李鵬飛 鮑思潔 王從玉 王思文 孫誠浩 康麗華 管懷進

已有研究發(fā)現，在紫外線照射引起的DNA損傷位點處發(fā)生N6-甲基腺苷(m6A)修飾的聚集，通過多種機制促進DNA修復，對抗紫外線照射引起的損傷[8-9]。m6A是真核生物mRNA中最豐富的內部表觀遺傳學修飾，參與mRNA代謝全部環(huán)節(jié)，通過調節(jié)RNA穩(wěn)定性和翻譯調節(jié)基因表達，在各種生物過程中發(fā)揮重要作用[10-12]。m6A修飾過程受到m6A甲基轉移酶復合物(MTC)、去甲基化酶和m6A識別酶的動態(tài)調控[13-14]。其中，ALKBH5作為去甲基化酶，在氧化應激誘導的DNA損傷修復中發(fā)揮重要作用[15-16]。雖然已有研究發(fā)現，ALKBH5在皮質型ARC的LEC中的表達顯著上調，但是其在ARC發(fā)生發(fā)展過程中的作用機制尚不清楚[17]。

本研究中，我們通過對LEC進行紫外線B(UVB)照射構建氧化損傷模型，探究m6A去甲基化酶ALKBH5在氧化損傷模型中對損傷性DNA修復的影響，為ARC的防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 一般資料選取2021年4月至10月在南通大學附屬醫(yī)院眼科住院并行超聲乳化白內障吸除術的ARC患者8例8眼為ARC組，選擇同期住院并接受透明晶狀體摘除術的黃斑前膜患者8例8眼為對照組，收集所有患者的臨床資料及晶狀體前囊膜，所有患者的晶狀體混濁程度均根據LOCSⅢ分級系統(tǒng)進行分級。ARC組患者排除標準：(1)并發(fā)性、外傷性、代謝性、藥物及中毒性白內障等其他類型的白內障；(2)雙眼中有一眼為無晶狀體眼;(3)合并高血壓、糖尿病或自身免疫病。對照組患者排除標準：(1)合并高度近視、葡萄膜炎或青光眼等眼部疾??；(2)合并高血壓、糖尿病或其他全身性疾病。ARC組患者男5例、女3例，年齡為50～80(66.1±3.4)歲，對照組患者男4例、女4例，年齡為50～80(65.6±2.7)歲，兩組患者間性別和年齡差異均無統(tǒng)計學意義(P=0.94、0.18)。本研究通過南通大學附屬醫(yī)院倫理委員會審批(倫理審查批號：2021-L091)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 材料人LEC細胞系SRA01/04細胞購自中國科學院上海生命科學研究所。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；手持式紫外線檢測燈購自中國光豪分析儀器公司；逆轉錄試劑盒購自美國Thermo Scientific公司，Trizol試劑盒購自美國Invitrogen公司，引物購自上海生工生物工程股份有限公司；靶向ALKBH5設計的siRNAs購自中國銳博生物科技有限公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學研究所；15A3抗體購自英國Abcam公司；GAPDH抗體、熒光二抗(辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔和山羊抗鼠IgG)均購自中國ABclonal公司。

1.3 細胞培養(yǎng)和UVB處理將SRA01/04細胞復蘇后，加入完全培養(yǎng)基(含體積分數10%胎牛血清和10 g·L-1青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基)，并置于 37 ℃、含體積分數5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待培養(yǎng)皿中的細胞融合度達80%左右時，用Hanks液清洗細胞2次，加入適量的無菌PBS，置于手持式紫外線檢測燈(波長為275～400 nm ，峰值為310 nm )下30 cm處照射。UVB照射時間梯度為0 min、10 min、15 min、30 min、45 min。照射后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，進行后續(xù)實驗。

