徐亦雯，張 諾，曹瑱艷，申屠旭萍，俞曉平

（中國(guó)計(jì)量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/浙江省生物計(jì)量及檢驗(yàn)檢疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310018）

麥冬Ophiopogon japonicas為百合科沿階草屬植物，其作為我國(guó)傳統(tǒng)浙八味中的一種，具有較高的藥用價(jià)值。麥冬不僅可以作為疾病防治的治療劑，也可以作為健康食品進(jìn)行使用。麥冬在臨床上以其干燥塊根入藥[1]，其主要成分包括甾體皂苷、高異黃酮和多糖等，具有保護(hù)心血管、抗炎、抗癌、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、止咳、抗菌和抗糖尿病等多種理化活性[2]。我國(guó)麥冬主要有浙江的浙麥冬和四川的川麥冬，而浙麥冬質(zhì)量?jī)?yōu)于川麥冬[3]。統(tǒng)計(jì)顯示，浙江省麥冬種植面積約為 6000多畝，畝產(chǎn)120公斤左右，年產(chǎn)量約為720噸[4]，主要應(yīng)用于生產(chǎn)中成藥如參麥注射液、生脈膠囊等，給浙江中藥材產(chǎn)業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)效益。隨著對(duì)浙麥冬需求量的不斷增長(zhǎng)，浙麥冬的栽植量也日益擴(kuò)增，隨之而來(lái)產(chǎn)生了栽培技術(shù)不規(guī)范、病蟲(chóng)害發(fā)生頻繁和農(nóng)藥使用不當(dāng)?shù)葐?wèn)題，對(duì)浙麥冬產(chǎn)量和品質(zhì)產(chǎn)生了嚴(yán)重的影響[5]。

根據(jù)我們前期調(diào)研，黑斑病為浙麥冬主要病害之一，常發(fā)于5月中旬，6—7月為發(fā)病盛期。引起麥冬真菌病害的病原菌主要有尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum[6]、膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides[7]和鏈格孢菌Alternaria alternata[8]等。浙江省慈溪市是浙麥冬的主要種植基地，2019年5月在該基地發(fā)現(xiàn)麥冬植物葉片發(fā)生紅褐色或黃色斑塊，斑塊漸漸擴(kuò)大導(dǎo)致整個(gè)葉片枯死，其傳染速度極為迅速，最終導(dǎo)致整株麥冬死亡，田間染病率可達(dá)40%，嚴(yán)重時(shí)可以高達(dá)70%及以上，其田間病害性狀接近于麥冬黑斑病，但相關(guān)浙麥冬黑斑病病原菌及其防治的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，明確浙麥冬黑斑病的病原菌，建立有效防控技術(shù)，大大降低浙麥冬中黑斑病的發(fā)病率，對(duì)于浙麥冬產(chǎn)增產(chǎn)提質(zhì)至關(guān)重要。

本研究對(duì)采集自慈溪浙麥冬種植基地的黑斑病病株進(jìn)行病原菌分離、純化以及柯赫法則驗(yàn)證，并利用形態(tài)學(xué)觀察和分子序列比對(duì)明確其分類地位，進(jìn)一步利用本實(shí)驗(yàn)室具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628代謝產(chǎn)物研究其對(duì)浙麥冬黑斑病的室內(nèi)和田間防效，為浙江省慈溪市浙麥冬黑斑病的有效防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 黑斑病病原菌來(lái)自于2018—2019年5—7月從浙江省慈溪市麥冬種植區(qū)采集具有典型黑斑病癥的麥冬病株；盆栽健康麥冬由浙江麥冬種植基地提供。淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628: 由浙江省生物計(jì)量及檢驗(yàn)檢疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar, PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g，蒸餾水1000 mL；淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628發(fā)酵培養(yǎng)基（TPM）：可溶性淀粉2%，CaCO30.5%，KH2PO40.3%，NH4Cl 0.3%，F(xiàn)eCl20.1%，黃豆粉4.3%。

