梁麗紅，李輝，關(guān)瑩杰，李哲遠(yuǎn)，楊曉辰，張匯，王光強(qiáng)，熊智強(qiáng)，艾連中，夏永軍

(上海理工大學(xué) 健康科學(xué)與工程學(xué)院，上海食品微生物工程技術(shù)研究中心，上海，200093)

牛樟芝(Antrodiacamphorata)又名牛樟菇、樟菇、窟內(nèi)菰、神明菇，屬多孔菌目(Polyporales)，是一種原產(chǎn)于臺(tái)灣牛樟樹(shù)的，具有強(qiáng)烈樟香味的藥食兩用真菌。目前已從牛樟芝中分離得到70多種成分，包括三萜、多糖、氨基酸、二萜脂肪酸和類固醇等[1]。由于野生牛樟芝子實(shí)體生長(zhǎng)極為緩慢且數(shù)量稀少，目前多采用液態(tài)發(fā)酵、固態(tài)發(fā)酵以及椴木培養(yǎng)等人工培養(yǎng)方式。

真菌多糖是一類從各種真菌子實(shí)體、菌絲體以及發(fā)酵液中提取得到的大分子聚合物，因其具有免疫調(diào)節(jié)[2]、抗氧化[3]、抗癌活性[4]等作用而受到廣泛關(guān)注。近年來(lái)針對(duì)牛樟芝多糖的研究大多集中在其結(jié)構(gòu)特性和生理活性方面，而對(duì)其消化特性研究較少。WANG等[5]從牛樟芝菌絲體細(xì)胞壁中分離得到4種中性多糖AC-MHW、AC-MCA、AC-MHA和AC-MAI，其中AC-MHW、AC-MCA因其更高含量的β-1，3-D-葡萄糖殘基而具有較強(qiáng)體外抗氧化活性；LEE等[6]發(fā)現(xiàn)ZnSO4的富集能夠有效提高牛樟芝多糖產(chǎn)量，并抑制脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥，并選擇性阻斷pAKT、pERK 和p38表達(dá)，同時(shí)有效抑制肺腺癌細(xì)胞H1957增殖；ZHANG等[7]發(fā)現(xiàn)牛樟芝多糖通過(guò)阻斷TOP1/TDP1介導(dǎo)的DNA修復(fù)途徑有效抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。

然而部分多糖對(duì)唾液-胃腸道環(huán)境極為敏感，其分子質(zhì)量、化學(xué)成分、結(jié)構(gòu)和生物活性可能會(huì)在消化過(guò)程中受到pH值、膽汁鹽和消化酶的影響而發(fā)生改變[8]。能夠到達(dá)大腸而不被人體消化酶消化的多糖則進(jìn)入遠(yuǎn)端腸道組織被腸道微生物分解利用，產(chǎn)生短鏈脂肪酸(short chain fatty acids，SCFAs)等代謝產(chǎn)物，改善腸道健康[9]。LUO等[10]提取并研究了核桃殼多糖的體外消化特性，發(fā)現(xiàn)其在胃腸道消化過(guò)程中被水解為較小的糖片段。但CAO等[11]發(fā)現(xiàn)超聲微波處理的紫菜多糖不被唾液、胃液、小腸液消化降解，而被腸道微生物利用，提高擬桿菌相對(duì)豐度、降低志賀氏菌相對(duì)豐度。一般來(lái)說(shuō)，多糖復(fù)雜的結(jié)構(gòu)是其發(fā)揮生物學(xué)功能的重要基礎(chǔ)，一旦結(jié)構(gòu)被降解，多糖的生理活性就會(huì)降低甚至完全消失。因此有必要研究牛樟芝胞外多糖在消化道及遠(yuǎn)端腸道中的消化和酵解特性。

課題組前期研究顯示添加油類溶劑(植物油、油酸、油醇等)進(jìn)行萃取發(fā)酵能夠顯著提高牛樟芝菌體生物量及胞內(nèi)化合物產(chǎn)量[12]。真菌胞外多糖的產(chǎn)量與菌體量有著密切的聯(lián)系，因此，本研究將考察油性溶劑萃取發(fā)酵對(duì)牛樟芝液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的影響，并對(duì)牛樟芝胞外多糖抗氧化性以及體外消化特性進(jìn)行研究，為牛樟芝生物活性的進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

