夏 昆，韓永升,2，艾文龍，王 玉，朱玉龍,孫丹丹,付曉明，葉群榮，李 凱，楊任民

(1.安徽中醫(yī)藥大學神經(jīng)病學研究所，安徽 合肥 230061;2.安徽省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，安徽 合肥 230031)

肝豆狀核變性(HLD)是一種好發(fā)于青少年的常染色體隱性遺傳性銅代謝障礙性疾病，由于13號染色體q14.3上的 ATP7B基因突變導致銅轉(zhuǎn)運障礙，大量銅沉積于肝、腦、腎等部位，引起相應(yīng)的臟器嚴重損害[1]。過量的銅在組織細胞內(nèi)沉積會誘導過度的氧化應(yīng)激反應(yīng)，使線粒體膜的完整性與功能遭到破壞，加重患者肝、腦、腎等多臟器損害[2]。近期研究表明，HLD患者存在血清超氧化物歧化酶(SOD)活性減低[3]。SOD是人體中抗氧化酶系的重要組成部分，它能夠催化超氧陰離子自由基歧化生成氧和過氧化氫，在機體氧化與抗氧化平衡中起著至關(guān)重要的作用[4]。在臨床工作中觀察到部分HLD患者存在血清SOD 活性減低或增高等異常變化。本文分析HLD患者的血清SOD活性水平及相關(guān)的臨床資料，探討HLD患者血清SOD活性水平變化的特點及可能機制，同時分析與具有強效的自由基清除作用的尿酸(UA)水平和間接反映HLD患者體內(nèi)含銅量的24 h尿銅水平之間關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料:本次研究經(jīng)過安徽中醫(yī)藥大學神經(jīng)病學研究所醫(yī)學倫理委員會同意，回顧性分析2020年1月～2022年1月在安徽中醫(yī)藥大學神經(jīng)病學研究所住院的500例HLD患者，要求所有入組的患者符合中華醫(yī)學會神經(jīng)病學分會神經(jīng)遺傳學組制定的《中國肝豆狀核變性診治指南2021》[1]中HLD的診斷標準，且均為漢族。其中男312例，女188例；年齡3～68歲，平均(27.40±12.64)歲。根據(jù)患者年齡分布，分為7組：第1組(1～10歲)40例，第2組(11～20歲)119例，第3組(21～30歲)155例，第4組(31～40歲)113例，第5組(41～50歲)46例，第6組(51～60歲)21例，第7組(≥61歲)6例。根據(jù)患者病程分布，將病程分為5組：第1組(≤5年)171例，第2組(6～10年)111例，第3組(11～20年)153例，第4組(21～30年)55例，第5組(≥31年)10例。根據(jù)患者臨床表現(xiàn)特征，將入組患者的臨床分型分為5型：①癥狀前期(12例)，②肝型(153例)，③腦-內(nèi)臟型 (87例)，④腦型(241例)，⑤骨肌型(7例)。根據(jù)患者肝臟損害的超聲表現(xiàn)特征，將入組患者的肝臟分型分為6型：①輕微病變型(42例)，②脂肪肝型(30例)，③星光點型 (29例)，④巖層型 (99例)，⑤樹枝光帶型(86例)，⑥結(jié)節(jié)型(214例)。根據(jù)患者疾病嚴重程度，將入組患者的臨床分級分為0～Ⅳ級：①0級(34例)，②Ⅰ級(86例)，③Ⅱ級(270例)，④Ⅲ級(82例)，⑤Ⅳ級(28例)。

1.2分型標準

1.2.1臨床分型：參照 2015年楊任民[5]制定的HLD臨床分型標準。根據(jù)患者發(fā)病年齡、臨床表現(xiàn)及病理特征，分為癥狀前期型、肝型、腦-內(nèi)臟型、腦型、骨肌型。癥狀前期型：無肝、腦損害癥狀；肝型：以肝損害為突出或首發(fā)癥狀，無神經(jīng)損害癥狀；腦-內(nèi)臟型：同時存在顯著的肝臟損害癥狀和神經(jīng)損害癥狀，如肝脾腫大、肝硬化、肌僵直、震顫等；腦型：突出的神經(jīng)損害癥狀，包括肌張力障礙型、扭轉(zhuǎn)痙攣型、舞蹈-手足徐動型、類帕金森型、精神障礙型；骨肌型：表現(xiàn)為佝僂病樣骨骼改變和肌病樣表現(xiàn)，而肝臟和神經(jīng)損傷癥狀較少或輕微。

