趙 靜 楊洪濤 裴存文

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤是兒童中最常見的原發(fā)性眼內(nèi)惡性腫瘤[1]。據(jù)統(tǒng)計，在美國視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤患者生存率可達到95%，但在有些不發(fā)達國家其生存率仍低于5%[2]。吳茱萸堿是一種喹諾酮生物堿，已被用于治療消化系統(tǒng)疾病[3]。據(jù)報道，吳茱萸堿可抑制SW480結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和遷移，并可促進細(xì)胞凋亡且阻滯細(xì)胞周期[4]。吳茱萸堿能抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞、小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞和H1688細(xì)胞增殖，加速其凋亡，并阻滯肝癌HepG2細(xì)胞、H446細(xì)胞和H1688細(xì)胞周期[5-7]。然而，吳茱萸堿對視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的作用目前并不清楚。長鏈非編碼RNA(lncRNA)與腫瘤發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切，可參與腫瘤組織血管生成、增殖、免疫調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)移等過程[8]。整合素β2-反義RNA1(ITGB2-AS1)位于21q22.3染色體上，在乳腺癌組織中高表達，可上調(diào)ITGB2-AS1表達，促進乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲[9-10]。本研究探討吳茱萸堿對視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響，分析ITGB2-AS1在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中的表達和作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和主要儀器細(xì)胞HXO-Rb44購自美國ATCC公司，吳茱萸堿(純度≥98%)購自美國Sigma-Aldrich公司，RMPI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、Lipofectamine 2000購自美國Thermo Fisher Scientific公司，si-NC、si-ITGB2-AS1、pcDNA、pcDNA-ITGB2-AS1購自上海GenePharma公司，Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，SYBR-Green PCR Master Mix試劑盒購自大連TaKaRa公司，溴化噻唑藍四氮唑(MTT)、結(jié)晶紫染料、膜聯(lián)蛋白-V(Annexin-V)-FITC凋亡檢測試劑盒、細(xì)胞周期檢測試劑盒、碘化丙啶(PI)購自上海Beyotime公司。Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀、Applied Biosystems PCR熱循環(huán)儀購自美國Thermo Fisher公司，F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組取吳茱萸堿以0.2 mol·L-1的濃度溶于二甲基亞砜中，制成儲備液，用培養(yǎng)基進一步稀釋，最終的二甲基亞砜含量不超過體積分?jǐn)?shù)0.1%。

將HXO-Rb44細(xì)胞置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱，用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RMPI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。取對數(shù)生長期HXO-Rb44細(xì)胞鋪在96孔板上(每孔5×103個細(xì)胞)，用終濃度為1 μmol·L-1、2 μmol·L-1、4 μmol·L-1吳茱萸堿處理細(xì)胞24 h(吳茱萸堿濃度選擇參照參考文獻[5])，記為吳茱萸堿1 μmol·L-1組、吳茱萸堿2 μmol·L-1組、吳茱萸堿4 μmol·L-1組，同時將不經(jīng)吳茱萸堿處理的細(xì)胞設(shè)為對照組；按照Lipofectamine 2000試劑盒說明書將si-NC、si-ITGB2-AS1轉(zhuǎn)染細(xì)胞，記為si-NC組、si-ITGB2-AS1組；將pcDNA、pcDNA-ITGB2-AS1轉(zhuǎn)染細(xì)胞，再用4 μmol·L-1吳茱萸堿處理，記為吳茱萸堿4 μmol·L-1+pcDNA組、吳茱萸堿4 μmol·L-1+pcDNA-ITGB2-AS1組。

1.2.2 采用MTT法測定細(xì)胞存活率各組HXO-Rb44細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，加20 μL MTT(0.5 g·L-1)，并在37 ℃下孵育4 h，棄去上清液，加入二甲基亞砜(每孔100 μL)。最后，在酶標(biāo)儀上于490 nm波長處測量光密度(D490)，計算細(xì)胞存活率。

1.2.3 平板克隆實驗計數(shù)克隆形成數(shù)將各組HXO-Rb44細(xì)胞鋪在6孔板中(每孔500個細(xì)胞)，并在37 ℃的培養(yǎng)基中孵育。兩周后，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌兩次，在甲醇中固定30 min，結(jié)晶紫染料染色，隨后用PBS洗去過量的結(jié)晶紫后計數(shù)克隆形成數(shù)。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡情況取各組HXO-Rb44細(xì)胞，用冷PBS洗滌3次，在4 ℃用體積分?jǐn)?shù)70%冷乙醇固定過夜；用PBS洗滌后，加入PI和RNaseA在室溫下孵育細(xì)胞30 min。細(xì)胞周期分布通過FACSCalibur流式細(xì)胞儀測量。取各組HXO-Rb44細(xì)胞，用冷PBS洗滌2次。隨后將細(xì)胞重懸于100 μL流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合緩沖液中，并用Annexin-V-FITC/PI試劑染色。通過FACSCalibur流式細(xì)胞儀分析凋亡細(xì)胞情況。

