莫 芹，蔣 瑋，陳一帆，呂貝貝

（上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所/上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201106）

病原真菌是一類自然界無(wú)處不在的微生物，能夠引起多種農(nóng)作物的真菌病害，是影響農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)的主要危害之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前植物病原真菌和類真菌的卵菌能夠造成全球多年生作物20%的產(chǎn)量損失以及果蔬高達(dá)25%的采后損失[1,2]。另外，曲霉屬、青霉菌屬和鐮刀菌屬的真菌也會(huì)造成谷物和食品的真菌毒素污染，甚至威脅動(dòng)物和人類的健康[3]。針對(duì)病原真菌的防控策略有殺真菌農(nóng)藥的使用、抗性品種培育、栽培管理和生物防控等，目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上真菌病害的防治主要還是依賴于化學(xué)農(nóng)藥，這也帶來(lái)了生態(tài)環(huán)境安全和病害抗藥性等難題，因此開(kāi)發(fā)新的環(huán)境友好型防控策略逐漸受到研究人員的重視。

基于RNA干擾技術(shù)（RNA interference，RNAi）開(kāi)發(fā)的生物農(nóng)藥被認(rèn)為是極具潛力的新型植物保護(hù)產(chǎn)品，該技術(shù)在廣泛調(diào)節(jié)植物的基因表達(dá)和病蟲(chóng)害防治上有很大的應(yīng)用潛力[4]。RNAi技術(shù)是一種真核生物天然存在的保守的細(xì)胞免疫機(jī)制，它由雙鏈RNA（double stranded RNA，dsRNA）和小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）介導(dǎo)，能夠?qū)е耺RNA的降解和轉(zhuǎn)錄的弱化。目前，RNAi技術(shù)的應(yīng)用大多是基于重組病毒載體和轉(zhuǎn)基因植物載體兩種策略開(kāi)發(fā)的，這兩種策略分別被稱作為病毒誘導(dǎo)基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）[5]和宿主誘導(dǎo)基因沉默（host-induced gene silencing，HIGS）[6]。2017年美國(guó)孟山都公司推出HIGS開(kāi)發(fā)的轉(zhuǎn)基因玉米SmartStax Pro品種，目前已經(jīng)在美國(guó)和加拿大獲得了商業(yè)化種植的批準(zhǔn)[7]。然而，由于多國(guó)政府對(duì)轉(zhuǎn)基因作物的監(jiān)管非常嚴(yán)格，使得轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化成本較高，且部分國(guó)家消費(fèi)者對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的接受程度較低。為了提高RNAi產(chǎn)品的實(shí)用性，研究人員采用一種新的非轉(zhuǎn)基因RNAi策略開(kāi)發(fā)植物保護(hù)產(chǎn)品，即噴霧誘導(dǎo)基因沉默（spray induced gene silencing，SIGS)技術(shù)。該技術(shù)不是通過(guò)重組病毒或者轉(zhuǎn)基因植物的方式，而是通過(guò)外源施用dsRNA或siRNA的方式來(lái)控制植物內(nèi)源基因或者病原體的靶標(biāo)基因的表達(dá)[8]?；?SIGS技術(shù)開(kāi)發(fā)的新型生物農(nóng)藥具有效率高、目標(biāo)特異性強(qiáng)、對(duì)環(huán)境友好等特點(diǎn)，是植物病蟲(chóng)害防控上強(qiáng)有力的工具[9]。

目前，SIGS技術(shù)已經(jīng)被報(bào)道能夠有效防治核盤(pán)菌Sclerotinia sclerotiorum、葡萄孢菌Botrytis cinerea、禾谷鐮刀菌Fusarium graminearum等農(nóng)業(yè)上重要的病原真菌[10]。本文主要針對(duì)真菌RNAi機(jī)制、SIGS技術(shù)原理及其在真菌病害防控上的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為基于SIGS開(kāi)發(fā)防治病原真菌的新型生物農(nóng)藥提供一定的研究基礎(chǔ)。

