調(diào)至7.0，4 ℃透析48 h，凍干備用。

1.2.2 大豆分離蛋白纖維聚集體(soy protein isolate fibril, SPIF)的制備

稱取SPI凍干粉溶于去離子水中，制成質(zhì)量濃度40 g/L的溶液，室溫?cái)嚢? h后，靜置水合過夜。用2 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)溶液pH值至2.0，以8 000×g離心30 min，上清液用0.45 μm的濾膜進(jìn)行抽濾，用預(yù)調(diào)至pH 2.0的去離子水調(diào)節(jié)溶液至終質(zhì)量濃度20 g/L。將樣品90 ℃恒溫水浴8 h，溫和攪拌。結(jié)束后立即冷卻至室溫，放置于4 ℃冰箱中儲(chǔ)藏備用[11]。

1.2.3 SPIF乳液的制備

用pH 2.0的去離子水將SPIF溶液濃度稀釋至不同質(zhì)量濃度(2.5、5、10和20 g/L)，加入不同濃度的NaCl(0、200、400、600、800、1 000 mmol/L)攪拌均勻，以不同的油相比例(0.4、0.6、0.8)加入大豆油混合。15 000 r/min剪切乳化2 min，得到SPIF乳液。

1.2.4 包埋β-胡蘿卜素的SPIF乳液的制備

將0.2 g β-胡蘿卜素溶于200 mL大豆油中，磁力攪拌器充分?jǐn)嚢? h至β-胡蘿卜素完全溶解。將油相與一定濃度的SPIF溶液按一定比例充分混勻后，以15 000 r/min剪切2 min，4 ℃冷藏保存，在相同條件下以SPI溶液制備乳液作為對照組。所有的容器均使用鋁箔紙包裹，以最大程度的保護(hù)β-胡蘿卜素，減少在制備過程中的損失[12]。

1.2.5 SPIF的表征

1.2.5.1 硫黃素T(thioflavin T,ThT)熒光分析

將8 mg ThT溶解于10 mL 磷酸緩沖液(10，150 mmol/L NaCl，pH 7.0)中，過0.22 μm的濾膜得到ThT母液[13]。對母液稀釋50倍后得到ThT工作液。取40 μL樣品溶液(10 g/L)與4 mL ThT工作液混合，于室溫反應(yīng)2 min。激發(fā)波長設(shè)置為440 nm，對460～600 nm波長進(jìn)行掃描[14]。

1.2.5.2 傅里葉紅外光譜分析(Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR)

取SPI和SPIF的凍干粉，使用傅里葉紅外光譜儀進(jìn)行全波長掃描(400～4 000 cm-1)，隨后用Peakfit 4.12軟件對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行擬合分析。

1.2.5.3 透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)

對SPI和SPIF溶液用預(yù)調(diào)至pH 2.0的去離子水稀釋至1 mg/mL，取10 μL滴在銅網(wǎng)上，多余溶液用濾紙吸干，自然干燥24 h，用TEM觀察微觀形貌。

1.2.6 SPIF乳液的表征

1.2.6.1 不同條件下乳液的外觀觀察

將不同蛋白濃度(2.5、5、10和20 g/L)，不同離子強(qiáng)度(0、200、400、600、800、1 000 mmol/L)和油相比例(0.4、0.6、0.8)的SPIF乳液置于室溫環(huán)境下靜置一段時(shí)間后，進(jìn)行外觀拍照觀察。

1.2.6.2 乳化活性(emulsification activity index,EAI)和乳化穩(wěn)定性(end system identifier,ESI)測定

根據(jù)劉昊天等[15]的方法稍作修改，取3 mL 20 g/L的SPIF溶液分別加入不同濃度的NaCl，攪拌均勻，與1 mL大豆油混合，以15 000 r/min剪切2 min，立即從離心管管底取樣50 μL，用1 g/L SDS溶液稀釋100倍。振蕩混勻后以1 g/L SDS溶液作為空白，讀取樣品在500 nm波長處的吸光值記作A0 min，樣品放置10 min后再次在相同位置取樣50 μL，重復(fù)上述步驟記錄A10 min。樣品的EAI和ESI分別按公式(1)(2)計(jì)算：