1.2.2肝臟分型：參照 2015年楊任民[5]制定的HLD肝臟損害的超聲分型標準。根據(jù)肝臟損害的聲像圖按損害從輕到重程度依次分為6種類型，包括：輕微病變型、脂肪肝型、星光點型、巖層型、樹枝光帶型、結(jié)節(jié)型。輕微病變型：超聲僅見肝臟回聲光點輕度增粗、增密；脂肪肝型：超聲見肝臟回聲光點增強且細密；星光點型：超聲見肝內(nèi)光點增多、增粗、增強，似夜空繁星閃爍；巖層型：超聲表現(xiàn)為肝內(nèi)寬窄不一、強弱相間的條索狀光帶回聲，類似地層斷面的巖層筑構(gòu)圖；樹枝光帶型：超聲表現(xiàn)為肝內(nèi)增多、增粗、增強的光點沿門靜脈及其分支分布，構(gòu)成樹枝狀強回聲帶；結(jié)節(jié)型：超聲見肝實質(zhì)由顆粒狀高回聲結(jié)節(jié)構(gòu)成，肝包膜不光滑，肝內(nèi)血管減少近消失。

1.2.3臨床分級：參照2015年楊任民修訂的Goldstein ADL分級標準(見表1)[5]。

表1 2015年楊任民修訂的Goldstein ADL分級標準

1.3研究方法

1.3.1資料收集方法：統(tǒng)計2020年1月～2022年1月在安徽中醫(yī)藥大學神經(jīng)病學研究所住院的500例HLD患者的性別、年齡、病程、臨床分型、肝臟分型和臨床分級，并將患者年齡、病程按預先設(shè)定的時間段進行分類。

1.3.2血清SOD檢測方法及水平分級：HLD患者于入院后次日早晨(近期未接受驅(qū)銅藥物治療)空腹采集靜脈血3 ml于真空生化負壓管中，標本凝固后30 min內(nèi)以3 000 r/min 離心10 min，分離血漿后1 h內(nèi)檢測。檢測儀器使用日立7180全自動生化分析儀。SOD采用鄰苯三酚法，試劑由北京百奧泰康生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。血清SOD活性水平分級[6]：110.0～215.0 U/ml為正常，<110.0 U/ml為減低，>215.0 U/ml為增高。血清SOD活性水平總異常率=(減低例數(shù)+增高例數(shù))/總例數(shù)×100%。

1.3.3血清UA檢測方法：標本采集方法及檢測儀器同SOD。使用尿酸酶法測定尿酸，試劑由上?？迫A東菱診斷用品有限公司提供。

1.3.424 h尿銅檢測方法：HLD患者留取當日7點晨尿至次日7點晨尿的全部尿液置于經(jīng)去離子水處理過的統(tǒng)一規(guī)格尿桶中，每次留尿后需及時加蓋避免污染和揮發(fā)，尿量以2 L為宜，女性患者應(yīng)避開月經(jīng)期。尿銅含量的檢測采用GGX系列原子吸收分光光度計。HLD患者留取入院次日24 h尿銅，即療前24 h尿銅，要求患者入院前1 w內(nèi)未接受驅(qū)銅治療；二巰基丙磺酸鈉20 mg/(kg·d)驅(qū)銅治療第1療程第2天的24 h尿銅，即療后24 h尿銅，8 d為1個療程(前6 d驅(qū)銅治療，后2 d為間歇期，補充鈣、鋅微量元素。)，共4個療程。