1 SIGS技術(shù)的原理

1.1 真菌RNAi機(jī)制

RNAi機(jī)制是真核生物的一種保守機(jī)制，早在1992年粗糙脈孢菌Neurospora crassa的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一種由重復(fù)轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)的 RNAi現(xiàn)象（被稱為 quelling），但其機(jī)制的解析是在模式動(dòng)物線蟲(chóng)、果蠅等研究中完成[11]。與動(dòng)物模型相似，真菌RNAi機(jī)制首先由Dicer蛋白切割dsRNA得到大量siRNA來(lái)引發(fā)RNAi機(jī)制，這些siRNA被裝載到RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA induced silencing complex，RISC）中，使得mRNA被 Ago蛋白降解，從而沉默靶標(biāo)基因的表達(dá)。另外，在真菌中還存在由 RNA依賴型 RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）介導(dǎo)的循環(huán)機(jī)制，RdRP能夠從特定的單鏈RNA（ssRNA）或目標(biāo)mRNA產(chǎn)生dsRNA，進(jìn)一步激活或放大沉默反應(yīng)[12]，這也是RNAi技術(shù)在植物保護(hù)中應(yīng)用效率高、潛力大的原因之一。

盡管沉默機(jī)制相似，但目前研究發(fā)現(xiàn)在不同宿主中RNAi的生理功能有所不同，而且仍存在一些功能尚未被報(bào)道。真菌RNAi具有很廣泛的生物學(xué)功能，包括控制轉(zhuǎn)座子活性、參與病毒防御、調(diào)控內(nèi)源性基因、介導(dǎo)異染色質(zhì)的形成、調(diào)節(jié)毒性和抗藥性，以及適應(yīng)環(huán)境壓力條件等[13]。根據(jù)生理功能的需要，目前在真菌中主要發(fā)現(xiàn)兩種RNAi途徑：一種為經(jīng)典的依賴Dicer的RNAi途徑，在絲狀真菌粗糙脈孢菌N.crassa和裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe等模式系統(tǒng)中已有大量研究[14]；另一種為在卷枝毛霉Mucor circinelloides中發(fā)現(xiàn)的非經(jīng)典 RNAi 途徑（Non-Canonical RNAi Pathway，NCRIP），該途徑依賴于RdRP和新型核糖核酸酶Ⅲ類似物R3B2，主要在調(diào)節(jié)毒力和轉(zhuǎn)座子遷移方面發(fā)揮重要作用[15]。

完整的RNAi機(jī)制是SIGS成功控制病原真菌的前提，大多數(shù)真菌都具有RNAi機(jī)制的重要組分，包括Dicer蛋白、Ago蛋白和RdRP。然而，在進(jìn)化過(guò)程中有些真菌也丟失了RNAi機(jī)制中的一些關(guān)鍵組分，例如釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae基因組丟失了Ago1和Dcr1蛋白編碼基因[16]；玉米黑粉菌Ustilago maydis基因組丟失了Ago1、RdRP1-3和Dcr1蛋白編碼基因[17]；以及真菌類隱球菌Crytpococcus deuterogatti基因組分別丟失了Ago1、Ago2、Dcr1和RdRp1蛋白編碼基因[18]。RNAi機(jī)制在真菌進(jìn)化過(guò)程中起著非常重要的作用。有學(xué)者認(rèn)為在進(jìn)化過(guò)程中RNAi機(jī)制可能對(duì)一些真菌的生存不利，它們?cè)趤G失RNAi機(jī)制重要組分的同時(shí)可能進(jìn)化出比RNAi更有利生存的其他防御機(jī)制[18]。