(1)

(2)

式中：ρ,樣品質(zhì)量濃度，g/L；φ,油相比例；N,稀釋倍數(shù)。

1.2.6.3 乳液的界面蛋白吸附率

參照江連洲等[16]的方法，取1 mL新制的乳液在13 000×g下離心45 min后，乳液分離為上層乳析層和下層水相，將離心管頂部的乳析層小心移除，用一次性注射器取出下層清液。取100 μL清液用水稀釋至1 mL，使用考馬斯亮藍(lán)法測蛋白含量Cf，C0為乳液中的總蛋白含量。乳液的界面蛋白吸附率按公式(3)計(jì)算：

界面蛋白吸附率/%=(C0-Cf)×100/C0

(3)

1.2.7 包埋β-胡蘿卜素的SPIF乳液性質(zhì)

1.2.7.1 β-胡蘿卜素的包埋率

參照SURH等[17]的方法，在1 mL的乳液中加入3 mL的正己烷，振蕩30 s。混勻后8 000×g離心5 min。取上清液于10 mL容量瓶中用正己烷定容。置于紫外分光光度計(jì)中測定在450 nm處的吸光值。利用β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其中β-胡蘿卜素的含量，由此測出的含量即為未被包埋的β-胡蘿卜素的含量(μg/mL)。用公式(4)計(jì)算：

(4)

1.2.7.2 脂肪上浮率

按照曹亞倩等[18]的方法，取10 mL新制備的乳液置于西寧瓶中，豎直放置于4 ℃下貯藏。同時(shí)記錄不同時(shí)間(0、1、2、4、7、15 d)的下清液層高度(Hs)和總高度(Ht)，脂肪上浮率按公式(5)計(jì)算。

(5)

1.2.7.3 光學(xué)顯微鏡

取新鮮制得的乳液1 mL，并稀釋5倍，然后取40 μL滴加到載玻片上，蓋上蓋玻片，在20倍鏡下觀察液滴分布。

1.2.7.4 貯藏穩(wěn)定性

將β-胡蘿卜素乳液置于西寧瓶中于55 ℃下貯藏7 d。每隔1 d取β-胡蘿卜素乳液1.0 mL，分別加入乙醇和正己烷(1∶2，體積比)。振蕩，取上清液。用分液漏斗重復(fù)萃取3次，合并上層萃取液，并于10 mL容量瓶中定容，測其在450 nm處的吸光值[19]。根據(jù)β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出β-胡蘿卜素的質(zhì)量濃度(μg/mL)，結(jié)果以ρ/ρ0表示，其中ρ為貯藏一定時(shí)間后乳液中β-胡蘿卜素的質(zhì)量濃度(μg/mL)，ρ0為乳液中β-胡蘿卜素的初始質(zhì)量濃度(μg/mL)。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS Statistics進(jìn)行顯著性分析，當(dāng)P<0.05時(shí)認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 SPIF的表征

2.1.1 ThT熒光分析

ThT熒光分析在研究中常被用于定性檢測蛋白的纖維結(jié)構(gòu)，其熒光強(qiáng)度會(huì)隨著纖維聚合物的增加而上升[20]。從圖1-a中可發(fā)現(xiàn)在酸性條件下(pH 2.0)加熱8 h后，SPI在486 nm處的最大熒光強(qiáng)度顯著增加。圖1-b顯示加熱8 h后，SPI樣品的熒光強(qiáng)度值從97.67增加至333.70，提升了241.7%，說明SPI經(jīng)酸熱處理后自組裝形成了具有β-折疊結(jié)構(gòu)的纖維聚合物SPIF。

