張林祥，張蕾，秦子涵，陳嘉慧，邢利民，朱軍莉*

1(浙江工商大學 食品與生物工程學院，浙江省食品安全重點實驗室，浙江 杭州，310018) 2(湖州老恒和釀造有限公司，浙江 湖州，313213)

浙江玫瑰醋又稱玫瑰米醋，是我國傳統(tǒng)名醋中的液態(tài)發(fā)酵型食醋。浙江玫瑰醋以秈米為原料，在每年的4、5月份投料，經自然發(fā)花、沖缸放水、開耙通風、低溫陳釀等過程制成，其釀造過程中微生物基本來自周邊空氣和草缸蓋，并通過微生物的優(yōu)勝劣汰以及環(huán)境的篩選，在達到微生物動態(tài)平衡的同時，不斷使淀粉糖化、酒化、醋化，形成頗有特色的地方產品。玫瑰醋中含有大量有機酸、氨基酸以及微量礦物質等成分，色澤晶瑩透澈，醇香可口。目前傳統(tǒng)玫瑰醋的研究集中在其傳統(tǒng)工藝的改進，如乙醇及醋酸發(fā)酵條件的優(yōu)化[1-2]，而對其風味成分研究鮮有報道。

固相微萃取技術(solid-phase microextraction,SPME)結合GC或GC-MS被廣泛應用于食醋揮發(fā)性成分檢測。WANG等[3]采用SPME-GC-MS檢測發(fā)現鎮(zhèn)江香醋的主要風味物質為乙酸、乙酸乙酯、糠醛、苯乙醇、四甲基吡嗪、3-羥基丁酮和苯甲醛。ZHU等[4]利用SPME-GC-MS結合GC-O確定了丙酸、乙酸、丁酸、乙偶姻、3-甲基丁酸和糠醛是山西陳醋中主要特征性風味物質。揮發(fā)性成分也是玫瑰醋風味物質的重要組成，是評價玫瑰醋品質的重要指標，而關于玫瑰醋風味的研究較少，方冠宇[2]利用SPME-GC-MS對浙江玫瑰醋發(fā)酵過程中揮發(fā)性成分進行測定，將玫瑰醋樣品分成發(fā)酵前期、發(fā)酵中期和發(fā)酵后期3大類，并得出不同發(fā)酵階段特征性香氣成分。

鑒于此，本研究分析6種不同產地來源的玫瑰醋理化品質，采用HS-SPME-GC-MS對傳統(tǒng)玫瑰醋的揮發(fā)性風味物質進行檢測，并利用氣味活性值(odor activity value，OAV)結合正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA)和變量投影重要性值(variable importance in projection，VIP)分析玫瑰醋樣品中的特征風味物質，獲得玫瑰醋關鍵差異香氣成分，為提升玫瑰醋風味品質提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

6種玫瑰醋樣品均為市售，產地及配料如表1所示；葡萄糖、CuSO4、NaCl、無水乙醇、NaOH、亞鐵氰化鉀、酒石酸鉀鈉、磷酸、鹽酸，均為分析純；β-苯乙醇、乙酸乙酯、苯甲醛、2-乙基丁酸、乙酸，均為國產色譜純。

表1 玫瑰醋產地及配料信息Table 1 Origin and ingredient information of rosy vinegar

1.2 儀器與設備

7890A-5975C GC-MS聯用儀，美國Agilent公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，美國Supelco公司；HH-6數顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司；酒精計，武強縣華洋儀表廠；PHS-3C酸度計，上海雷磁儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 理化指標的測定

酸度：參照GB 5009.239—2016《食品酸度的測定》；還原糖：參照GB 5009.7—2016《食品中還原糖的測定》；氨基酸態(tài)氮：參照GB 5009.235—2016《食品中氨基酸態(tài)氮的測定》；色率：參照周利南等[5]的方法進行測定。