1.2 SIGS原理

隨著RNAi機(jī)制的逐步研究，以及HIGS和VIGS技術(shù)在植物害蟲(chóng)、線蟲(chóng)、病毒、真菌等病蟲(chóng)害防控上的成功應(yīng)用，該技術(shù)也逐漸被科學(xué)家認(rèn)可為一種非常有潛力的新型植物保護(hù)技術(shù)[19]。2016年，加州大學(xué)的Wang和Jin[20]研究發(fā)現(xiàn)在植物表面噴灑靶向病原體關(guān)鍵基因的dsRNAs或siRNAs可以有效地保護(hù)作物免受病原菌的侵害，他們將這種策略稱之為SIGS技術(shù)。SIGS技術(shù)是通過(guò)非轉(zhuǎn)基因方式將dsRNA傳遞到植物和病原菌中的，是RNAi技術(shù)在植物保護(hù)領(lǐng)域，繼VIGS和HIGS策略之后的應(yīng)用補(bǔ)充。該技術(shù)的原理為：將以病原體關(guān)鍵基因?yàn)榘袠?biāo)的dsRNA和/或siRNA噴灑到植物表面，再通過(guò)兩種可能的途徑來(lái)沉默病原體關(guān)鍵基因。第一種途徑是真菌病原體直接攝取RNA分子進(jìn)而誘導(dǎo)真菌的RNAi。另一種途徑為宿主植物首先攝取RNA分子, dsRNA被植物DCL蛋白切割成siRNA。未剪切的dsRNA和siRNA在真菌侵染過(guò)程中被轉(zhuǎn)移到真菌細(xì)胞中，從而誘導(dǎo)真菌的RNAi。兩種情況最后均能降解真菌病原體的mRNA以抵消病原體的毒性或?qū)е虏≡w死亡（圖 1）。一般地，要實(shí)現(xiàn) SIGS技術(shù)進(jìn)行真菌病害防控的目的需要具備兩個(gè)基本條件：一是病原真菌能夠從環(huán)境或寄主中攝取dsRNA，該現(xiàn)象被稱為環(huán)境RNAi（environmental RNAi，eRNAi）或跨界RNAi（cross-kingdom RNAi，cRNAi）；二是病原真菌具有完整的RNAi機(jī)制，使得攝取的dsRNA能夠沉默關(guān)鍵基因的表達(dá)。

圖1 噴霧誘導(dǎo)基因沉默（SIGS）技術(shù)保護(hù)作物對(duì)抗真菌病原體Fig.1 Spray-induced gene silencing (SIGS) for crop protection against fungal pathogens

1.3 真菌環(huán)境RNAi、系統(tǒng)性RNAi和跨界RNAi機(jī)制

自1986年Fire和Mello在模式動(dòng)物秀麗隱桿線蟲(chóng)Caenorhabditis elegans的研究中提出RNAi的概念[21]，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)線蟲(chóng)也能夠通過(guò)取食和浸泡獲得環(huán)境中的dsRNA，并且誘發(fā)細(xì)胞RNAi，他們將這種因環(huán)境中的dsRNA而誘發(fā)的序列特異基因沉默稱之為eRNAi；而RNAi效應(yīng)能夠擴(kuò)散到起初沒(méi)有接觸到dsRNA的細(xì)胞和組織中的現(xiàn)象也被稱為系統(tǒng)性RNAi（systemic RNAi，sRNAi）[22]。eRNAi和sRNAi是大多數(shù)動(dòng)植物的普遍現(xiàn)象，與模式線蟲(chóng)和擬南芥相比，真菌的eRNAi和sRNAi機(jī)制目前研究仍然較少[23]?；蚪M測(cè)序分析等工具研究發(fā)現(xiàn)真菌基因組中沒(méi)有編碼SID蛋白（一種與線蟲(chóng)dsRNA攝取相關(guān)的關(guān)鍵蛋白）的同源基因，因此真菌很可能依賴于胞吞作用來(lái)促進(jìn)dsRNA的攝取[24,25]。2016年Wang等[26]研究發(fā)現(xiàn)葡萄孢菌B.cinerea能夠吸收熒光標(biāo)記的dsRNA，這是真菌eRNAi的首次報(bào)道，但他們沒(méi)有解析其吸收機(jī)理。Wytinck等[27]利用活細(xì)胞成像、轉(zhuǎn)基因真菌培養(yǎng)和內(nèi)吞抑制劑添加等方式確定了真菌菌核病菌S.sclerotiorum的攝取機(jī)制是通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用發(fā)生的。雖然沒(méi)有識(shí)別dsRNA的受體蛋白，但通過(guò)RNAi介導(dǎo)的敲除試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，一些網(wǎng)格蛋白、膜結(jié)合蛋白、以及促進(jìn)內(nèi)源性囊泡形成和真菌出芽過(guò)程中的蛋白參與了 dsRNA的攝取和加工。此外，胞吞作用對(duì)絲狀真菌的生長(zhǎng)繁殖和致病性均有重要作用，一些病原真菌可能通過(guò)調(diào)節(jié)受體的內(nèi)吞作用從而影響其對(duì)植物的致病性[27]。