圖1 不同加熱時(shí)間對SPI的熒光光譜和熒光強(qiáng)度的影響Fig.1 Fluorescence spectrum and fluorescence intensity of SPI under different heating time注：不同小寫字母代表差異顯著，P<0.05,(下同)

2.1.2 FTIR分析

表1 不同加熱時(shí)間下的SPI樣品的二級結(jié)構(gòu) 單位：%

2.1.3 微觀形貌

TEM常用于物質(zhì)微觀形貌的觀察。根據(jù)圖2-a可以觀察到未加熱的SPI樣品為圓球狀顆粒，在pH 2.0條件下加熱處理8 h，20 g/L SPI形成很多細(xì)而長的線狀聚合物，即大豆分離蛋白納米纖維。SPIF長短不一，其直徑在幾至十幾納米，都具有較高的橫縱比(圖2-b)。

a-0 h；b-8 h圖2 不同加熱時(shí)間下SPI的TEM形貌圖Fig.2 Transmission electron microscope morphology of SPI under different heating time

2.2 SPIF乳液的表征

2.2.1 乳液的外觀觀察

不同蛋白濃度和油相比的乳液外觀如圖3所示。新制備的乳液均包含上層的乳液層和下層的水相層，隨著SPIF濃度的增加，相同油相比例下的乳液層的厚度逐漸增加，說明大豆油被成功分散，增加SPIF的濃度可以更好地穩(wěn)定Pickering乳液體系[18]。當(dāng)SPIF質(zhì)量濃度達(dá)到20 g/L時(shí)，乳液幾乎沒有分層，可得出最適蛋白濃度為20 g/L。但是在油相比例0.8時(shí)，乳液頂部有析油現(xiàn)象，說明蛋白濃度為20 g/L的SPIF不足以包裹住全部油滴表面，可得出0.6為最適油相比例，因此選取20 g/L蛋白濃度和0.6的油相比例進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 不同蛋白濃度和油相比例下的乳液外觀Fig.3 The emulsion appearance in different protein concentrations and oil fraction

NaCl的靜電屏蔽效應(yīng)會(huì)導(dǎo)致乳液液滴的進(jìn)一步聚集，不同濃度的Na+會(huì)對乳液的穩(wěn)定性造成一定影響。從圖4中發(fā)現(xiàn)，鹽離子的添加有效地增加了乳液層的厚度，顯著提高了SPIF乳液的穩(wěn)定性。同時(shí)添加NaCl的乳液未分層，且隨著時(shí)間的增加，乳液的表觀狀態(tài)并沒有發(fā)生改變，各個(gè)離子濃度的乳液變化肉眼難以識別。

圖4 不同離子強(qiáng)度下0和7 d的乳液外觀Fig.4 The emulsion appearance at 0 and 7 d with different ionic strengths

2.2.2 乳化活性和乳化穩(wěn)定性分析

由圖5可見，相對于SPI，SPIF的乳化活性和乳化穩(wěn)定性明顯增加。

a-乳化活性；b-乳化穩(wěn)定性圖5 不同離子強(qiáng)度下SPIF的乳化特性Fig.5 Emulsifying properties of SPIF at different ionic strengths

隨著鹽離子濃度的增加，SPIF的乳化活性和乳化穩(wěn)定性均呈現(xiàn)先增高后下降的趨勢。當(dāng)離子強(qiáng)度為600 mmol/L時(shí)，SPIF的乳化活性和乳化穩(wěn)定性最高。這可能是由于鹽離子的加入屏蔽了SPIF之間的靜電斥力，降低了分子間的空間位阻，使得SPIF可以更好地包裹住油滴表面，增加了SPIF的乳化性能[23]。但是當(dāng)NaCl濃度繼續(xù)增加時(shí)，SPIF因靜電斥力的減小相互聚集成更大的團(tuán)聚體，不利于在油滴表面的吸附。并且隨著液滴間的靜電斥力進(jìn)一步減小，使得乳液液滴之間發(fā)生相互聚集，降低了乳液的穩(wěn)定性[23]。綜上在適當(dāng)?shù)柠}離子濃度下，SPIF的乳化活性和乳化穩(wěn)定性會(huì)有一定的提高。