1.4 qRT-PCR檢測根據Trizol試劑盒的步驟提取ARC組(n=3)和對照組(n=3)患者晶狀體前囊膜上皮細胞中的總RNA。按照說明書行qRT-PCR檢測，以GAPDH為內參，使用2-△△Ct分析，實驗均重復3次。GAPDH上游引物為5’-TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3’，下游引物為5’-CATGTGGGCCATGAGGTCC ACCAC-3’。ALKBH5上游引物為5’-CCCGAGGGCTTCGTCAACA-3’，下游引物為5’-CGACACCCGAATAGGCTTGA-3’。同樣方法檢測經不同方法處理后SRA01/04細胞中ALKBH5 mRNA和11個DNA氧化損傷修復基因(ODRGs)的表達，其中11個ODRGs的引物序列見表1。

表1 11個ODRGs的引物序列

1.5 免疫印跡實驗檢測取ARC組(n=5)和對照組(n=5)患者的晶狀體前囊膜，提取上皮細胞，加入蛋白裂解液冰上裂解，提取蛋白上清，于125 g·L-1的凝膠上進行電泳(電壓80 V轉120 V)分離蛋白；采用濕轉法轉膜(電流250 mA，2 h)；采用5 g·L-1脫脂奶粉室溫下封閉2 h；參照說明書將稀釋好的目的一抗(ALKBH5稀釋度為11000;GAPDH稀釋度為16000)加入PVDF膜中，置于4 ℃冰箱孵育過夜；次日，用TBST漂洗，然后加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔(二抗)IgG在室溫下孵育2 h；最后，TBST洗滌后加入顯影劑，置于暗室內曝光顯影。以GAPDH為內參。同樣方法檢測經不同方法處理后SRA01/04細胞中ALKBH5蛋白表達。

1.6 細胞分組及轉染檢測siALKBH5轉染效率時，實驗分為轉染siALKBH5組(針對ALKBH5 mRNA的三個不同區(qū)域設計靶向敲低ALKBH5的siRNA,命名為siALKBH5#1、siALKBH5#2和siALKBH5#3)、轉染對照siNC組(轉染對照siNC)和Control組(未經任何處理)。檢測ALKBH5在細胞氧化損傷模型中的功能時，實驗分為Control組(未經任何處理)、UVB組(采用UVB照射)、UVB+siNC組(轉染對照siNC,同時采用UVB照射處理)以及UVB+siALKBH5#3組(轉染siALKBH5#3，同時采用UVB照射處理)。轉染方法：6孔板每孔中加入Lipofectamine 3000和siRNA充分混勻后室溫孵育15 min，之后，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，進行后續(xù)實驗。

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1.7 CCK-8法檢測細胞活力CCK-8法檢測Control組、UVB組、UVB+siNC組以及UVB+siALKBH5#3組細胞活力，具體方法為：將SRA01/04細胞以每孔1×104個的密度接種于96孔板，每組設6個復孔，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h；分組處理后棄培養(yǎng)基，向每孔加入100 μL完全培養(yǎng)基和10 μL CCK-8溶液；繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中孵育1～2 h(操作過程中注意避光)；使用酶標儀測定450 nm處的吸光度。

1.8 免疫熒光染色檢測DNA氧化損傷UVB+siNC組和UVB+siALKBH5#3組SRA01/04細胞分組處理后，PBS清洗，40 g·L-1多聚甲醛室溫固定30 min,加入30 g·L-1牛血清白蛋白和體積分數0.5% Triton X-100溶液，室溫封閉2 h；依據15A3抗體(15A3抗體可檢測到發(fā)生損傷DNA的標志物8-oxoG，而8-oxoG為ALKBH5修復損傷DNA的結合底物[8])說明書，使用10 g·L-1牛血清白蛋白配一抗反應液，4 ℃孵育過夜；次日取出洗滌后，加入熒光二抗，室溫下孵育2 h(操作過程中注意避光)；之后，Hoechst(110 000)孵育8 min染細胞核(操作過程中注意避光)，熒光顯微鏡下避光觀察、拍照。