即使真菌細(xì)胞具有完整的RNAi組分，eRNAi或sRNAi功能的缺失也會(huì)影響SIGS的基因沉默效果，如葉枯病菌Zymoseptoria tritici也具有完整的RNAi核心組分，但仍對(duì)dsRNA不敏感[28]；質(zhì)粒介導(dǎo)的dsRNA不能引發(fā)白根腐菌Rosellinia necatrix的sRNAi從而不能利用SIGS技術(shù)達(dá)到很好的根腐病防治效果[29]。真菌對(duì)dsRNA的吸收能力是SIGS防控成功與否的關(guān)鍵，不同種屬的病原真菌對(duì)dsRNA的吸收能力不同，最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，植物病原真菌灰霉病菌B.cinerea、菌核病菌S.sclerotiorum、番茄絲核病菌Rhizoctonia solani、黑曲霉Aspergillus niger和大麗輪枝病菌Verticillium dahliae能夠有效吸收 dsRNA，但炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides不能吸收，而在一種有益真菌綠木霉Trichoderma virens中吸收較弱。局部利用靶向致病菌毒力相關(guān)基因的dsRNA進(jìn)行的SIGS試驗(yàn)結(jié)果表明，SIGS的成功與否很大程度上取決于病原體對(duì)RNA的吸收效率[10]。

植物葉片主要通過(guò)氣孔和表面?zhèn)谖誨sRNA，但葉片表面存在阻礙吸收的疏水性角質(zhì)層和核酸降解酶，因此植物葉片對(duì)dsRNA分子的吸收是極其微量的，這也給SIGS技術(shù)在植物保護(hù)領(lǐng)域的應(yīng)用帶來(lái)了很大的挑戰(zhàn)[30]，病原真菌在侵染植物時(shí)造成的傷口可能會(huì)輔助植物對(duì) RNA的吸收。植物細(xì)胞能夠通過(guò)其RNAi機(jī)制將吸收長(zhǎng)鏈的dsRNA加工為21-24 nt的siRNA，并且利用胞間連絲和韌皮部使其在細(xì)胞之間進(jìn)行長(zhǎng)距離運(yùn)輸[31]。另外，大量試驗(yàn)證明，植物與真菌之間也存在雙向RNA分子的傳遞現(xiàn)象，這種在不同物種間傳遞的基因沉默被稱為 cRNAi[32-34]。病原真菌在進(jìn)化過(guò)程中產(chǎn)生了類似于效應(yīng)子功能的小 RNA，跨界進(jìn)入寄主植物調(diào)控植物的防衛(wèi)反應(yīng)，從而幫助病菌侵染和定殖，增加致病性。例如灰霉病菌可以產(chǎn)生多種小RNA（Bc-siR3.1、Bc-siR3.2、Bc-siR5和Bc-siR37）來(lái)抑制宿主植物的免疫相關(guān)基因[35]；小麥條銹菌能產(chǎn)生Pst-milR1通過(guò)cRNAi的方式靶定到寄主小麥的重要抗病基因病程相關(guān)蛋白2（pathogenesis related proteins 2，PR2）[36]。對(duì)應(yīng)地，轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的dsRNA或siRNA也能進(jìn)入真菌影響真菌生長(zhǎng)和致病力，起到保護(hù)植物的作用。目前以HIGS技術(shù)獲得的轉(zhuǎn)基因株系能夠有效保護(hù)植物防控多種病原真菌和卵菌，如小麥白粉病菌Blumeria graminis[37]、小麥葉銹菌Puccinia triticinia[38]、鐮刀菌屬Fusariumspp.[39]、致病疫霉Phytophthora infestans[40]、辣椒疫霉Phytophthora capsici[41]等?？梢哉f(shuō)cRNAi是HIGS技術(shù)在真菌病害防控研究的主要理論依據(jù)。但對(duì)于SIGS技術(shù)來(lái)說(shuō)，真菌通過(guò)cRNAi方式攝取靶標(biāo)dsRNA或siRNA需要依賴植物對(duì)外源dsRNA的吸收效率和RdRP介導(dǎo)的沉默信號(hào)放大效應(yīng)，只有積累足夠的siRNA形成系統(tǒng)性，再被真菌攝取后才能有效控制病原。而且，在這個(gè)過(guò)程中 dsRNA也隨時(shí)會(huì)被細(xì)胞內(nèi)外的核酸酶降解。