1.1.3 試劑與儀器 DNA提取試劑盒、EXTaq聚合酶、DNA marker（上海生工生物工程（上海）股份有限公司）；CTAB提取液（北京索萊寶科技有限公司）；無(wú)水乙醇（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；PCR儀，Sub-Cell GT核酸電泳儀，Gel Doc XR凝膠成像儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；YS顯微鏡（日本尼康公司）；MP Fast-prep-24均質(zhì)儀（北京優(yōu)尼康生物科技有限公司）；Nanodrop2000蛋白核酸定量分析儀（美國(guó)Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 病原真菌分離純化 通過(guò)平板分離方法對(duì)病原菌進(jìn)行分離純化。用75%酒精棉球?qū)φ沱湺瑤Р〗M織進(jìn)行擦拭，將患病組織處切成1.0 cm×1.0 cm的小塊組織，浸泡于75%酒精中30 s，用1% NaClO表面消毒4 min，再用75 %的酒精清洗30 s除去表面殘留的NaClO，無(wú)菌水漂洗3次，將組織水分吸干后置于PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)7 d左右長(zhǎng)出單菌落，挑取單菌落接種于新的PDA培養(yǎng)基上純化，于28 ℃培養(yǎng)箱中恒溫黑暗培養(yǎng)7～14 d后, 觀察菌落形態(tài)和色素的產(chǎn)生情況等，最后將純化菌的孢子用25%的甘油保存于-80 ℃冰箱備用[9]。

1.2.2 致病性測(cè)定 試驗(yàn)利用柯赫法則[10]對(duì)浙麥冬黑斑病病株上分離到的病原真菌進(jìn)行致病性測(cè)定。將分離純化后的病原真菌接種于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，用無(wú)菌水沖洗菌落表面，稀釋后制得濃度為1×106孢子/mL的孢子懸浮液。采用噴霧法進(jìn)行接種，用金剛砂對(duì)健康植株葉片的表面進(jìn)行摩擦，將孢子懸浮液噴灑在摩擦過(guò)的葉片上，用塑料膜將其罩住保濕48 h，無(wú)菌水作為對(duì)照。該試驗(yàn)在26 ℃、光照時(shí)間12L:12D、相對(duì)濕度60%的人工氣候室中培養(yǎng)，每組設(shè)置3組重復(fù)。15 d后觀察并記錄噴霧孢子懸浮液與無(wú)菌水的植株染病及對(duì)比情況，并分離病變組織，病變組織分離步驟同1.2.1。對(duì)該組織進(jìn)行鑒定比對(duì)是否與原始病原菌相同。

1.2.3 形態(tài)學(xué)鑒定 將純化后的病原菌接種于PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)7 d。觀察其菌落生長(zhǎng)速率、形態(tài)和顏色等。孢子形態(tài)觀察：用無(wú)菌水將孢子沖洗過(guò)濾后取20 μL于玻片上在400倍顯微鏡下觀察，記錄孢子形態(tài)大小、有無(wú)橫隔縱膈等。產(chǎn)孢鏈觀察：將PDA平板直接置于200倍顯微鏡下觀察其產(chǎn)孢鏈[11-13]。

1.2.4 病原真菌分子生物學(xué)鑒定 病原真菌DNA的提?。翰捎肅ATB法進(jìn)行DNA的提取[14]，并使用基因EF-1α、RPB2、Alt a 1、His 3、ATP和ITS的引物（表1），擴(kuò)增相應(yīng)基因序列片段[15,16]。PCR反應(yīng)總體積為 50 μL，ExTaq25 μL，上下游引物各 1.5 μL，DNA 模板 0.5 μL，ddH2O 21.5 μL。PCR 反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，51 ℃～62 ℃退火溫度30 s，72 ℃延伸45 s，共34個(gè)循環(huán)，最終72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物送至杭州有康生物有限公司進(jìn)行測(cè)序，所獲序列在NCBI上進(jìn)行BLAST序列比對(duì)分析，通過(guò)MEGA X鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建發(fā)育樹(shù)。

表1 本試驗(yàn)中所用的引物序列Table 1 Primers used in this study

1.2.5 淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌 1628代謝產(chǎn)物對(duì)麥冬黑斑病的室內(nèi)防效測(cè)定 淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌 1628于TPM培養(yǎng)基中發(fā)酵7 d制備其代謝產(chǎn)物溶液[17-19]。菌絲生長(zhǎng)抑制測(cè)定：將淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628代謝產(chǎn)物按體積比稀釋成不同的濃度梯度（10%、1%、0.33%），用0.22 μm過(guò)濾器過(guò)濾后取2 mL加入到18 mL的PDA培養(yǎng)基中，將其混勻后倒平板。將直徑為5 mm的浙麥冬黑斑病病原菌菌餅置于PDA平板中央，28 ℃培養(yǎng)5 d，用無(wú)菌水作為陰性對(duì)照，5%多菌靈作為陽(yáng)性對(duì)照，每組3皿，試驗(yàn)重復(fù)3次。5 d后采用十字交叉法測(cè)定平板上菌落直徑，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率。菌絲生長(zhǎng)抑制率（%）=（對(duì)照菌落直徑－處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑－5）×100。