1.9 統(tǒng)計學方法實驗數據均采用Graphpad prism 8統(tǒng)計學軟件分析。多組間比較均采用單因素方差分析，兩樣本間比較采用t檢驗。所有實驗均重復3次。檢驗水準：α=0.05。

2 結果

2.1 ARC患者晶狀體前囊膜上皮細胞中ALKBH5 mRNA和蛋白表達qRT-PCR和免疫印跡實驗檢測結果顯示，與對照組相比，ARC組患者晶狀體前囊膜上皮細胞中ALKBH5 mRNA和蛋白表達均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)(圖1)。

圖1 ARC組和對照組患者晶狀體前囊膜上皮細胞中ALKBH5的mRNA和蛋白表達 A：qRT-PCR檢測ALKBH5 mRNA表達；B：免疫印跡實驗檢測ALKBH5蛋白表達。與對照組相比，****P<0.000 1。

2.2 UVB照射對LEC中ALKBH5表達的影響

2.2.1 UVB照射對LEC中ALKBH5 mRNA表達的影響qRT-PCR檢測結果顯示，與UVB照射0 min時相比，SRA01/04細胞中ALKBH5 mRNA表達量在UVB照射10 min時上升，在UVB照射30 min和45 min時下降，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)；UVB照射15 min與0 min時相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。其中，UVB照射10 min時ALKBH5 mRNA的表達量最高(圖2)。

圖2 qRT-PCR檢測UVB照射不同時間SRA01/04細胞中ALKBH5 mRNA表達 與照射0 min時相比，*P<0.05，****P<0.000 1。

2.2.2 UVB照射對LEC中ALKBH5蛋白表達的影響免疫印跡實驗檢測結果顯示，在UVB以時間梯度照射SRA01/04細胞后，SRA01/04細胞中ALKBH5的蛋白表達量呈上升后下降趨勢。與UVB照射0 min時相比，SRA01/04細胞中ALKBH5蛋白表達量在UVB照射10 min時和15 min時上升，在UVB照射45 min時下降，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)；UVB照射30 min與照射0 min時相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。其中，UVB照射10 min時ALKBH5的蛋白表達量升高最明顯(圖3)。因此，本實驗細胞UVB照射氧化損傷模型的構建均采用輻射強度為0.09 mW·cm-2的手持式紫外線檢測燈照射SRA01/04細胞10 min。

圖3 免疫印跡實驗檢測UVB照射不同時間SRA01/04細胞中ALKBH5蛋白表達 與照射0 min時相比，**P<0.01，***P<0.001。

2.3 ALKBH5敲降模型驗證qRT-PCR和免疫印跡實驗檢測結果顯示，與轉染對照siNC組相比，轉染siALKBH5#3后，SRA01/04細胞中ALKBH5 mRNA和蛋白表達均顯著降低(均為P<0.001)(圖4)。因此，選取siALKBH5#3用于后續(xù)功能實驗的ALKBH5敲降模型。

圖4 不同siALKBH5轉染SRA01/04細胞后mRNA和蛋白水平的敲降效率驗證 與轉染對照siNC組相比，***P<0.001，****P<0.000 1。

2.4 敲降ALKBH5對LEC狀態(tài)的影響

2.4.1 ALKBH5轉染后細胞活力檢測CCK-8法檢測結果顯示，與Control組相比，UVB和UVB+siNC組SRA01/04細胞活力均明顯降低(均為P<0.000 1);與UVB+ siNC組和UVB組相比，UVB+siALKBH5#3組SRA01/04細胞活力明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.000 1)(圖5)。

圖5 siALKBH5#3轉染對SRA01/04細胞活力的影響 與Control組相比，****P<0.000 1；與UVB組和UVB+siNC組相比，####P<0.000 1。

2.4.2 ALKBH5敲降后細胞內DNA氧化損傷程度變化免疫熒光染色檢測結果顯示，與UVB+siNC組(熒光強度為33.8±2.7)相比，UVB+siALKBH5#3組SRA01/04細胞的15A3染色(熒光強度為68.0±6.0)明顯增多，差異具有統(tǒng)計學意義(t=10.39,P<0.000 1)(圖6)。