2.2.3 界面蛋白吸附率

如圖6所示，隨著離子強(qiáng)度的增加，蛋白乳液的界面蛋白吸附率逐漸上升。當(dāng)離子強(qiáng)度達(dá)到600 mmol/L時(shí)，界面蛋白吸附率的增加逐漸趨于平穩(wěn)。這可能是由于纖維聚集體間靜電斥力減弱，使得蛋白結(jié)構(gòu)的柔順性更好，可高效且穩(wěn)定的吸附于油水界面[16]。然而過高的離子強(qiáng)度會(huì)使乳液液滴間絮凝，從而界面蛋白吸附率進(jìn)一步增加，但是乳液的穩(wěn)定性下降。

圖6 不同離子強(qiáng)度下SPIF乳液的界面蛋白吸附率Fig.6 Percentage of adsorbed protein of SPIF emulsion under different ionic strengths

2.3 包埋β-胡蘿卜素的SPIF乳液的表征

2.3.1 包埋率

SPI與SPIF在不同離子強(qiáng)度下對β-胡蘿卜素的包埋率如圖7所示。

圖7 不同離子強(qiáng)度下SPI和SPIF乳液對β-胡蘿卜素的包埋率Fig.7 Encapsulation efficiency of β-carotene in SPI and SPIF emulsions under different ionic strengths

在0 mmol/L時(shí)，SPIF乳液對β-胡蘿卜素的包埋率為95.78%，相較于SPI乳液的83.36%，提高了12.42%。SPIF乳液對β-胡蘿卜素的包埋率隨著離子強(qiáng)度的增加而增加，當(dāng)離子強(qiáng)度大于200 mmol/L時(shí)，包埋率為98.2%以上。而SPI乳液對β-胡蘿卜素的包埋率隨著離子強(qiáng)度的增加先上升后下降，說明SPI乳液易受到環(huán)境中鹽離子的影響。

2.3.2 脂肪上浮率

脂肪上浮率通常用來表征乳液的穩(wěn)定性，乳液的不穩(wěn)定會(huì)加速脂肪上浮的現(xiàn)象。圖8-a顯示，SPI乳液(0～1 000 mmol/L)儲(chǔ)存一段時(shí)間后都出現(xiàn)了不同程度的脂肪上浮。鹽離子的添加降低了SPI乳液的脂肪上浮率，原因可能是離子強(qiáng)度的增加使得乳液的黏度增加，在一定程度上阻礙了脂肪的上浮[24]。從圖8-b發(fā)現(xiàn)鹽離子的添加顯著減少了SPIF乳液的脂肪上浮率，當(dāng)離子強(qiáng)度大于200 mmol/L時(shí)，SPIF的脂肪上浮率僅在4.2%以下。并且隨著時(shí)間的增加，SPIF的脂肪上浮率沒有變化，說明鹽離子極大地提高了SPIF乳液的穩(wěn)定性。

a-SPI；b-SPIF圖8 不同貯藏時(shí)間下包埋β-胡蘿卜素乳液的脂肪上浮率Fig.8 Cream index of emulsions encapsulated β-carotene at different storage times

2.3.3 光學(xué)顯微鏡

圖9為不同離子強(qiáng)度包埋β-胡蘿卜素的SPI和SPIF乳液的微觀結(jié)構(gòu)，乳液微觀結(jié)構(gòu)是最為直觀地表征乳液穩(wěn)定性的方法。在SPI乳液中，液滴分布不均，液滴大小不一。隨著鹽離子的添加，乳液液滴粒徑變大，且有液滴聚集現(xiàn)象發(fā)生，這可能與乳液液滴較大有關(guān)。