牛樟芝菌株(Antrodiacamphorata)S-29為上海食品生物技術(shù)研究所分離所得，保藏于中國(guó)普通微生物細(xì)菌保藏管理中心，保藏編號(hào)為CGMCC 9590。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

葡萄糖、大豆蛋白胨、玉米漿、MgSO4·7H2O、KH2PO4、無(wú)水檸檬酸、油酸、油醇、人工唾液、人工胃液、人工腸液等，上海源葉生物科技有限公司；植物油，豐益貿(mào)易(中國(guó))私人有限公司；三氯乙酸、無(wú)水乙醇，阿拉丁試劑有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

ML204分析天平，瑞士Mettler Toledo公司；ZAZY-B8型搖床，上海知楚儀器有限公司；KBF240型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，德國(guó)Binder公司；Avanti JXN-26高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司；OSB-2100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，日本EYELA公司；HPSEC-MALLS多角度激光光散射儀，美國(guó)Wyatt Technology公司；ICS-5000+高效陰離子交換色譜儀，美國(guó)Thermo公司；7890B-7000D氣相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀，美國(guó)Agilent公司。

1.4 培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法

牛樟芝接種于斜面培養(yǎng)基：葡萄糖40 g/L，豆?jié){60 mL/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KH2PO40.5 g/L，無(wú)水檸檬酸0.5 g/L，瓊脂20 g/L，pH=5。

種子液(g/L)：葡萄糖20，玉米漿2，大豆蛋白胨3， MgSO4·7H2O 0.5，KH2PO40.5，無(wú)水檸檬酸 0.5，pH=5，接種量10%(體積分?jǐn)?shù)，下同)，150 r/min、28 ℃培養(yǎng)5 d。

發(fā)酵液(g/L)：葡萄糖60，玉米漿4，大豆蛋白胨5， MgSO4·7H2O 0.5，KH2PO40.5，無(wú)水檸檬酸0.5，pH=6，接種量15%，150 r/min、28 ℃培養(yǎng)12 d。

1.5 牛樟芝胞外多糖的提取

發(fā)酵12 d后，抽濾棄菌體，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將發(fā)酵液濃縮至原體積的1/4，加入三氯乙酸至4%(體積分?jǐn)?shù))，4 ℃放置10～12 h去除蛋白質(zhì)，用3倍體積無(wú)水乙醇沉淀多糖，9 000 r/min離心15 min取沉淀，加去離子水復(fù)溶后于4 ℃透析72 h，凍干后得到牛樟芝胞外多糖。

1.6 萃取劑種類的選擇

500 mL錐形瓶裝液量100 mL，在發(fā)酵第4天分別加入20 mL油酸、油醇、植物油3種萃取劑，以多糖產(chǎn)量及菌體生物量為標(biāo)準(zhǔn)確定最適合的萃取劑。

1.7 牛樟芝胞外多糖基本組成的測(cè)定

總糖含量采用苯酚-硫酸法[13]進(jìn)行測(cè)定；總蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法[14]測(cè)定；總糖醛酸含量采用間羥基聯(lián)苯比色法[15]測(cè)定。

1.8 牛樟芝胞外多糖分子質(zhì)量和單糖組成的測(cè)定

高效尺寸排阻色譜(high performance size exclusion chromatography，HPSEC)用于測(cè)定多糖樣品的分子質(zhì)量，該儀器配備了示差折光檢測(cè)器，串聯(lián)SB-803 HQ和SB-805 HQ色譜柱。以0.1 mol /L NaNO3水溶液為流動(dòng)相，多糖樣品用上述流動(dòng)相配成1 mg/mL溶液，系統(tǒng)溫度40 ℃，流速0.5 mL/min。

采用Thermo ICS-5000+高效陰離子交換色譜串聯(lián)脈沖安培檢測(cè)器(high-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection，HPAEC PAD)分析多糖樣品的單糖組成。樣品處理：稱取10 mg樣品，加入0.5mL 12 mol/L H2SO4溶液攪拌均勻后加入2.5 mL超純水稀釋，105 ℃加熱2 h，冷卻至室溫后稀釋100倍待用。色譜柱為串連保護(hù)管柱(3 mm×30 mm)的CarboPacTMPA20(3 mm×150 mm)。進(jìn)樣量25 μL；洗脫條件為：20 mmol/L NaOH 20 min，然后提高醋酸鈉濃度梯度50～200 mmol/L 10 min；流速0.5 mL/min；管柱溫度30 ℃。采用Chromeleon 7軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集、處理和分析。經(jīng)對(duì)照8種單糖標(biāo)準(zhǔn)品的洗脫尖峰和標(biāo)準(zhǔn)檢量線進(jìn)行樣品單糖組成的定性和定量分析。