1.3.2 感官評價方法

感官分析采用定量描述性分析進行[6]。感官評價小組由8名經過培訓的成員(4名男性和4名女性，23～30歲)組成。成員首先獨立形成玫瑰醋香氣描述詞，隨后進行組合討論，確定玫瑰醋的8個感官描述屬性(水果香、麩皮香、焦糖香、焦香、杏仁香、黃油香、煙味、酸味)。小組成員被要求在0～5的范圍內記錄每種屬性的香氣強度(0=不可感知，5=非常高的強度)。所有感官分析均在特定的感官品評室進行，每個樣品隨機編號重復測定3次，最終評分取平均值。

1.3.3 SPME-GC-MS檢測方法

取醋樣12.5 mL置于20 mL頂空瓶中，加入100 μL 2-乙基丁酸內標物，用帶有硅橡膠隔墊的瓶蓋密封。將頂空瓶放入50 ℃水浴鍋平衡10 min，然后將已在240 ℃進樣口老化至無雜峰的萃取頭插入頂空瓶中距離液面1 cm處，50 ℃下吸附30 min，取出后插入GC進樣口，240 ℃下解析2 min，進行GC-MS分析。

GC條件：色譜柱采用DB-WAX(60 m×0.25 mm×0.5 μm)，進樣口溫度240 ℃，不分流進樣，載氣為氦氣，恒流模式；柱流速1 mL/min；程序升溫：柱溫30 ℃保持6 min，以2 ℃/min升到140 ℃，然后以4 ℃/min升到220 ℃，保持10 min。

MS條件：電子電離源；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；質量掃描范圍m/z33～500。GC-MS測定結果通過NIST14數據庫檢索進行初步鑒定，再結合檢測組分的保留時間、質譜等進行定性。以2-乙基丁酸為內標物，并配制混合標準溶液，采用加標法測定各組分的相對校正因子fi，相對校正因子(fi)按公式(1)計算[2]：

(1)

式中：ΔWi和ΔAi分別為組分標準品i的增加質量濃度(μg/L)和對應增加峰面積；Ws和As為內標物s的質量濃度(μg/L)與峰面積。

待測風味物質的含量按公式(2)計算：

(2)

式中：Wi和Ai分別為被測組分的質量濃度(μg/L)與峰面積；Ws和As分別為內標物的質量濃度(μg/L)與峰面積。

1.4 關鍵風味物質分析

對各種揮發(fā)性化合物定量后，按公式(3)計算揮發(fā)性成分OAV：

OAVi=Ci/Ti

(3)

式中：Ci，化合物i的質量濃度，μg/L；Ti，化合物i氣味閾值，μg/L，化合物氣味閾值來源于文獻[7～9]。通常認為OAV>1時，該化合物對總體香氣可能有貢獻價值。

1.5 數據分析

采用Origin 8.5和Excel對實驗數據進行處理、分析以及圖形繪制；采用SPSS 20.0進行差異顯著性的分析，以P<0.05為差異顯著；采用SIMCA-P進行PLS-DA和VIP值分析。

2 結果與分析

2.1 玫瑰醋理化指標分析

6種玫瑰醋樣品的理化性質如表2所示。玫瑰醋的還原糖含量為1.30～6.14 g/100 mL，其中以M5玫瑰醋含量最高，可能與后期調配添加的蔗糖相關。還原糖是細菌分解淀粉及低聚糖產生的產物，適量的還原糖可以豐富醋柔和的口感[10]。玫瑰醋樣品pH值為2.73～3.07，總酸含量在3.40～4.41 g/100 mL之間，兩者存在一定的相關性，總酸含量高的玫瑰醋樣品pH值低，這與之前的研究一致[10]。玫瑰醋的pH值低于陳醋，其中山西和鎮(zhèn)江陳醋pH值分別為3.67～3.88和3.35～3.97[11]，主要原因可能是原料、發(fā)酵微生物和儲存時間的差異。