2 SIGS技術(shù)在植物真菌病害防治中的研究進(jìn)展

目前，SIGS技術(shù)對(duì)真菌病害的防治研究對(duì)象主要有引起枯萎病的鐮刀菌屬、引起作物和采后果蔬花卉灰霉病的葡萄孢菌、引起莖腐病的菌核病菌、以及一些其他重要病原真菌，詳見(jiàn)表1。早在2013年Francis等[42]就測(cè)定了體外合成 dsRNA對(duì)兩種主要病原真菌—尖孢鐮刀菌F.oxysporum和黑條葉斑病菌Mycosphaerella fijiensis孢子萌發(fā)的影響，篩選獲得了有效抑制香蕉黑斑病和枯萎病的潛在靶點(diǎn)，但當(dāng)時(shí)篩選到的靶點(diǎn)仍然以HIGS技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因香蕉株系進(jìn)行抗病能力測(cè)試。直到2016年SIGS才被證明是一種防控谷物致病菌禾谷鐮刀菌的有效方法。Koch等[43]將同時(shí)靶向 3個(gè)麥角甾醇生物合成基因（CYP51A、CYP51B和CYP51C）的dsRNA噴施到大麥葉片后可以有效地降低3個(gè)靶標(biāo)mRNA的合成，并顯著降低鐮刀菌在寄主植物上的生長(zhǎng)。隨后該團(tuán)隊(duì)利用生物信息學(xué)工具優(yōu)化了 dsRNA靶標(biāo)的設(shè)計(jì)來(lái)提高其沉默效率，從而進(jìn)一步提高SIGS的抗病效率[44]。2020年，Koch團(tuán)隊(duì)比較了人工設(shè)計(jì)和計(jì)算機(jī)工具設(shè)計(jì)的dsRNA的沉默效率，他們發(fā)現(xiàn)靶向真菌RNAi機(jī)制的關(guān)鍵組分（Ago和Dicer蛋白）可以保護(hù)大麥葉片免受禾谷鐮刀菌感染，而且試驗(yàn)證明基于人工設(shè)計(jì)的 dsRNA具有更高的基因沉默效率。此外，靶向生長(zhǎng)關(guān)鍵蛋白（微管蛋白和肌球蛋白）的dsRNA能夠抑制禾谷鐮刀菌的生長(zhǎng)，減輕中國(guó)南方小麥赤霉病的病害程度[45]。最近的一項(xiàng)研究表明靶向尖孢鐮刀菌生長(zhǎng)關(guān)鍵因子（CYP51、Chs1和EF2）的dsRNA以葉面噴霧、葉柄吸附和蘸根方式均能顯著控制病原毒性[46]。