1.9 體外抗氧化性實(shí)驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[16]的方法并稍作改動(dòng)。準(zhǔn)確稱取0.126 1 g鄰苯三酚，用10 mmol/L HCl溶液溶解并定容至100 mL；吸取0.1 mL不同濃度的多糖樣品，加入1.8 mL Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L，pH=8)和2 mL去離子水，室溫反應(yīng)20 min，再加0.1 mL鄰苯三酚溶液，室溫反應(yīng)4 min后在325 nm處測(cè)吸光值，以同濃度抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照，按公式(1)計(jì)算。

(1)

式中：As，反應(yīng)液的吸光值；Ab，去離子水代替鄰苯三酚反應(yīng)液的吸光值；A0，去離子水代替樣品的吸光值。

1.9.2 ·OH清除率的測(cè)定

參照Fenton反應(yīng)體系[17]并稍作改動(dòng)。吸取1 mL不同濃度多糖樣品，加入2 mL FeSO4溶液(1.5 mmol/L)、0.6 mL水楊酸溶液(20 mmol/L)和1.4 mL H2O2(3%)溶液，室溫反應(yīng)30 min后在510 nm處測(cè)吸光值，以同濃度抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照，按公式(2)計(jì)算。

(2)

式中：As，反應(yīng)液的吸光值；Ab，去離子水代替 H2O2反應(yīng)液的吸光值；A0，去離子水代替樣品的吸光值。

1.9.3 DPPH自由基清除率的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[18]的方法并稍作改動(dòng)。吸取2 mL不同濃度多糖樣品，加入1 mL 0.02 mmol/L DPPH-乙醇混合液，室溫反應(yīng)30 min后在517 nm處測(cè)吸光值，以同濃度抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照，按公式(3)計(jì)算。

(3)

式中：As，反應(yīng)液的吸光值；Ab，去離子水代替DPPH-乙醇反應(yīng)液的吸光值；A0，去離子水代替樣品的吸光度。

1.10 牛樟芝胞外多糖的體外消化及糞便酵解特性

1.10.1 體外消化

1.10.1.1 體外模擬消化系統(tǒng)的建立

參考文獻(xiàn)[19]方法并稍作改動(dòng)，將AC-2溶液(2 mg/mL)與模擬唾液混合，置于37 ℃，120 r/min搖床，在0、2、4、6 h分別取樣，100 ℃水浴滅活酶5 min；唾液消化后，將模擬胃液加入混合液，置于37 ℃，120 r/min搖床，在0、2、4、6 h分別取樣；用NaHCO3調(diào)節(jié)胃消化液pH至6.8，加入模擬腸液，置于37 ℃，120 r/min搖床，在 0、2、4 和6 h分別取樣，-80 ℃保存待用。

1.10.1.2 總糖及還原糖的測(cè)定

總糖含量采用苯酚-硫酸法[13]進(jìn)行測(cè)定；還原糖含量測(cè)定采用3,5-二硝基水楊酸比色法[20]。

1.10.1.3 分子質(zhì)量的測(cè)定

將體外消化后的消化溶液加入3倍體積無(wú)水乙醇沉淀多糖，去離子水復(fù)溶，4 ℃透析72 h，凍干得到不同的消化樣品。按1.8的方法測(cè)定。

1.10.2 體外酵解

1.10.2.1 發(fā)酵培養(yǎng)液的制備

參考文獻(xiàn)[21]的方法并稍作改動(dòng)。2 g蛋白胨，2 g酵母提取物，0.5 g半胱氨酸，0.1 g NaCl，2 g NaHCO3，0.04 g K2HPO4，0.04 g KH2PO4，0.01 g MgSO4·7H2O，0.01 g CaCl2·6H2O，0.01 g血紅素，0.5 g牛膽鹽，2 mL吐溫80，10 μL 維生素K，1 mL 1%刃天青，去離子水定容至1 L。

