葉春苗，李莉峰，韓艷秋

（1.遼陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，遼寧 遼陽 111000；2.遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，遼寧 沈陽 111100）

紫菜屬于紅藻門，紅毛菜科，是我國沿海的重要養(yǎng)殖紅藻。紫菜中含有豐富的營養(yǎng)成分，如蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪、維生素等。除此之外還含有豐富的活性成分，如紫菜多糖、海膽蛋白、活性肽等。紫菜多糖是一種酸性多糖，含有較多的硫酸酯。國內(nèi)外研究表明，紫菜多糖具有很好的保健功效，是一種重要的生物活性物質(zhì)?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)，紫菜多糖具有抗衰老、抗腫瘤、抗凝血和預(yù)防潰瘍等多重生物活性功能。研究水提法紫菜多糖，以期獲得提取率高、品質(zhì)好的紫菜多糖。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

普通紫菜，市售；苯酚、濃硫酸、磷酸二氫鈉、氯仿、95%乙醇（均為分析純），天津市大茂化學(xué)試劑廠提供；三氯化鐵（分析純），沈陽市東興試劑廠提供。

1.2 主要儀器

UV752型紫外可見分光光度計(jì)，上海佑科儀器儀表有限公司產(chǎn)品；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司產(chǎn)品；DZF-6050型真空干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；ESJ110-4B型精密天平，沈陽龍騰電子有限公司產(chǎn)品；SK8200HP型離心機(jī)，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 多糖測定

采用苯酚-硫酸法[1]。

1.3.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精確量取0，1，3，5，7，9，11，13 mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，于100 mL容量瓶中加水搖勻，取1.0 mL稀釋液，添加1.0 mL的苯酚溶液，迅速加入5.0 mL的濃硫酸，搖勻后靜置5 min，再放入100℃水浴鍋中水浴15 min，然后取出迅速冷卻至室溫，于波長490 nm處測定吸光度[2]。線性回歸方程為A=4.957C-0.028，R2=0.996。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.3 紫菜多糖含量的測定[3]

紫菜中多糖的含量計(jì)算如下：

式中：f——換算因子，0.9；

C——待測樣品溶液的葡萄糖質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——測定液總量，mL；

D——樣品溶液稀釋倍數(shù)；

W——樣品質(zhì)量，g。

1.3.4 脫蛋白質(zhì)的方法[4]

采用Sevag法去除雜蛋白。具體方法為將離心后的上層清液與有機(jī)溶劑（體積比氯仿∶正丁醇=5∶1）混合，比例是5∶1，20 min劇烈振蕩，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心10 min，去除變性蛋白，重復(fù)操作2～5次，并對脫蛋白效果進(jìn)行分析比較。

1.3.5 水提法的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)[5]

（1）提取時(shí)間對紫菜多糖提取率的影響。試驗(yàn)在粉碎程度為80目，提取溫度為100℃，料液比為1∶40的條件下，設(shè)計(jì)2，3，4，5，6 h這5個(gè)水平，研究不同的提取時(shí)間對紫菜多糖提取率的影響。

（2）提取溫度對紫菜多糖提取率的影響。根據(jù)資料顯示提取溫度對紫菜多糖的提取有較大影響，因此試驗(yàn)在粉碎程度為80目，提取時(shí)間為5 h，料液比為1∶40的條件下，研究提取溫度為60，70，80，90，100℃這5個(gè)水平時(shí)紫菜多糖提取率的差異性。

（3）料液比對紫菜多糖提取率的影響。為了研究料液比對紫菜多糖提取的影響，試驗(yàn)固定粉碎程度為80目，提取時(shí)間為5 h，提取溫度為100℃，考查料液比為1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60對紫菜多糖提取率的影響。

（4）目數(shù)對紫菜多糖提取率的影響。紫菜的粉碎程度對其成分的提取有一定的影響，因此試驗(yàn)固定提取溫度為100℃，料液比為1∶40，提取時(shí)間為5 h的條件下，設(shè)計(jì)粉碎程度為40，60，80，100目這4個(gè)水平，分析不同的粉碎程度對紫菜多糖提取率的影響。

1.3.6 正交試驗(yàn)因素水平

以多糖的提取得率為考核指標(biāo)，選用L9（34）進(jìn)行正交試驗(yàn)。

正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 脫蛋白次數(shù)的確定

去蛋白次數(shù)對多糖提取率的影響見圖2。

圖2 去蛋白次數(shù)對多糖提取率的影響

由圖2可知，隨著脫蛋白次數(shù)的增加，紫菜多糖的提取率逐漸減少，到最后幾乎不變。第3次脫蛋白質(zhì)之前提取率減少較快，第3次之后減少不明顯，考慮到脫蛋白次數(shù)較多，耗時(shí)、耗電、耗材料，為了節(jié)約能源和試劑，故選脫3次蛋白為最佳。

2.2 提取時(shí)間對紫菜多糖提取率的影響

提取時(shí)間對多糖提取率的影響見圖3。

圖3 提取時(shí)間對多糖提取率的影響

由圖3可知，隨著提取時(shí)間的延長，紫菜多糖的提取率增加，這是一個(gè)多糖組分不斷溶解并擴(kuò)散到提取液中的過程。開始時(shí)，提取溶劑中的多糖含量較低，而原料組織中的多糖含量最大。隨著提取時(shí)間的延長，提取溶劑中的多糖含量逐漸增加。同時(shí)，原料組織中的多糖含量逐漸降低，多糖物質(zhì)的濃度梯度繼續(xù)降低。因此，多糖的含量先增加，再趨于穩(wěn)定。綜合考慮，水浴法提取紫菜多糖的最佳時(shí)間為3 h。