1.2.6 淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628代謝產(chǎn)物對(duì)浙麥冬黑斑病田間防效測(cè)定 試驗(yàn)用田面積約為16 m2。于2019年9月采集浙江省慈溪市麥冬種植基地的一年生健康麥冬植株，采集當(dāng)天帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行栽培。2020年5月麥冬進(jìn)入發(fā)病期，對(duì)病情進(jìn)行記錄并統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。將體積比為100%的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌（1區(qū)）1628代謝產(chǎn)物和6.25%的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628代謝產(chǎn)物（2區(qū)）作為生物防治藥劑于浙麥冬黑斑病高發(fā)期進(jìn)行田間防效測(cè)定，并用清水作為陰性對(duì)照，50%多菌靈為陽(yáng)性對(duì)照，且每塊處理田之間用陰性對(duì)照作為間隔田，以免試驗(yàn)產(chǎn)生影響。采用手動(dòng)壓力式噴霧器對(duì)整株麥冬均勻噴灑不同供試劑，噴灑量為500 kg/hm2，每個(gè)分區(qū)樣本量為30株。在7和14 d后分別調(diào)查發(fā)病情況，以每塊分區(qū)施藥前的發(fā)病情況為基礎(chǔ)，對(duì)病情指數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并校正防效。將發(fā)病情況分為4級(jí)：0級(jí)，健康苗；1級(jí)，0～25%病株；2級(jí)，26%～50%病株；3級(jí)，51%～75%病株；4級(jí)，76%～100%病株[20]。病情指數(shù)=∑（各級(jí)病株數(shù)×對(duì)應(yīng)各級(jí)代表數(shù)值）/（調(diào)查總株數(shù)×發(fā)病最高級(jí)的代表數(shù)值）×100；校正防效（%）=100×[1－（處理藥后病指×對(duì)照藥前病指）/（處理藥前病指×對(duì)照藥后病指）][21]。通將數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用t-test進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀描述

該病原菌主要侵害浙麥冬葉片，發(fā)病初期病葉表面出現(xiàn)少量棕色斑點(diǎn)，發(fā)病中期葉片上斑點(diǎn)變多并不斷擴(kuò)大，后期染病部位從初期的棕色斑點(diǎn)變成不規(guī)則的形狀，呈凹陷的紅褐色病斑擴(kuò)散至整株麥冬葉片，尖端葉片枯黃（圖1A），最終導(dǎo)致葉片枯死進(jìn)而引起整株麥冬死亡。根據(jù)發(fā)病特征將其鑒定為黑斑病[22]。

2.2 浙麥冬黑斑病病原真菌的致病性測(cè)定

對(duì)分離自浙麥冬上黑斑病的病原真菌（編號(hào)MD-1）進(jìn)行致病性測(cè)定。7 d左右觀察到初始發(fā)病癥狀與田間病原菌感染植株一致，葉片上出現(xiàn)少量棕色斑點(diǎn)，一周之后葉片上斑塊不斷擴(kuò)大呈現(xiàn)紅褐色凹陷的不規(guī)則形狀，從葉片尖端逐漸擴(kuò)散至根部（圖1B，C）。從病株葉片感染處重新采集病原組織后再次分離純化后得到的菌株與原始病原菌MD-1形態(tài)一致，說(shuō)明經(jīng)柯赫氏法則驗(yàn)證MD-1為引起浙麥冬黑斑病的病原菌。

圖1 浙麥冬黑斑病的病害特征及致病性測(cè)定Fig.1 Disease characteristics and the pathogenicity assay of black spot in O.japonicas