1.10.2.2 體外酵解模型的建立

隨機(jī)選取3名志愿者的糞便樣本5 g裝入無(wú)菌離心管，加入50 mL 10%生理鹽水混合，攪拌均勻后離心(500 r/min、4 ℃、5 min)取上清液得糞便菌懸液，放入?yún)捬跗看??？瞻捉M取90 mL發(fā)酵培養(yǎng)液加10 mL糞便菌懸液；實(shí)驗(yàn)組取90 mL 10 mg/mL AC-2培養(yǎng)液加10 mL糞便菌懸液；陽(yáng)性對(duì)照組取90 mL 10 mg/mL菊糖培養(yǎng)液加10 mL糞便菌懸液。各組用牛皮紙封口后至于37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中啟動(dòng)發(fā)酵，在0、6、12、24 h分別取樣，離心(9 000 r/min、4 ℃、10 min)后收集上清液，-80 ℃保存待用。

總糖及還原糖含量測(cè)定方法參照1.10.1.2， 取發(fā)酵上清液5 mL,使用pH計(jì)測(cè)定pH值。

1.10.2.3 SCFAs含量測(cè)定

采用GC-MS對(duì)體外酵解樣品中乙酸、丙酸、丁酸及總SCFAs含量進(jìn)行測(cè)定，配備毛細(xì)管柱和氫火焰電離檢測(cè)器(flame ionization detector，F(xiàn)ID)。操作條件如下：載氣(N2)的流速為19 mL/min，初始柱溫在100 ℃下保持1 min，然后以4 ℃/min的速率升高至180 ℃，注射器和檢測(cè)器的溫度保持在250 ℃，空氣、N2和H2分別以260、30和30 mL/min的流速用作補(bǔ)充氣體。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵萃取劑對(duì)牛樟芝胞外多糖產(chǎn)量及菌體量影響

如圖1所示，實(shí)驗(yàn)采用的3種油性發(fā)酵萃取劑均能夠有效提高胞外多糖產(chǎn)量和菌體量。與對(duì)照組相比，油酸的促進(jìn)作用最為顯著，胞外多糖產(chǎn)量和菌體生物量分別提高了178.67%、128.15%，達(dá)到236.42 mg/mL和14.67 g/L。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用油酸作為發(fā)酵萃取劑。油酸、油醇、植物油等油性溶劑是良好的氧載體，能夠顯著提高發(fā)酵液中的溶氧水平，富集發(fā)酵液中的代謝產(chǎn)物，減少產(chǎn)物對(duì)菌體的抑制作用，并提高菌體生物量[22]。生物量的提高有利于發(fā)酵液中胞外多糖的積累，是一種有效提高胞外多糖產(chǎn)量的方法。

圖1 萃取劑對(duì)多糖產(chǎn)量和菌體生物量的影響Fig.1 Effect of extractant on exopolysaccharides yield and biomass注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 牛樟芝胞外多糖的基本化學(xué)組成

如表1所示，發(fā)酵過(guò)程中油酸的添加對(duì)多糖基本化學(xué)組成的影響較小。常規(guī)發(fā)酵組得到的胞外多糖AC-1中總糖含量為85.24%，蛋白質(zhì)含量為1.91%；油酸萃取發(fā)酵組得到的胞外多糖AC-2中總糖含量為90.01%，蛋白質(zhì)含量為4.01%。

表1 牛樟芝胞外多糖的基本化學(xué)組成Table 1 Basic chemical compositions of Antrodia camphorata exopolysaccharides

2.3 牛樟芝胞外多糖的分子質(zhì)量和單糖組成

利用HPSEC對(duì)2種胞外多糖進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2-a所示，2種多糖均為單一組分，且分子質(zhì)量接近，分別為26.85、23.07 kDa，說(shuō)明牛樟芝S-29液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生的胞外多糖為小分子質(zhì)量單一組分，經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的純化過(guò)程，就能得到較高純度的多糖，這有利于胞外多糖的大規(guī)模分離和制備。