表1 SIGS技術(shù)在真菌病害防治中的研究進(jìn)展Table 1 Research progress on SIGS in the control of fungal pathogens

第二個(gè) SIGS主要研究對(duì)象是引起水果、蔬菜和花卉采前/后灰霉病的葡萄孢菌。Wang等[26]研究發(fā)現(xiàn)在水果、蔬菜和花卉表面噴施靶向DCL1和DCL2的dsRNA能夠有效抑制病原毒性，與對(duì)照相比，接種到水果和蔬菜表面的病灶大小顯著降低。Austein等[47]利用 RNA測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)分析來(lái)指導(dǎo)dsRNA靶標(biāo)的設(shè)計(jì)，并獲得了有效防治葡萄孢菌侵害的多個(gè)有效靶標(biāo)。在dsRNA傳遞方式的改良上，Nerva等[48]證明以高壓噴涂葉片和莖吸收的方式比普通葉片噴施方式對(duì)葡萄灰霉病的防治效果更好。

此外，SIGS技術(shù)在其他重要病原防治上也有大量報(bào)道，例如靶向囊泡運(yùn)輸途徑相關(guān)基因（VPS51+DCTN1+SAC1）的dsRNA能夠有效降低多種病原真菌的病害程度，包括黑曲霉A.niger、絲核病菌R.solani、大麗輪枝病菌V.dahliae等[10]；體外施用靶向幾丁質(zhì)酶編碼基因的siRNA能夠抑制菜豆殼球孢菌Macrophomina phaseolina的菌絲生長(zhǎng)[49]；體外合成靶向致病疫霉P.infestans的dsRNA分子能夠有效防治馬鈴薯晚疫病[50]；向大豆葉面直接噴施靶向乙酰輔酶A酰基轉(zhuǎn)移酶、甘氨酸裂解系統(tǒng)H蛋白和核糖體S16蛋白的dsRNA均能夠減少大豆銹菌Phakopsora pachyrhizi的銹斑數(shù)量和病菌量，進(jìn)而有效防控大豆銹病的發(fā)生[53]。以上這些試驗(yàn)成功案例表明SIGS技術(shù)可以為開(kāi)發(fā)一種保護(hù)植物免受真菌病害的新工具。

3 SIGS技術(shù)的潛力與挑戰(zhàn)

RNAi技術(shù)在真菌病害防治中的研究多以HIGS技術(shù)進(jìn)行，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)HIGS技術(shù)能夠?yàn)闊煵?、棉花、香蕉、大麥和小麥等多種作物提供了有效的保護(hù)[54]。雖然HIGS技術(shù)可以為這些植物提供系統(tǒng)水平的抗性，但大多數(shù)作物品種缺乏成熟的轉(zhuǎn)化方法，以及公眾對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的接受度可能會(huì)限制其在商業(yè)作物中的應(yīng)用。SIGS技術(shù)采用一種更通用的dsRNA傳遞策略，可以應(yīng)用于任何植物，以該技術(shù)開(kāi)發(fā)的新型核酸農(nóng)藥也是替代傳統(tǒng)農(nóng)藥的可行性方案之一。就防治效率來(lái)說(shuō)，HIGS和SIGS因不同的dsRNA設(shè)計(jì)和不同的目標(biāo)病原可能各有優(yōu)劣。研究證明，在實(shí)驗(yàn)室條件下長(zhǎng)度為200～500 nt的dsRNA-CYP51以SIGS技術(shù)防治禾谷鐮刀菌的效率比 HIGS高 30%左右，而隨著其長(zhǎng)度的進(jìn)一步增加，兩者的防控效率差異趨平[44]。Hu等[53]研究發(fā)現(xiàn)HIGS和SIGS均能有效防控大豆銹病的發(fā)生。