2.3 浙麥冬黑斑病病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

病原菌MD-1在PDA平板上呈放射狀生長(zhǎng)，初期菌絲呈現(xiàn)淺灰色，菌落逐漸向四周擴(kuò)散，平板中心呈深灰色，周圍由淺灰至白色散開(kāi)，菌絲呈棉絮狀覆蓋在表面，平板背面顏色呈現(xiàn)黑色，周圍一圈呈現(xiàn)灰白色，在28 ℃下培養(yǎng)14 d菌落直徑為7.5 cm（圖2A）。顯微鏡下單個(gè)孢子呈倒棒狀或梨形，具有3～8個(gè)橫隔，1～4個(gè)縱隔；孢子大小約為（17.0～81.0）μm×（8.0～23.5）μm，部分孢子頂部含有假喙，大小約為（0～23.5）μm×（2.5～9.0）μm（圖 2B，C）。菌絲有隔、細(xì)長(zhǎng)型（圖 2D，E），初步鑒定該病原真菌為鏈格孢菌A.alternata。

圖2 MD-1菌落與孢子形態(tài)學(xué)觀察Fig.2 The morphology of MD-1 colony and conidiospore

2.4 病原菌分子生物學(xué)鑒定

用特異性引物對(duì)病原菌MD-1進(jìn)行分子鑒定，6個(gè)基因部分序列片段的電泳圖如圖3所示。將序列在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)ITS序列與Genbank中鏈格孢菌（登錄號(hào)：MN245900.1）同源性為100%；ALT a1序列與Genbank中鏈格孢菌（登錄號(hào)：MN304714.1）同源性為100%；RPB2與Genbank中鏈格孢菌（登錄號(hào)：DQ677980.1）同源性為99.91%；TEF-1α與Genbank中鏈格孢菌（登錄號(hào)：MK637432.1）同源性為100%；ATPase序列與Genbank中鏈格孢菌（登錄號(hào)：MW541763.1）同源性為99.83%；His 3序列與Genbank中鏈格孢菌（登錄號(hào)：MK460236.1）同源性為99.77%；結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，確定該病原菌為鏈格孢菌A.alternata（圖 4），并將序列上傳至 NCBI獲得登錄號(hào) ITS（MW989987）、ALT a1（MW995953）、RPB2（MW995956）、TEF-1α（MW995955）、ATPase（MW995957）、His 3（MW995954）。

圖3 ITS、ALT a1、RPB2、TEF-1α、ATPase和His 3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析圖Fig.3 Electrophoresis of PCR amplification products of ITS, ALT a1, RPB2, TEF-1α, ATPase and His 3 sequences

圖4 基于ITS、ALT a1、RPB2、TEF-1α、ATPase和His 3序列構(gòu)建MD-1相似菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of MD-1 based on ITS、ALT a1、RPB2、TEF-1α, ATPase and His 3 sequences

2.5 淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628代謝產(chǎn)物對(duì)浙麥冬黑斑病菌抑制作用

菌絲生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)結(jié)果表明，淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌 1628代謝產(chǎn)物對(duì)浙麥冬黑斑病病原菌菌絲生長(zhǎng)具有較好的抑制作用。其中10%的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628代謝產(chǎn)物對(duì)黑斑病病原菌菌絲生長(zhǎng)抑制率高達(dá)98%。根據(jù)毒理學(xué)回歸方程可得，當(dāng)代謝產(chǎn)物濃度為0.764%時(shí)，其對(duì)菌絲的抑制效果仍達(dá)到50%（表2）。0.33%淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628代謝產(chǎn)物對(duì)浙麥冬黑斑病菌的抑制效果顯著高于5%的多菌靈。

表2 淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628代謝產(chǎn)物對(duì)浙麥冬黑斑病病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響Table 2 Effects of Streptomyces diastatochromogenes 1628 metabolites on mycelial growth of the pathogen of O.japonicus black spot

2.6 田間防效測(cè)定結(jié)果

田間防效測(cè)定結(jié)果顯示，100%的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628代謝產(chǎn)物對(duì)浙麥冬黑斑病具有較好的防治效果，7 d時(shí)校正防效可達(dá)74.08%，其防效高于50%濃度的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628代謝產(chǎn)物；且50%的1628代謝產(chǎn)物和50%的多菌靈對(duì)浙麥冬黑斑病的田間防效無(wú)顯著性差異。試驗(yàn)結(jié)果表明，7和14 d對(duì)于不同濃度的 1628代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌防治效果都較為穩(wěn)定，不同時(shí)間的防治效果在大多數(shù)情況下無(wú)顯著性差異。且14 d時(shí)多菌靈對(duì)浙麥冬黑斑病的防治效果相較于7 d時(shí)的防治效果顯著下降，由此表明，1628代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌能持續(xù)穩(wěn)定地抑制（表3）。