利用HPAEC對(duì)2種胞外多糖的單糖組成進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2-b所示，AC-1、AC-2的HPAEC圖共出現(xiàn)4個(gè)峰，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比，從左到右依次為巖藻糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖，物質(zhì)的量比分別為0.09∶1∶0.48∶0.24和0.09∶1∶0.49∶0.27，說(shuō)明AC-1與AC-2在單糖組成方面的差異較小。

a-HPSEC圖；b-HPAEC圖圖2 AC-1、AC-2的分子質(zhì)量和單糖組成Fig.2 Molecular weight and monosaccharide compositions of AC-1, AC-2注：1-巖藻糖；2-半乳糖；3-葡萄糖；4-甘露糖

2.4 牛樟芝胞外多糖的抗氧化性

真菌多糖是一種有效的天然抗氧化劑，可用于清除體內(nèi)超氧化物自由基及 ·OH等[23]。一般來(lái)說(shuō)，低分子質(zhì)量多糖具有更高的抗氧化性[24]，這是由于它們含有更多的還原性羥基末端，更易接觸并消除自由基。對(duì)AC-1和AC-2的抗氧化性進(jìn)行探究，結(jié)果如圖3所示。

清除率；b-·OH清除率；c-DPPH自由基清除率圖3 牛樟芝胞外多糖的抗氧化活性Fig.3 Antioxidant activity of A. camphorata exopolysaccharides

2.5 牛樟芝胞外多糖AC-2的體外消化及酵解特性分析

2.5.1 人唾液-胃腸道消化液對(duì)牛樟芝胞外多糖AC-2的影響

多糖生物活性的表達(dá)與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[24]。多糖經(jīng)口服攝入及胃腸道消化液的作用后，其分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)可能發(fā)生較大改變，甚至降解。由于AC-2具有更高的抗氧化活性，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外模型進(jìn)一步考查AC-2在唾液、胃液、胃腸液中的穩(wěn)定性。如表2所示，在唾液消化過(guò)程中，分子質(zhì)量和還原糖含量無(wú)顯著變化，表明AC-2在唾液中沒(méi)有被降解；在胃液消化2 h期間分子質(zhì)量和還原糖無(wú)顯著變化，而消化4 h后，還原糖含量顯著上升至0.23 mg/mL，然后保持穩(wěn)定，但分子質(zhì)量沒(méi)有發(fā)生明顯變化；模擬腸道消化出現(xiàn)類似的趨勢(shì)，消化6 h后還原糖含量顯著增加。這與LI等[25]的研究結(jié)果類似，即來(lái)自沙嵩種子的多糖在體外模擬消化過(guò)程中還原糖含量顯著上升，而分子質(zhì)量沒(méi)有出現(xiàn)顯著變化。

表2 消化過(guò)程中分子質(zhì)量及還原糖含量的變化Table 2 Changes in molecular weight and reducing sugar content during digestion

由圖4可知，在唾液、胃液、胃腸液消化的不同時(shí)間點(diǎn)，AC-2的HPSEC色譜圖中各峰的保留時(shí)間以及峰形基本類似，這說(shuō)明多糖在體外模擬消化過(guò)程中沒(méi)有實(shí)質(zhì)性變化，能夠保持原有結(jié)構(gòu)特征進(jìn)入遠(yuǎn)端腸道組織。

a-模擬唾液消化；b-模擬胃液消化；c-模擬胃腸液消化圖4 消化過(guò)程中HPSEC色譜圖Fig.4 HPSEC chromatogram during the digestion process

2.5.2 腸道菌群對(duì)牛樟芝胞外多糖的影響

2.5.2.1 總糖及還原糖的變化

由于缺乏分解復(fù)雜碳水化合物的酶，經(jīng)口服攝入的多糖主要由人體腸道微生物編碼的碳水化合物活性酶分解并利用?？偺呛考斑€原糖含量的變化是腸道微生物利用碳源發(fā)酵過(guò)程中最直觀的指標(biāo)之一。由圖5-a可知，在空白組中仍含有少量糖類物質(zhì)，含量為0.64 mg/mL，而在24 h時(shí)，總糖含量沒(méi)有出現(xiàn)顯著下降；在AC-2與菊糖組中，總糖含量隨著發(fā)酵過(guò)程的進(jìn)行由最初的6.7和7.05 mg/mL顯著下降至4.26和3.81 mg/mL，其碳水化合物消耗率分別為36.42%和45.96%。由圖5-b可知，空白組還原糖在0～24 h沒(méi)有顯著變化；AC-2組與菊糖組還原糖含量均在6 h時(shí)達(dá)到最高，分別為0.20和0.36 mg/mL，說(shuō)明AC-2能夠被腸道微生物降解并形成新的還原性末端；在6～24 h內(nèi)還原糖含量顯著下降，這歸因于腸道微生物對(duì)還原糖的利用。以上結(jié)果表明AC-2與菊糖均可被腸道微生物利用，且在6 h時(shí)降解速度最快，但AC-2的降解程度較低。