6種玫瑰醋的氨基酸態(tài)氮含量為0.082～0.109 g/100 mL，其中M5樣品玫瑰醋略低于其他組。氨基酸態(tài)氮是指以氨基酸形式存在的氮元素的含量，該指標越高，表明玫瑰醋鮮味越好[12]。玫瑰醋以其色澤鮮艷的玫瑰紅色而聞名，采用色率對玫瑰醋色澤進行量化評價，色率數值越大表示玫瑰醋顏色越深。6組玫瑰醋中M1樣品為暗紅色，而其他5組玫瑰醋色率相近，為透亮的玫瑰紅色，不同來源玫瑰醋顏色差異可能與陳釀時間、發(fā)酵原料有關[13]。

表2 玫瑰醋理化指標分析結果Table 2 Analysis results of physical and chemical indexes of rosy vinegar

2.2 玫瑰醋感官評價

采用感官定量描述分析比較6種不同產地玫瑰醋樣品香氣，篩選出了8個描述玫瑰醋風味的詞匯，即果香、麩皮香、焦香、焦糖香、煙味、黃油香、杏仁香、酸味，并考察玫瑰醋綜合復雜性，如圖1所示。M2、M3、M4三種玫瑰醋具有更強的水果味和黃油味，而M1、M5、M6玫瑰醋樣品表現出更強的麩皮香氣以及煙味。從香氣層面來看，各玫瑰醋香氣特征存在明顯的差異，可能與原料、發(fā)酵和陳釀工藝的差別有關。6種玫瑰醋中水果香、麩皮香、焦糖香氣及綜合復雜性的香氣特征都具有顯著性差異，其中麩皮香差異最大。福建紅曲米醋更具備甜味、澀味、甜香、果香、麩皮香、花香和酒香味，山西老陳醋則表現出甜香、烘烤香、堅果香、酸香、花果香和奶香[14]。

圖1 玫瑰醋感官評價分析Fig.1 Sensory evaluation of rosy vinegar注：*代表P<0.05,**代表P<0.01,***代表P<0.001

2.3 玫瑰醋香氣成分分析

為評價6種玫瑰醋香氣差異，采用HS-SPME-GC-MS分析鑒定玫瑰醋樣品的揮發(fā)性化合物成分及含量，結果如圖2和表3所示。6種玫瑰醋樣品中共檢測出56種化合物，包括7種醇類物質、7種醛類物質、9種酸類物質、15種酯類物質、5種酮類物質、2種酚類物質以及11種雜環(huán)類物質。6組玫瑰醋揮發(fā)性成分各組分含量占比存在一定差異，其中酯類、酸類和醛酮類在玫瑰醋的所有香氣化合物中占比較高。M2揮發(fā)性化合物含量最高，為6 389.26 μg/L，其他3種杭嘉湖產玫瑰醋揮發(fā)性成分含量相近，而非杭嘉湖產2種玫瑰醋揮發(fā)性成分含量較低。

圖2 玫瑰醋揮發(fā)性成分種類含量Fig.2 The content of volatile components in rosy vinegar

酸類物質是食醋最重要的成分之一，占玫瑰醋香氣總量的44.60%～62.71%，賦予玫瑰醋特定的風味及感官屬性。6種玫瑰醋中酸類物質含量差別不大，乙酸是含量最高的物質，為2 263.70～3 077.65 μg/L，其與發(fā)酵中糠醛的生成以及酯化反應相關。6組玫瑰醋樣品中均檢測出丙酸，可能是微生物通過特殊的發(fā)酵工藝條件或者利用某些特定的原料作用產生，在四川麩醋及山西老陳醋中也有檢出[15]，為玫瑰醋提供油脂奶酪香氣。

表3 玫瑰醋揮發(fā)性成分含量 單位：μg/L

注:-表示未檢出；同行標有不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)(下同)

