鄭孟加，馬 萌，王永強(qiáng)，高 麗，曹 紅，李淑芹，李曉齊，鄭世軍

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 海淀 100193)

1995年，Okamura等從中毒休克的小鼠肝臟中分離到1種可以誘導(dǎo)Th細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生γ干擾素(Interferon-γ，IFN-γ)的物質(zhì)，被稱為IFN-γ誘生因子(IFN-gamma-inducing factor,IGIF)[1]。1996年，Ushio等將其正式命名為白介素18(Interleukin-18,IL-18)[2]。IL-18是重要的免疫調(diào)節(jié)分子，通常以前體的狀態(tài)存在于細(xì)胞內(nèi)部，當(dāng)機(jī)體受到細(xì)菌或病毒刺激時(shí)，其前體會(huì)被炎性小體切割形成有活性的IL-18并釋放到胞外[3]，因此IL-18可以作為檢測(cè)炎性小體介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡的重要指標(biāo)，也是檢測(cè)先天性免疫應(yīng)答炎癥反應(yīng)的重要指標(biāo)。雞IL-18與人和小鼠IL-18氨基酸同源性分別為34%和27%，目前國(guó)內(nèi)外用于檢測(cè)chIL-18的商品化單克隆抗體或試劑盒較為罕見。為此，本試驗(yàn)制備了抗chIL-18單克隆抗體，為深入研究chIL-18的生物學(xué)功能及炎性小體細(xì)胞焦亡的檢測(cè)打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、細(xì)菌種類、蛋白、細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 pGEX-6p-1、pET-28a兩種質(zhì)粒，大腸埃希菌(E.coli)BL21/DH5α，標(biāo)簽蛋白His-IL-1、His-IFN-β、His-IL-10，骨髓瘤細(xì)胞SP2/0，均為本實(shí)驗(yàn)室留存；6～8周齡BALB/c小鼠，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2021—0006。

1.2 主要試劑與儀器設(shè)備 限制性內(nèi)切酶，購(gòu)自NEB公司；DNA膠回收試劑盒，購(gòu)自Zymo公司；DNA連接酶和蛋白Marker,購(gòu)自TaKaRa有限公司；Ni-NTA親和純化柱,購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；凝膠Glutathione Sephrose 4B，購(gòu)自GE Healthcare BioSciences AB公司；質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖校?gòu)自北京艾德萊公司；鼠源抗His、GST單克隆抗體，購(gòu)自Abmart公司；HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，購(gòu)自鼎國(guó)昌盛公司；弗氏完全/不完全佐劑、HAT、HT、Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents鑒定試劑盒、DMEM粉劑、胎牛血清、DMSO和HEPES，均購(gòu)自Cibco公司。凝膠成像分析儀，購(gòu)自美國(guó)Alpha公司；96孔酶標(biāo)儀，購(gòu)自TECAN公司；低溫冷凍高速離心機(jī)，購(gòu)自Eppendorf公司。

1.3 chIL-18重組質(zhì)粒的構(gòu)建及蛋白表達(dá) 根據(jù)NCBI上發(fā)表的chIL-18的序列(GenBank ID：AJ277865.1)設(shè)計(jì)特異性引物：F1(5′-ATGAGCTGTGAAGAGATCGC-3′)、R1(5′-TCATAGGTTGTGCCTT-TCATTA-3′)，以感染沙門菌的雞脾細(xì)胞制備的cDNA為模板，擴(kuò)增chIL-18基因；將擴(kuò)增得到的特異性條帶回收后連接至T載體，并設(shè)計(jì)含有BamHⅠ、XhoⅠ酶切位點(diǎn)的特異性引物F2(5′-GGATCCATGAGCTGTGAAGAGATCGC-3′)、R2(5′-CTCGA-GTCATAGGTTGTGCCTTTCAT-3′)，以測(cè)序正確的質(zhì)粒為模板對(duì)chIL-18基因進(jìn)行擴(kuò)增；利用雙酶切方法將chIL-18基因連接到pET-28a和pGEX-6p-1載體上，轉(zhuǎn)入大腸埃希菌DH5α，隨后對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序鑒定。將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)導(dǎo)入大腸埃希菌BL21中，加入IPTG對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)產(chǎn)生的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot鑒定，隨后利用親和層析法純化鑒定正確的蛋白，高純度的2種蛋白分別用作小鼠免疫和陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞篩選的抗原。

1.4 chIL-18單克隆抗體的制備與純化 免疫小鼠3次后，以間接ELISA方法檢測(cè)小鼠chIL-18陽(yáng)性血清效價(jià)水平，效價(jià)足夠高的小鼠脾細(xì)胞可用來進(jìn)行細(xì)胞融合。小鼠免疫程序參照參考文獻(xiàn)[4]進(jìn)行，細(xì)胞融合、陽(yáng)性雜交瘤篩選過程參照參考文獻(xiàn)[5]進(jìn)行。單抗的大量制備與純化參照參考文獻(xiàn)[6]所述方法進(jìn)行。

1.5 chIL-18單克隆抗體的鑒定

1.5.1 單克隆抗體亞型的鑒定 按Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents說明書測(cè)定單克隆抗體亞型。

1.5.2 單克隆抗體親和力的鑒定 利用間接ELISA方法測(cè)定單克隆抗體的親和力，以1 μg/mL重組蛋白GST-chIL-18為包被抗原，將待檢測(cè)的單克隆抗體加入其中，二抗為HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，使用酶標(biāo)儀測(cè)定OD450處吸光值。數(shù)據(jù)的計(jì)算和分析參照參考文獻(xiàn)[7]的方法進(jìn)行。