2.3 提取溫度對紫菜多糖提取率的影響

提取溫度對多糖提取率的影響見圖4。

圖4 提取溫度對多糖提取率的影響

由圖4可知，多糖的提取率隨著提取溫度的升高而增加，表明溫度的升高有利于多糖的浸出。這是因?yàn)闇囟鹊纳哂欣谔岣叨嗵欠肿拥膫髻|(zhì)速率，增加多糖在水中的溶解度。因此，水浴萃取的最佳提取溫度為100℃。常規(guī)水浴加熱，溫度的變化范圍大概為5℃，如果溫度范圍選擇的較窄，則對測定的結(jié)果影響較大，從而選定提取溫度的變化范圍為10℃。

2.4 料液比對紫菜多糖提取率的影響

料液比對多糖提取率的影響見圖5。

圖5 料液比對多糖提取率的影響

由圖5可知，隨著溶劑量的增大，多糖的提取率也相應(yīng)提高，但是當(dāng)料液比大于1∶50后，多糖的提取率增加緩慢，到最后幾乎不變。這是因?yàn)槿軇┝看?，溶液中多糖濃度低，有利于多糖的傳質(zhì)，當(dāng)溶劑量大于一定程度后，對紫菜多糖提取率的影響變小，多糖的提取率基本不變。當(dāng)料液比過大時(shí)，后續(xù)濃縮步驟耗能增多，時(shí)間增加。故最佳的料液比為1∶50，選擇料液比1∶45，1∶50，1∶55這3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.5 目數(shù)對紫菜多糖提取率的影響

目數(shù)對多糖提取率的影響見圖6。

圖6 目數(shù)對多糖提取率的影響

由圖6可知，在一定范圍內(nèi)，粉碎程度的加大，紫菜多糖的提取率逐漸增加。在60～80目紫菜多糖的提取率增加的幅度較大，但是當(dāng)目數(shù)大于80目以后，提取率反而降低，這可能是因?yàn)殡S著粉碎程度越細(xì)，溶液的黏度也逐漸增加，當(dāng)黏度達(dá)到一定程度后，不利于紫菜多糖的提取，從而導(dǎo)致紫菜多糖提取率先增加后下降。因此，試驗(yàn)選擇最佳粉碎程度為80目。

2.6 正交試驗(yàn)結(jié)果

（1）正交試驗(yàn)結(jié)果。

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

由表2可知，R值代表了對紫菜粗多糖提取的影響程度。RA為4.616 7，RB為5.524 4，RC為5.122 2，RD為5.295 6。由此可以判斷，影響粗多糖產(chǎn)率的因素依次為B＞D＞C＞A，即提取溫度＞目數(shù)＞料液比＞提取時(shí)間。根據(jù)K值的大小，確定最優(yōu)水平為A3B3C3D1，即提取溫度100℃，提取時(shí)間3 h，料液比1∶55，目數(shù)60目。

（2）方差分析。

方差分析見表3。

表3 方差分析

由表3的方差分析可知，F(xiàn)0.05（2，2）＜FA=78.984 8＜F0.01（2，2），F(xiàn)B=112.768 5＞F0.01（2，2），F(xiàn)C=105.516 1＞F0.01（2，2），F(xiàn)D=120.723 0＞F0.01（2，2），表明提取時(shí)間對多糖的提取有顯著影響，用“*”表示。而提取溫度、料液比、目數(shù)對紫菜多糖的提取有極顯著的影響，用“**”表示。

2.7 驗(yàn)證性試驗(yàn)

稱量20 g粉碎紫菜粉，并根據(jù)優(yōu)化的工藝條件置于錐形燒瓶中進(jìn)行放大試驗(yàn)。按料液比1∶55加入蒸餾水，提取溫度100℃，提取時(shí)間3.5 h，計(jì)算紫菜多糖的提取率。結(jié)果表明，多糖的平均提取率為33.65%（正交試驗(yàn)的最大得率為33.48%）。結(jié)果與正交試驗(yàn)結(jié)果基本一致，表明正交試驗(yàn)的優(yōu)化工藝條件易于放大，方法性能良好。采用Sevag法去除上清液，然后進(jìn)行離心和透析，多糖提取率為23.2%。濃縮、真空干燥和粉碎后，獲得淡黃色粉末。

紫菜多糖見圖7。

圖7 紫菜多糖

3 結(jié)論

紫菜含有豐富的活性成分，紫菜多糖就是其中之一。以紫菜為原料，采用水浸提法提取紫菜多糖，結(jié)果表明，提取時(shí)間3 h，提取溫度100℃，料液比1∶55，粉碎程度60目時(shí)紫菜多糖提取率最高，并通過試驗(yàn)驗(yàn)證紫菜的提取率為33.65%，高于正交試驗(yàn)最優(yōu)提取率33.48%。紫菜多糖的研究還需在深加工利用方面進(jìn)一步深入研究，以提升紫菜的附加值。