a-總糖；b-還原糖圖5 酵解過(guò)程中總糖及還原糖含量變化Fig.5 Changes in the total sugar and reducing sugar content during fermentation

2.5.2.2 酵解液pH

多數(shù)活性多糖被腸道微生物降解和利用后，會(huì)產(chǎn)生酸性物質(zhì)，降低腸道中的pH環(huán)境。由圖6可知，各組在模擬發(fā)酵初始階段pH無(wú)顯著性差異；在發(fā)酵開(kāi)始后6 h時(shí)，各組pH均出現(xiàn)顯著下降；但在發(fā)酵6 h后，空白組pH不再下降，這是由于發(fā)酵液中缺乏足夠的碳源；而AC-2組與菊糖組pH持續(xù)下降，在24 h時(shí)，AC-2組降至6.08，菊糖組降至4.26。這說(shuō)明腸道微生物在發(fā)酵過(guò)程中利用AC-2與菊糖產(chǎn)生了酸性物質(zhì)。

圖6 酵解過(guò)程中pH的變化Fig.6 Changes in pH during fermentation

2.5.2.3 酵解過(guò)程中SCFAs含量

SCFAs是腸道微生物在利用多糖進(jìn)行發(fā)酵時(shí)產(chǎn)生的主要酸性物質(zhì)，可作為腸上皮細(xì)胞的直接能量來(lái)源，從而改善宿主腸道健康[26]。因此對(duì)發(fā)酵過(guò)程中各階段SCFAs的含量進(jìn)行測(cè)定。由圖7可知，發(fā)酵24 h后，AC-2組總SCFAs含量達(dá)到165.28 μg/mL，比菊糖組(145.28 μg/mL)的提升效果更高，說(shuō)明與菊糖相比，盡管AC-2降解程度較低，但更有利于腸道微生物發(fā)酵產(chǎn)生SCFAs。在脂肪代謝和糖異生過(guò)程中，乙酸是一種信號(hào)分子，丙酸參與肝臟中脂肪酸的生成，丁酸是一種重要的能量來(lái)源[11]，在發(fā)酵24 h后，AC-2組的乙酸、丙酸、丁酸含量分別為76.83、27.5、16.03 μg/mL，始終高于空白組，這與長(zhǎng)根菇多糖[8]、江蘺多糖[9]和沙嵩種子多糖[25]的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。綜上所述，AC-2具有促進(jìn)腸道微生物產(chǎn)生SCFAs的益生元潛力。

a-乙酸；b-丙酸；c-丁酸；d-總SCFAs圖7 酵解過(guò)程中SCFAs含量的變化Fig.7 Changes in the content of SCFAs during fermentation

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用原位萃取發(fā)酵技術(shù)進(jìn)行牛樟芝液態(tài)發(fā)酵，油酸的添加能夠顯著提高牛樟芝菌體生物量以及胞外多糖產(chǎn)量，分別達(dá)到14.67 g/L和236.42 mg/mL。進(jìn)一步分析顯示添加油酸發(fā)酵與對(duì)照組所產(chǎn)的胞外多糖基本組成、分子質(zhì)量與單糖組成相似，但是油酸發(fā)酵的多糖AC-2具有更好的自由基清除能力。通過(guò)建立體外模擬消化系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)牛樟芝胞外多糖AC-2是一種穩(wěn)定性良好，不被胃腸道特殊pH條件以及相關(guān)消化酶降解的小分子多糖；糞便發(fā)酵實(shí)驗(yàn)表明AC-2能夠被腸道微生物部分降解，并有效提高總SCFAs含量至165.28 μg/mL。本研究為牛樟芝的人工培養(yǎng)及其胞外多糖生物活性的研究和應(yīng)用提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持，具有較好的參考價(jià)值。