圖6 siALKBH5#3轉染對SRA01/04細胞DNA氧化損傷的影響

2.5 敲降ALKBH5對LEC的ODRGs表達的影響qRT-PCR檢測結果顯示，與轉染對照siNC組相比，轉染siALKBH5#3組SRA01/04細胞中TREX1、FANCD2、LIG1、MSH2、MSH3、RPA2、SMUG1、XRCC6mRNA的表達均顯著升高，DCLRE1AmRNA的表達顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.01)；兩組間MGMT和MRE11AmRNA的表達差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)(圖7)。

圖7 敲降ALKBH5對SRA01/04細胞ODRGs表達的影響 與轉染對照siNC組相比，**P<0.01，****P<0.000 1。

3 討論

LEC是晶狀體中唯一的細胞類型，在維持晶狀體內部環(huán)境的穩(wěn)態(tài)以及維持晶狀體光學透明度方面發(fā)揮著關鍵作用[18]。LEC內的氧化應激誘發(fā)因素主要包括外源性紫外線和內源性的線粒體呼吸鏈所產生的活性氧(ROS)，當ROS的產生超過細胞自身生理性的抗氧化防御機制時，就會導致氧化和抗氧化失衡，從而引發(fā)氧化應激反應[19-21]。有研究顯示，氧化應激可導致每個生物體每天大約104個DNA發(fā)生氧化損傷[22]。氧化損傷往往是不可避免的，因此，在機制方面針對DNA損傷修復調控的研究在ARC的防治中具有重要意義。

m6A是發(fā)生在腺苷N6位的甲基化，在真核生物的mRNA中廣泛分布，調控多種生物活動過程，包括轉錄、翻譯、干細胞的維持和分化以及腫瘤的惡化等[23-25]。也有研究發(fā)現，在氧化應激條件下可以通過多種機制調節(jié)m6A修飾水平，促進DNA修復，維持基因穩(wěn)定性[8,16]。Xiang等[8]研究發(fā)現，紫外線誘導的DNA損傷能特異性觸發(fā)m6A甲基轉移酶METTL3在DNA損傷位點的瞬時募集，促進m6A RNA水平全面升高，進而誘導與核苷酸切除修復和跨損傷合成有關的 DNA 聚合酶κ(Pol κ)定位DNA損傷位點，參與損傷DNA的修復。Yu等[16]研究發(fā)現，在ROS誘導的氧化應激過程中，ROS通過激活ERK/JNK信號通路促進m6A去甲基化酶ALKBH5 SUMO化，抑制ALKBH5活性，誘導mRNA m6A修飾，從而提高氧化修復基因的穩(wěn)定性，促進DNA修復過程。所以，m6A可以通過響應氧化應激誘導的DNA損傷來調節(jié)DNA修復，在此過程中m6A調節(jié)酶起到了重要的調控作用。

m6A調節(jié)酶可分為3種類型，共同參與m6A動態(tài)可逆的調控過程，即m6A甲基轉移酶復合物(MTC)，包括METTL3、METTL14、WTAP等，負責催化m6A；m6A去甲基化酶，包括FTO、ALKBH5，負責將m6A刪除；m6A識別酶，包括 YT521-B 同源域蛋白家族(YTHDF1/2/3 和 YTHDC1/2)等[21]，負責特異性識別m6A修飾位點并與之結合[26]。本研究通過對比ARC組和對照組患者晶狀體前囊膜樣本，發(fā)現m6A去甲基化酶ALKBH5在ARC患者晶狀體前囊膜上皮細胞中的表達顯著升高，這也一定程度上提示了m6A水平的改變。另外，在采用UVB以時間梯度照射LEC構建的氧化損傷模型中，發(fā)現在UVB照射10 min后，ALKBH5 mRNA和蛋白表達水平均顯著上升。因此，我們推測m6A去甲基化酶ALKBH5在LEC的氧化損傷過程中可能發(fā)揮著重要調控作用。