SIGS作為綠色防控技術(shù)在農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展方面具有很大的優(yōu)勢(shì)，與化學(xué)農(nóng)藥相比，具有環(huán)境殘留少、抗藥性發(fā)生率低等優(yōu)點(diǎn)。目前，國(guó)內(nèi)外基于SIGS的RNA生物農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)仍處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，仍然面臨很多挑戰(zhàn)。首先，真菌SIGS機(jī)制尚未完全清晰闡明。不同病原真菌的RNAi機(jī)制和dsRNA攝取機(jī)制存在進(jìn)化上的差異，且 dsRNA進(jìn)入植物細(xì)胞產(chǎn)生表觀遺傳效應(yīng)也需要進(jìn)一步研究，因此分子靶標(biāo)的設(shè)計(jì)需要進(jìn)一步通過(guò)生物信息學(xué)和遺傳學(xué)工具的輔助，例如小RNA測(cè)序技術(shù)可能是解析真菌發(fā)病和SIGS機(jī)制與過(guò)程的有效工具，能夠幫助設(shè)計(jì)有效防控病原真菌的分子靶標(biāo)。其次，dsRNA的合成成本和遞送效率可能是限制其商業(yè)化應(yīng)用的主要原因。目前用于真菌防控研究的dsRNA分子多以酶合成（MEGA script?RNAi kit）的方法進(jìn)行制備，但該方法價(jià)格高昂不適合田間大規(guī)模應(yīng)用。利用微生物工程菌合成的方法可能是降低dsRNA制備成本的可行性方案，目前大腸桿菌Escherichia coli、釀酒酵母S.cerevisiae和芽胞桿菌Bacillusspp.等多種工程菌被用來(lái)大規(guī)模合成dsRNA分子，而dsRNA的成本也從2008年的約1.2萬(wàn)美元/g，降至2020年的0.5美元/g[55]。此外，dsRNA的遞送技術(shù)也在不斷更新，高壓噴施、莖稈注射、蘸根等方式被證明能提高dsRNA遞送效率[56,57]，通過(guò)納米材料包埋等方式也能將dsRNA的防治效果延長(zhǎng)到30 d左右[58]，但這些方式和材料在開(kāi)發(fā)時(shí)也需要考慮成本和可操作性的問(wèn)題。最后，SIGS技術(shù)從實(shí)驗(yàn)室進(jìn)入到田間應(yīng)用也需要提高脫靶預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性和可控性，以便進(jìn)行充分的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。盡管該技術(shù)具有較高的序列特異性，但長(zhǎng)dsRNA產(chǎn)生的siRNA仍然有脫靶結(jié)合的風(fēng)險(xiǎn)。目前在美國(guó)和歐盟的農(nóng)藥和植物保護(hù)產(chǎn)品監(jiān)管框架中，還沒(méi)有針對(duì)RNA噴劑相關(guān)植物保護(hù)產(chǎn)品的具體數(shù)據(jù)要求[59]。而歐洲食品安全局（EFSA）的一項(xiàng)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估也將RNA生物農(nóng)藥分類為安全的，其評(píng)價(jià)依據(jù)為可噴灑的RNA對(duì)動(dòng)物/人類構(gòu)成的風(fēng)險(xiǎn)很低[60]。Koch等[61]認(rèn)為RNA生物農(nóng)藥（如孟山都和拜耳公司的BioDirectTM技術(shù)）進(jìn)入市場(chǎng)只是時(shí)間問(wèn)題，因此我國(guó)的RNA生物農(nóng)藥的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估也需要加強(qiáng)，以促進(jìn)其未來(lái)的市場(chǎng)定位，同時(shí)也需要盡早開(kāi)展教育工作和宣傳活動(dòng)，促進(jìn)公眾對(duì)該技術(shù)和產(chǎn)品的認(rèn)識(shí)和理解。