酯類化合物占香氣總量的16.32%～24.01%，是玫瑰醋中定性定量的風味化合物最豐富的類別之一，主要產生于酒精和醋酸發(fā)酵階段。乙酸乙酯是除乙酸外玫瑰醋中含量最高的香氣化合物，賦予玫瑰醋水果香及花香[16]。異丁酸乙酯、異戊酸乙酯在6種玫瑰醋中均有檢出，含量較低，但具有較低的閾值，是玫瑰醋香氣重要的組成部分。

醛類化合物主要來源于脂氧化和降解，玫瑰醋中醛類物質含量較高，占香氣含量的10.88%～22.24%。玫瑰醋中主要的醛類化合物有糠醛、苯乙醛、苯甲醛、異戊醛以及3-甲基丁醛，其中糠醛是在陳釀過程中通過氨基酸脫氨、脫羧形成，具有焦糖氣息，其含量與陳釀時間相關[16]。苯甲醛、苯乙醛和3-甲基丁醛的形成與氨基酸的代謝密切相關。苯甲醛是一種芳香醛，具有糖果、甜味和杏仁氣味[17]。ZHU等[4]發(fā)現在山西老陳醋釀造過程中乳酸菌參與苯甲醛的形成。苯乙醛是另一種芳香醛，具有強烈的甜香和巧克力的香味，可能與苯乙醇氧化或苯丙基氨基酸降解有關[15]。

醇類化合物在玫瑰醋中占香氣總量的2.55%～8.19%，大多數由微生物分解糖苷類、氨基酸和脂肪酸產生，主要產生于酒精發(fā)酵階段[18]。玫瑰醋中醇類化合物含量第2的是苯乙醇，含量為62.05～142.94 μg/L，主要來源于酵母菌的氨基酸代謝產物[19]。而異戊醇和2,3-丁二醇分別增加玫瑰醋水果和奶油香氣，醇類物質組成可能與釀造過程微生物的多樣性及高溫和酯化反應相關[4]。

酮類以3-羥基-2-丁酮(又叫乙偶姻)為主要揮發(fā)性成分，該物質具有牛奶香氣，且合成途徑較多，可通過2,3-丁二醇氧化生成，也可由丙酮酸轉化或經過糖酵解生成[20]。除此之外，2,3-丁二酮也是玫瑰醋中含量較高的酮類物質，3-羥基-2-丁酮和2,3-丁二酮是山西陳醋中的關鍵風味物質，也是關鍵風味化合物吡嗪的前體[21]。

雜環(huán)及酚類物質在玫瑰醋中含量較少(<1%)，形成過程較復雜，主要由釀造原料帶入。在M1、M2、M4玫瑰醋樣品中檢測出2,3,5,6-四甲基吡嗪即川芎嗪，在M2樣品中含量最高，達到342.59 μg/L，該物質具有很好的藥理作用，具有抗血栓、抑制癲癇、抗腫瘤的作用[22]。

2.4 玫瑰醋揮發(fā)性成分OAV分析

風味物質對玫瑰醋整體風味的貢獻可結合化合物的閾值進行評價，風味物質的閾值不同，對整體風味貢獻也有差異[23]。結合表3化合物的定性定量結果及文獻中對應化合物在水中的閾值，計算得到OAV(表4)。在6種玫瑰醋樣品中，共計算得到7種OAV>1風味物質，分別為異戊醛、苯甲醛、乙酸乙酯、乙酸異戊酯、3-乙?；?2-丁酮、2,3-丁二酮、2-乙?；秽?。醇類及酸類化合物在玫瑰醋中含量較高但一般具有較高的氣味閾值，對玫瑰醋風味貢獻較小，而部分低濃度的化合物例如3-乙?；?2-丁酮、2,3-丁二酮、2-乙?；秽韧惢螂s環(huán)類物質會對玫瑰醋風味造成比較大的影響。

表4 玫瑰醋揮發(fā)性成分的閾值、氣味描述及氣味活性值Table 4 Threshold, odor description and OAV of volatile components in rosy vinegar