1.3.5分析方法：分析并比較不同性別、年齡、病程、臨床分型、肝臟分型和臨床分級的HLD患者血清SOD活性水平差異，同時分析血清SOD活性水平與患者年齡、病程、UA、療前和療后24 h尿銅的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1不同基本資料下HLD患者血清SOD活性水平比較:500例HLD患者中，25例血清SOD活性降低，136例血清SOD活性升高，總異常率為32.2%。男、女性別間SOD活性水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。不同年齡分組、病程分組、臨床分型、肝臟分型、臨床分級的HLD患者的血清SOD活性水平差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其中，年齡分組1～10歲組患者血清SOD活性水平最高，51～60歲組患者最低；病程分組6～10年組患者血清SOD活性水平最高，21～30年組患者最低；臨床分型癥狀前期型患者血清SOD活性水平最高，腦-內(nèi)臟型患者最低；肝臟分型輕微病變型患者血清SOD活性水平最高，結(jié)節(jié)型患者最低，患者血清SOD活性水平隨著肝臟損傷程度的加重，呈逐漸下降趨勢；臨床分級0級患者血清SOD活性水平最高，Ⅳ級患者最低，患者血清SOD活性水平隨著臨床分級等級的升高，呈逐漸下降趨勢。見表2。

表2 不同基本資料下HLD患者SOD活性水平比較結(jié)果

2.2不同臨床分型的HLD患者年齡、病程、UA、療前24 h尿銅和療后24 h尿銅比較：不同臨床分型的HLD患者年齡、病程、UA、療后24 h尿銅的差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，療前24 h尿銅的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。其中，癥狀前期型患者的年齡最小，病程最短，血UA水平最高，療前和療后 h尿銅水平最低；腦-內(nèi)臟型患者的年齡最大，病程最長，血UA水平最低，療前和療后24 h尿銅水平最高。見表3。

表3 不同臨床分型的HLD患者年齡、病程、UA、療前24 h尿銅和療后24 h尿銅比較[M(P25，P75)]

2.3HLD患者血清SOD活性水平與年齡、病程、UA、療前24 h尿銅和療后24 h尿銅的相關(guān)性分析：采用Spearman相關(guān)性分析，HLD患者血清SOD活性水平與年齡之間存在弱負向相關(guān)關(guān)系，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，雙側(cè)檢驗)，與病程之間存在極弱負向相關(guān)關(guān)系，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，雙側(cè)檢驗)，與UA之間存在弱正向相關(guān)關(guān)系，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，雙側(cè)檢驗)，與療前24 h尿銅之間存在極弱負向相關(guān)關(guān)系，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，雙側(cè)檢驗)，與療后24 h尿銅之間存在弱負向相關(guān)關(guān)系(P<0.01，雙側(cè)檢驗)。見表4。

表4 HLD患者SOD活性與年齡、病程、UA、療前24 h尿銅和療后24 h尿銅的相關(guān)性結(jié)果

3 討論

SOD是生物體內(nèi)最重要的自由基清除劑，SOD活性高低可以反映機體的抗氧化能力，其活性水平高低與體內(nèi)自由基含量呈負相關(guān)[7]。現(xiàn)有研究表明，HLD發(fā)病初始因素與銅誘導的氧化應(yīng)激損傷相關(guān)[8]。HLD是由于ATP7B基因突變引起慢性銅中毒，銅是介導氧化應(yīng)激損傷的主要原因，過量的銅會促進體內(nèi)自由基和有害的脂質(zhì)蛋白氧化物形成，從而導致靶器官的損傷[9]。由于肝臟是人體最主要的貯銅臟器，HLD患者體內(nèi)過量的銅會首先沉積在肝細胞胞漿和溶酶體內(nèi)[10]，損傷肝細胞線粒體，產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)而進一步加重肝損害。因此，通過檢測HLD患者的血清SOD活性水平能夠直接反映患者體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)程度，即HLD患者的血清SOD活性水平越低提示患者體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)程度越嚴重，自由基等氧化物質(zhì)的含量則越高。