1.2.5 qRT-PCR檢測ITGB2-AS1表達使用Trizol試劑分離總RNA，將1.0 μg RNA通過逆轉(zhuǎn)錄酶PCR合成cDNA，采用qRT-PCR檢測cDNA。在94 ℃下預(yù)變性30 s后，按以下方式循環(huán)反應(yīng)40次。在94 ℃下變性10 s，59 ℃下退火20 s，72 ℃下延伸20 s。用β-actin作為內(nèi)源對照，引物序列(5’至3’)：ITGB2-AS1正向引物為AGGAGATGGAACGAGGAAA，反向引物為TTAGTGGTCTGCGAAGGTG；β-actin正向引物為CCACGAAACTACCTTCAACTCC，反向引物為 GTGATCTCCTTCTGCATCCTGT。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析每個實驗獨立重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗。檢驗水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組HXO-Rb44細(xì)胞存活率和克隆形成數(shù)吳茱萸堿1 μmol·L-1組與對照組細(xì)胞存活率和克隆形成數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)；吳茱萸堿2 μmol·L-1組、吳茱萸堿4 μmol·L-1組細(xì)胞存活率和克隆形成數(shù)較對照組、吳茱萸堿1 μmol·L-1組減小，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)；吳茱萸堿4 μmol·L-1組細(xì)胞存活率和克隆形成數(shù)較吳茱萸堿2 μmol·L-1組減小，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)(圖1)。

圖1 各組細(xì)胞存活率和克隆形成數(shù) A、B、C、D分別代表對照組、吳茱萸堿1 μmol·L-1組、吳茱萸堿2 μmol·L-1組、吳茱萸堿4 μmol·L-1組。與對照組相比，*P<0.05；與吳茱萸堿1 μmol·L-1組相比，#P<0.05；與吳茱萸堿2 μmol·L-1組相比，&P<0.05。

2.2 各組HXO-Rb44細(xì)胞周期比較情況對照組與吳茱萸堿1 μmol·L-1組G0-G1期、G2-M期細(xì)胞比例比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)；吳茱萸堿2 μmol·L-1組、吳茱萸堿4 μmol·L-1組G0-G1期細(xì)胞比例較對照組、吳茱萸堿1 μmol·L-1組下降，G2-M期細(xì)胞比例較對照組、吳茱萸堿1 μmol·L-1組升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)；吳茱萸堿4 μmol·L-1組G0-G1期細(xì)胞比例較吳茱萸堿2 μmol·L-1組下降，G2-M期細(xì)胞比例較吳茱萸堿2 μmol·L-1組升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)。4組細(xì)胞的S期細(xì)胞比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖2)。

圖2 各組細(xì)胞周期比例情況 與對照組相比，*P<0.05;與吳茱萸堿1 μmol·L-1組相比，#P<0.05;與吳茱萸堿2 μmol·L-1組相比，&P<0.05。

2.3 各組HXO-Rb44細(xì)胞凋亡及ITGB2-AS1表達情況對照組與吳茱萸堿1 μmol·L-1組細(xì)胞凋亡率、ITGB2-AS1表達量比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)；吳茱萸堿2 μmol·L-1組、吳茱萸堿4 μmol·L-1組細(xì)胞凋亡率較對照組、吳茱萸堿1 μmol·L-1組升高，ITGB2-AS1表達量較對照組、吳茱萸堿1 μmol·L-1組降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)；吳茱萸堿4 μmol·L-1組細(xì)胞凋亡率較吳茱萸堿2 μmol·L-1組升高，ITGB2-AS1表達量較吳茱萸堿2 μmol·L-1組降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)(圖3)。

圖3 各組細(xì)胞ITGB2-AS1表達量和細(xì)胞凋亡率 A、B、C、D分別代表對照組、吳茱萸堿1 μmol·L-1組、吳茱萸堿2 μmol·L-1組、吳茱萸堿4 μmol·L-1組。與對照組相比，*P<0.05;與吳茱萸堿1 μmol·L-1組相比，#P<0.05;與吳茱萸堿2 μmol·L-1組相比，&P<0.05。

2.4 干擾ITGB2-AS1表達對HXO-Rb44細(xì)胞存活率、克隆形成數(shù)、細(xì)胞周期和凋亡的影響si-ITGB2-AS1組細(xì)胞ITGB2-AS1表達量、細(xì)胞存活率、克隆形成數(shù)和G0-G1期細(xì)胞比例均較si-NC組降低，G2-M期細(xì)胞比例、細(xì)胞凋亡率均較si-NC組升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)；但S期細(xì)胞比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖4)。