圖9 不同離子強(qiáng)度下包埋β-胡蘿卜素SPI(a,b,c,d,e,f)和SPIF(A,B,C,D,E,F)乳液的顯微鏡觀察圖Fig.9 Microscopic observation of SPI (a,b,c,d,e,f) and SPIF (A,B,C,D,E,F) emulsions encapsulated β-carotene at different ionic strengths

相較于同樣離子強(qiáng)度下的SPI乳液，SPIF乳液液滴大小明顯減小，且大小較為均一，分布較為一致，乳液乳化穩(wěn)定性強(qiáng)。TANG等[25]發(fā)現(xiàn)蛋白結(jié)構(gòu)的柔性是影響乳化性的重要因素。SPIF的乳化性比SPI要好，可能是因?yàn)镾PIF的線性構(gòu)象柔順性更好，相比SPI可以更高效地吸附在界面上。并且在鹽離子濃度低于800 mmol/L的情況下，隨著離子強(qiáng)度的增加乳化體系中液滴大小沒有明顯變化，進(jìn)一步說明了SPIF乳液具有較強(qiáng)的耐鹽性。

2.3.4 貯藏穩(wěn)定性

β-胡蘿卜素在光、熱條件下易氧化分解，減少β-胡蘿卜素的降解是提高生物利用率和穩(wěn)定性的有效途徑[8]。測定了乳液中β-胡蘿卜素在55 ℃儲(chǔ)藏過程的保留率，結(jié)果如圖10所示。

a-SPI；b-SPIF圖10 不同離子強(qiáng)度下乳液中β-胡蘿卜素的貯藏穩(wěn)定性Fig.10 Storage stability of β-carotene in emulsions with different ionic strengths

β-胡蘿卜素在乳液中的含量會(huì)隨著時(shí)間逐漸降低。在未添加鹽離子的情況下，SPIF乳液中β-胡蘿卜素第7天的保留率為60.28%，相對于SPI乳液提高了7.46%。β-胡蘿卜素在SPI和SPIF乳液中的保留率均隨著鹽離子濃度的增高先升高后降低，且均高于未添加鹽離子時(shí)的保留率，說明鹽離子的添加在一定程度上有利于減少β-胡蘿卜素的降解。在儲(chǔ)藏第7天，當(dāng)離子強(qiáng)度為200 mmol/L時(shí)，β-胡蘿卜素在SPI乳液中的保留率達(dá)到最大72.39%；SPIF乳液中β-胡蘿卜素的保留率在600 mmol/L時(shí)達(dá)到最大值81.46%。這說明SPIF乳液能更好地穩(wěn)定β-胡蘿卜素，并且具有更好的耐鹽性。

3 結(jié)論

SPI通過酸熱處理后，自組裝生成了具有大量β-折疊結(jié)構(gòu)的SPIF。透射電鏡圖片顯示SPIF是一種細(xì)而長的纖維狀結(jié)構(gòu)，具有很高的橫縱比。SPIF的乳化活性和乳化穩(wěn)定性均高于SPI。界面蛋白吸附率的變化證明離子強(qiáng)度的增加使SPIF更好地吸附在乳液液滴表面，從而增加了乳液的穩(wěn)定性。同時(shí)SPIF乳液相對于SPI可以更好地包埋β-胡蘿卜素，提高乳液中β-胡蘿卜素的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性，并且SPIF乳液還可以更好地抵抗環(huán)境中鹽離子的干擾。通過觀察乳液的微觀結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，SPI乳液在高鹽離子濃度下粒徑隨著離子強(qiáng)度的增加而明顯增大，而SPIF乳液液滴分布均勻，具有一定的耐鹽性。本研究有助于擴(kuò)展SPIF在穩(wěn)定Pickering乳液和包埋生物活性物質(zhì)的開發(fā)中的應(yīng)用。