本次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)HLD患者血清SOD活性水平與性別無關(guān)，但是不同年齡、病程、臨床分型、肝臟分型、臨床分級的患者血清SOD活性水平存在顯著差異。血清SOD活性與HLD患者的年齡、病程具有負向相關(guān)性，隨著HLD患者年齡及病程的增長，其血清SOD活性水平呈逐漸下降趨勢，推測其原因可能是隨著HLD患者年齡增長、病程的延長，體內(nèi)銅蓄積量增多，肝、腦等臟器損傷程度嚴重，患者體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)程度嚴重，自由基等氧化物質(zhì)水平高。不同臨床分型的HLD患者血清SOD活性水平存在顯著差異，其中，腦-內(nèi)臟型患者的血清SOD活性水平最低，而癥狀前期型患者的血清SOD活性水平最高，推測其原因可能是由于癥狀前期型患者年齡小，病程短，體內(nèi)蓄積銅量少，肝臟無明顯損害，體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)程度輕微；而腦-內(nèi)臟型患者年齡大，病程長，體內(nèi)蓄積銅量多，同時存在肝臟、腦等多臟器嚴重損害，病情損傷程度重，體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)程度重。不同肝臟分型的HLD患者血清SOD活性水平存在顯著差異，其中，肝臟輕微病變型患者的血清SOD活性水平最高，而肝臟呈結(jié)節(jié)型患者的血清SOD活性水平最低，表明HLD患者的血清SOD活性水平與肝臟損傷程度呈負相關(guān)性，隨著肝臟損害程度的加重，患者體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)程度劇烈，體內(nèi)抗氧化物質(zhì)消耗過多，從而導致患者體內(nèi)的SOD活性水平降低。不同臨床分級的HLD患者血清SOD活性水平存在顯著差異，0級患者的血清SOD活性水平最高，Ⅳ級患者的血清SOD活性水平最低，隨著臨床分級增高，HLD患者的血清SOD活性水平呈逐漸下降趨勢。臨床分級的高低反映了HLD患者疾病損傷的嚴重程度，0級患者無明顯臨床癥狀及體征，而Ⅳ級患者生活完全不能自理，存在嚴重肢體扭轉(zhuǎn)、黃疸，表明HLD患者的血清SOD活性水平與病情損傷程度呈負相關(guān)性，HLD患者出現(xiàn)血清SOD活性水平下降，說明病情損傷程度嚴重。

研究發(fā)現(xiàn)，UA是人體內(nèi)重要的抗氧化物質(zhì)，能夠減輕體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，同時能螯合金屬離子[11-12]。本次研究表明SOD活性與UA之間具有正向相關(guān)性，進一步支持了先前的研究。因此，通過檢測HLD患者的血清UA水平，也能夠間接反映患者體內(nèi)氧化應(yīng)激程度，同時對疾病損害嚴重程度的初步判斷也有一定的指導價值。HLD患者血清UA水平越低，則說明體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)程度越嚴重，病情損害越嚴重。療前和療后24 h尿銅水平均能間接反映了HLD患者體內(nèi)蓄積銅量的多少，本次研究發(fā)現(xiàn)HLD患者的血清SOD活性水平與療前24 h尿銅、療后24 h尿銅之間具有一定的負相關(guān)性，特別是療后24 h尿銅。HLD患者的療前、療后24 h尿銅水平高，說明患者體內(nèi)蓄積的銅量多，銅作為氧化物的前體能夠促進自由基和有害脂質(zhì)蛋白氧化物的形成[13]，此外，肝細胞內(nèi)高濃度銅離子會導致SOD銅伴侶蛋白表達下調(diào)，引起SOD活性水平減低[14]。由此很容易理解HLD患者的SOD活性水平與24 h尿銅量呈負相關(guān)性。

綜上所述，HLD患者存在血清SOD活性水平的異常變化，血清SOD活性水平與患者年齡、病程、24 h尿銅呈負相關(guān)性，與UA呈正相關(guān)性。此外，血清SOD活性水平受到HLD患者疾病損害程度的影響，隨著HLD患者疾病損害程度的加重，其血清SOD活性水平逐漸下降，通過觀察HLD患者的血清SOD活性水平，對患者病情嚴重程度的初步判斷有一定的臨床指導價值。