表3 供試殺菌劑對(duì)浙麥冬的田間防效Table 3 Control effects of fungicides on the O.japonicus

3 討論

浙麥冬是一種具有較高價(jià)值的藥食同源植物[23]，黑斑病作為浙麥冬上常見(jiàn)的病害在浙江省慈溪市麥冬種植基地發(fā)生，且其傳染速度極快，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致浙麥冬植株死亡可達(dá)總數(shù)的70%，影響浙麥冬的生長(zhǎng)和產(chǎn)出。因此，明確鑒定浙麥冬黑斑病病原菌，并且找到有效安全的防治手段成為當(dāng)前的主要任務(wù)。本文首先通過(guò)孢子與菌絲的形態(tài)初步鑒定出引起浙麥冬黑斑病的病原菌為鏈格孢屬。由于鏈格孢菌形態(tài)較為多樣復(fù)雜，在不同溫度、光照等條件下其孢子形狀大小、假喙、分隔數(shù)等也具有較大差異，給鏈格孢菌種的鑒定帶來(lái)很大困難[24]。單純使用真菌分類中的標(biāo)記序列ITS無(wú)法對(duì)浙麥冬黑斑病病原真菌進(jìn)行準(zhǔn)確的種屬鑒定。因此，利用TEF-1α、RPB2、Alt a1、His 3、ATP和ITS六個(gè)最為常見(jiàn)的鏈格孢菌特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)鏈格孢小孢子種進(jìn)行分類鑒定，從而更加準(zhǔn)確地鑒定。對(duì)序列分析后鑒定出浙麥冬黑斑病病害的病原菌為鏈格孢菌。

目前，對(duì)于浙麥冬黑斑病有效的生物防治手段相對(duì)較少，化學(xué)防治作為主要的手段，容易導(dǎo)致吡蟲(chóng)啉、啶蟲(chóng)脒、福美雙等化學(xué)農(nóng)藥濫用、病原菌產(chǎn)生抗藥性等問(wèn)題，不僅無(wú)法對(duì)病害進(jìn)行有效防治還使得浙麥冬中農(nóng)藥殘留超標(biāo)，嚴(yán)重影響人們生命健康與安全。生物防治手段通過(guò)微生物及其代謝產(chǎn)物對(duì)病害進(jìn)行防治，其毒性相對(duì)較低、對(duì)環(huán)境污染、殘留較少，在植物病害防治中具有較為廣闊的應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)中的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌 1628是一種效果較高的拮抗菌，其代謝產(chǎn)物主要包括核苷類抗生素和多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。對(duì)于鏈格孢菌、鐮刀菌等多種病原菌都具有較好的抑制作用[25]。通過(guò)菌絲生長(zhǎng)速率法與田間防效測(cè)定結(jié)果顯示，淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628代謝產(chǎn)物對(duì)浙麥冬黑斑病病原菌具有較好的抑制作用，100%的代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌菌絲的抑制率高達(dá)近100%。根據(jù)校正防效數(shù)據(jù)顯示，在14 d時(shí)100%和50%的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628的校正防效分別為65.28%和59.62%，而50%的多菌靈在14 d的校正防效為51.28%，相較于多菌靈具有較強(qiáng)持久的抑制效果。在后續(xù)田間防效試驗(yàn)結(jié)果中顯示，淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌 1628代謝產(chǎn)物相較于多菌靈對(duì)浙麥冬黑斑病的防治效果更好更穩(wěn)定。因此，淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌 1628代謝產(chǎn)物可以作為浙麥冬黑斑病較好的生物防治劑。

相關(guān)浙麥冬黑斑病病原菌的研究報(bào)道較少，本論文開(kāi)展浙麥冬黑斑病病原菌分離鑒定研究，并為后續(xù)該病害的生物防治提供依據(jù)。從而為浙江慈溪浙麥冬種植基地常發(fā)的黑斑病更有效生物防治與低殘留、優(yōu)生態(tài)提供依據(jù)，保障浙麥冬產(chǎn)量和質(zhì)量。