圖4 si-NC組、si-ITGB2-AS1組細(xì)胞ITGB2-AS1表達量、細(xì)胞存活率、克隆形成數(shù)和細(xì)胞比例和細(xì)胞凋亡率 與si-NC組相比，*P<0.05。

2.5 ITGB2-AS1對吳茱萸堿作用的影響吳茱萸堿4 μmol·L-1+pcDNA-ITGB2-AS1組細(xì)胞ITGB2-AS1表達量、細(xì)胞存活率和克隆形成數(shù)均較吳茱萸堿4 μmol·L-1+pcDNA組升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)(圖5)。

圖5 吳茱萸堿4 μmol·L-1+pcDNA組和吳茱萸堿4 μmol·L-1+pcDNA-ITGB2-AS1組細(xì)胞ITGB2-AS1表達量、細(xì)胞存活率和克隆形成數(shù) A和B分別代表吳茱萸堿4 μmol·L-1+pcDNA組和吳茱萸堿4 μmol·L-1+pcDNA-ITGB2-AS1組。與吳茱萸堿4 μmol·L-1+pcDNA組相比，*P<0.05。

吳茱萸堿4 μmol·L-1+pcDNA-ITGB2-AS1組G0-G1期細(xì)胞比例較吳茱萸堿4 μmol·L-1+pcDNA組升高， G2-M期細(xì)胞比例、細(xì)胞凋亡率較吳茱萸堿4 μmol·L-1+pcDNA組降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)(圖6)。

圖6 吳茱萸堿4 μmol·L-1+pcDNA組和吳茱萸堿4 μmol·L-1+pcDNA-ITGB2-AS1組細(xì)胞比例和細(xì)胞凋亡率 A和B分別代表吳茱萸堿4 μmol·L-1+pcDNA組和吳茱萸堿4 μmol·L-1+pcDNA-ITGB2-AS1組。與吳茱萸堿4 μmol·L-1+pcDNA組相比，*P<0.05。

3 討論

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤是一種侵襲性眼內(nèi)腫瘤，全世界每18 000名新生兒中就有1例此病患者，占所有兒童期癌癥的3%[11-12]。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤早期癥狀不明顯，確診時多數(shù)患者已處于中晚期，若延遲治療可導(dǎo)致不良預(yù)后[13]。吳茱萸堿是天然化合物，可劑量依賴性抑制胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬[14]。吳茱萸堿對骨肉瘤細(xì)胞具有抗癌作用，可促進其凋亡和G2-M細(xì)胞周期停滯[15]。吳茱萸堿能抑制甲狀腺癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[16]。但在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中的作用尚未可知。本研究結(jié)果顯示，用不同濃度吳茱萸堿處理HXO-Rb44細(xì)胞24 h后，2 μmol·L-1、4 μmol·L-1吳茱萸堿可降低HXO-Rb44細(xì)胞存活率、克隆形成數(shù)、G0-G1期細(xì)胞比例，并提高G2-M期細(xì)胞比例、細(xì)胞凋亡率，這與前人研究[6-7]相一致，表明吳茱萸堿能抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖，阻滯G2-M期細(xì)胞周期，并促進細(xì)胞凋亡。

越來越多的證據(jù)表明，lncRNA在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖過程中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[17]。Giulietti等[18]通過癌癥基因組圖集分析顯示，ITGB2-AS1在胰腺導(dǎo)管腺癌中過表達。Yang等[19]證實ITGB2-AS1在胰腺癌組織和細(xì)胞系中表達均升高，下調(diào)ITGB2-AS1表達能抑制胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Dai等[20]報道，ITGB2-AS1在骨肉瘤組織中的表達上調(diào)，ITGB2-AS1高表達的骨肉瘤患者預(yù)后較差，沉默ITGB2-AS1可降低骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力，并誘導(dǎo)其凋亡。本研究用吳茱萸堿處理HXO-Rb44細(xì)胞后ITGB2-AS1表達下調(diào)，提示吳茱萸堿可調(diào)控ITGB2-AS1表達。下調(diào)ITGB2-AS1表達可使視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤HXO-Rb44細(xì)胞存活率、克隆形成數(shù)、G0-G1期細(xì)胞比例降低，細(xì)胞凋亡率和G2-M期細(xì)胞比例增加，表明干擾ITGB2-AS1表達可抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖，并增強細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞周期進展。上調(diào)ITGB2-AS1表達可部分逆轉(zhuǎn)吳茱萸堿對HXO-Rb44細(xì)胞的作用，表明吳茱萸堿可通過調(diào)控ITGB2-AS1表達影響視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤進展。

綜上所述，吳茱萸堿能有效抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞周期，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機制可能與ITGB2-AS1表達下調(diào)有關(guān)。