玫瑰醋樣品中7種香氣化合物的OAV不同，總體來說，玫瑰醋香氣主要以水果香、奶油香和黃油香為主，這與M2、M3、M4在感官上呈現甜香相符，而在所有樣品中乙酸乙酯、3-乙酰基-2-丁酮和2,3-丁二酮OAV均遠高于其他香氣化合物，可認為乙酸乙酯、3-乙?；?2-丁酮和2,3-丁二酮可能是浙江玫瑰醋特征風味香氣成分。

2.5 玫瑰醋揮發(fā)性成分OPLS-DA及VIP分析

OPLS-DA是在PCA基礎上再進行計算分析的一種數據可視化分析方法，同時具備降維和監(jiān)督模式，可通過預設分類，有效去除未控制變量對最終數據造成的影響，進一步挖掘數據之間相關性，同時可以量化特征風味物質造成樣品之間差異的程度[24]。將玫瑰醋OAV>1的風味物質含量作為Y變量進行OPLS-DA建模分析。由圖3可知，模型中R2X=0.830，Q2=0.616，其中R2X=0.830表明該模型能反映83.0%數據的變化，R2和Q2高于0.5(50%)顯示該模型具有較高的可解釋度和擬合度。圖3顯示6種玫瑰醋樣品在OPLS-DA得分散點圖中組內聚集性較好，組間有一定程度的分離。M1、M4、M5聚為一類，表明這3種樣品中香氣化合物對整體玫瑰醋香氣貢獻相似，而M2單獨聚類，提示M2玫瑰醋樣品的風味化合物對香氣總體貢獻不同于其他5種樣品，可能與M2的風味物質較多有關。

圖3 玫瑰醋風味物質的 OPLS-DA 分數散點圖Fig.3 Scores plot of OPLS-DA model of rosy vinegar flavor compounds

利用OPLS-DA形成的VIP值的大小進行關鍵變量分析，一般來說，VIP值越大的變量對模型貢獻率越大。以VIP值>1為界限得到異戊醛、乙酸乙酯和乙酸異戊酯(圖4)是6種玫瑰醋中差異貢獻最大的代謝物，其中乙酸乙酯也是四川保寧醋和山西老陳醋之間的主要差異代謝物，與合成前體物質乙酸的含量直接相關[24]。乙酸異戊酯同樣是鎮(zhèn)江香醋中重要的酯類物質，含量受微生物和環(huán)境的影響，異戊醛是玫瑰醋關鍵呈香化合物，來源于發(fā)酵過程脂類物質氧化和降解[9]。

圖4 基于OPLS-DA模型分析的VIP預測值分布圖Fig.4 Distribution of VIP forecast values based on OPLS-DA model analysis

3 結論

本研究分析和比較了6個產地玫瑰醋的理化特性和揮發(fā)性風味物質。結果表明，6種玫瑰醋樣品的pH、總酸及氨基酸態(tài)氮無顯著差異，僅因工藝不同還原糖含量存在顯著性差異。玫瑰醋具有水果香、麩皮香、焦糖香氣及香氣復雜性等感官屬性，且產地間感官特性存在顯著性差異，特別是麩皮香值。6種玫瑰醋樣品中共鑒定出7類物質76種風味成分，其中浙江產玫瑰醋揮發(fā)性成分總量高于鎮(zhèn)江產地。玫瑰醋含較豐富的揮發(fā)性風味成分，包括苯乙醇、糠醛、苯甲醛、乙酸乙酯、乙酸、異戊酸、乙酸異丁酯、乙酸苯乙酯、2,3-丁二酮、3-羥基-2-丁酮等物質。玫瑰醋樣品中OAV值>1的有7種成分，其中乙酸乙酯、3-乙?；?2-丁酮和2,3-丁二酮被認為是浙江玫瑰醋特征風味香氣成分。PLS-DA結合VIP值判斷異戊醛、乙酸乙酯、乙酸異戊酯是玫瑰醋樣品風味差異的主要風味物質。