為了進一步探究ALKBH5在UVB誘導的LEC氧化損傷模型中的功能，本研究首先利用靶向ALKBH5的小干擾RNA(siRNA)對其進行了敲降實驗，然后比較了各組中的細胞活力改變和DNA損傷情況，結果發(fā)現，同樣經過UVB照射10 min，敲降ALKBH5的LEC與未處理組和干擾組相比細胞活力更差；15A3熒光染色結果也同樣提示，遭受相同程度的UVB照射，敲降ALKBH5的細胞更易發(fā)生DNA損傷。因此，我們可以確定ALKBH5在LEC響應氧化應激損傷的過程中起到了保護作用，可對抗由UVB照射誘導的DNA損傷，具體機制尚不明確，仍然有待深入研究。

在DNA損傷修復過程中，首先檢查點激酶CHK1和CHK2被激活，然后啟動細胞周期檢查點，從而引起細胞周期停滯和DNA修復[27]。DNA修復主要包括直接修復、堿基切除修復、核苷酸切除修復、錯配修復、單鏈斷裂修復以及雙鏈斷裂修復等途徑[28]。相關研究發(fā)現，ALKBH5能調控ODRGs的表達[16,29-30]。課題組前期通過微陣列分析篩選和qRT-PCR檢測驗證了96個ODRGs，發(fā)現了在ARC和對照患者樣本中顯著差異表達的11個ODRGs，這些差異表達的ODRGs在DNA修復途徑中發(fā)揮不同功能，促進DNA的損傷修復——LIG1、MGMT、SMUG1參與堿基切除修復，DCLRE1A、RPA2參與核苷酸切除修復，TREX1、MSH2、MSH3參與錯配修復，FANCD2參與同源重組，MRE11A、XRCC6參與雙鏈斷裂修復[31]。對此，我們在LEC中靶向ALKBH5進行敲低，觀察這些ODRGs的表達情況，結果發(fā)現，TREX1、FANCD2、LIG1、MSH2、MSH3、RPA2、SMUG1、XRCC6mRNA的表達在ALKBH5敲降后均顯著升高，而DCLRE1A mRNA的表達顯著降低，MGMT和MRE11AmRNA的表達則未見明顯差異，表明敲降ALKBH5后，細胞內ODRGs的表達明顯改變。其中，表達升高最為顯著的FANCD2,在DNA損傷反應的早期階段可發(fā)揮信號轉導作用被ATM磷酸化，從而觸發(fā)細胞周期停滯[32]，同時還作為與其他信號轉導通路協(xié)同作用的檢查點機制的中心，在及時修復受損DNA中發(fā)揮著至關重要的作用[33]。此外，作為哺乳動物細胞中重要的3’-5’ DNA核酸外切酶，TREX1除了能優(yōu)先選擇錯配的核苷酸，參與錯配修復外[34]，還可通過降解細胞周期S期出現的單鏈DNA，阻止慢性ATM依賴性檢查點的激活[35]，多階段促進DNA損傷修復。

綜上所述，ALKBH5在ARC患者以及UVB誘導的細胞氧化損傷模型中表達升高。在UVB誘導的細胞氧化損傷模型中靶向敲降ALKBH5，可導致細胞活力下降以及DNA損傷程度加重，同時ODRGs表達升高，促進DNA損傷修復。而在ARC患者中，ALKBH5表達的顯著升高也意味著ODRGs的表達受到抑制，從而無法對LEC中長期累積的DNA損傷進行及時修復，最終導致ARC的發(fā)生。因此，我們的結果證實了m6A去甲基化酶ALKBH5在UVB誘導的LEC氧化損傷模型中誘導性表達上升，敲降ALKBH5可影響細胞內ODRGs表達變化，參與調控LEC內損傷DNA的修復，阻止ARC的發(fā)生。