1.5.3 單克隆抗體交叉反應(yīng)性的鑒定 以原核系統(tǒng)表達(dá)的His-chIL-18、His-chIL-1、His-chIL-10、His-IFN-β蛋白為抗原，一抗以制備好的2株chIL-18單克隆抗體和His-tag單克隆抗體，二抗使用HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG進(jìn)行Western blot試驗(yàn)，檢測(cè)單抗的交叉反應(yīng)性。

1.5.4 單克隆抗體抗原識(shí)別區(qū)域的鑒定 分別以chIL-18 N端第57位和第113位氨基酸為截點(diǎn)，構(gòu)建3個(gè)chIL-18的截短重組質(zhì)粒。以大腸埃希菌 BL21中誘導(dǎo)表達(dá)的截短蛋白為抗原，以制備的chIL-18單克隆抗體為一抗，使用Western blot方法鑒定2株單克隆抗體的氨基酸識(shí)別區(qū)域。

2 結(jié)果

2.1 chIL-18重組質(zhì)粒的構(gòu)建及蛋白表達(dá) 所構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定、基因測(cè)序，所得結(jié)果與預(yù)期一致(圖1A～1C)。重組質(zhì)粒在E.coliBL21中誘導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)SDS-PAGE分析(圖1D和1E)及Western blot鑒定(圖1F和1G)，確定His-chIL-18和GST-chIL-18重組蛋白均在預(yù)期目的蛋白大小處有表達(dá)。

圖1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與蛋白的表達(dá)

2.2 chIL-18單克隆抗體的制備與純化 免疫小鼠3次后，測(cè)定小鼠血清中chIL-18抗體效價(jià)達(dá)到1∶64 000。經(jīng)過細(xì)胞融合、陽(yáng)性雜交瘤篩選、亞克隆等過程，篩選到2株穩(wěn)定分泌chIL-18蛋白抗體的雜交瘤細(xì)胞株，將其分別稱作2A7和2G5。將篩選的雜交瘤細(xì)胞注射進(jìn)小鼠腹腔中，利用鹽析法和親和層析法對(duì)抽取后的腹水進(jìn)行純化，得到高純度的單克隆抗體(圖2)。

圖2 單克隆抗體的純化

2.3 chIL-8單克隆抗體的鑒定

2.3.1 單克隆抗體亞型的鑒定 使用 Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents 試劑盒檢測(cè)，結(jié)果顯示2株單克隆抗體的亞型均是IgG1型。

2.3.2 單克隆抗體親和力的鑒定 利用間接ELISA方法對(duì)單抗的親和力進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示2A7和2G5的親和力解離常數(shù)(Kd)分別為4.4×10-12和2.06×10-10(圖3)，表明親和力良好。

圖3 單克隆抗體2A7(A)和2G5(B)親和力的鑒定

2.3.3 單克隆抗體交叉反應(yīng)性的鑒定 使用Western blot檢測(cè)方法測(cè)定單抗對(duì)原核系統(tǒng)表達(dá)的其他細(xì)胞因子識(shí)別情況，結(jié)果顯示2株單抗都能識(shí)別His-chIL-18，但是不識(shí)別帶有His標(biāo)簽的chIL-1、chIL-10、chIFN-β的蛋白，無(wú)交叉反應(yīng)性(圖4)。

圖4 單克隆抗體交叉反應(yīng)性的鑒定

2.3.4 單克隆抗體抗原識(shí)別區(qū)域的鑒定 抗原為mchIL-18截短蛋白，一抗為制備單克隆抗體，使用Western blot方法確定單克隆抗體的氨基酸識(shí)別區(qū)域。結(jié)果顯示，2A7和2G5分別識(shí)別mchIL-18蛋白N端的第57～113位和第114～169位氨基酸(圖5)。

圖5 單克隆抗體抗原識(shí)別區(qū)的鑒定

3 討論

人和小鼠IL-18成熟蛋白均由157個(gè)氨基酸組成，無(wú)信號(hào)肽和糖基化位點(diǎn)，它們之間氨基酸同源性為60%[8-9]。chIL-18基因位于第24號(hào)染色體上，成熟蛋白由169個(gè)氨基酸組成，與人和小鼠等哺乳動(dòng)物相比肽鏈較長(zhǎng)，其功能與人IL-18相似[10]。經(jīng)分析，chIL-18與人IL-18和小鼠IL-18氨基酸同源性僅分別為34%和28%，因此推測(cè)chIL-18抗體不能識(shí)別哺乳動(dòng)物的IL-18蛋白。

獲得的2株雜交瘤均分泌高親合力抗體，而高親和力抗體識(shí)別不同抗原表位是制備夾心ELISA試劑盒的必備條件。抗原表位是由5～7個(gè)氨基酸組成的特殊化學(xué)基團(tuán)[11]，為了鑒定單抗的抗原識(shí)別區(qū)，本試驗(yàn)構(gòu)建了chIL-18的3個(gè)截短蛋白，分別為chIL-18的1～57 aa、58～113 aa和114～169 aa，結(jié)果表明這2株抗體可以識(shí)別不同的抗原表位，這為chIL-18雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法的建立和深入研究家禽先天性免疫炎癥反應(yīng)提供了有價(jià)值的手段。