陳文東，陳耀年，何玉鵬，葉文斌，蘇滿春，徐永平

(1.隴南師范高等?？茖W校農林技術學院，甘肅 成縣 742500；2.甘肅農業(yè)大學動物醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730000；3.西北農林科技大學動物醫(yī)學學院，陜西 楊凌 712100)

灰鶴(Grusgrus)屬鶴形目鶴科，又稱千歲鶴、番薯鶴、玄鶴等，為棲息在近水區(qū)域和沼澤地的大型遷徙涉禽，其為雜食性動物，常選擇草洲、稻田、淺水區(qū)和泥灘生境作為棲息地，以植物根莖、植物嫩芽、草籽、蒲公英、農作物種子等為食[1]。我國境內灰鶴的分布廣泛，東起黑龍江撫遠縣，西至新疆喀什地區(qū)，南到四川若爾蓋草原，北達內蒙古甘河流域，包括甘肅、吉林、內蒙古、青海、黑龍江、新疆和寧夏等，分布范圍在東經76°～135°，北緯32°20′～53°[2]。研究表明，甘肅地區(qū)灰鶴多為旅鳥或夏候鳥，少部分為冬候鳥，境內隴南山地、蘭州黃河、甘南高原、祁連山地、黃土高原和河西走廊的灰鶴為遷徙灰鶴[3]。

本試驗從隴南受傷的灰鶴泄殖腔內分離出1株大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)，對其進行生化試驗、16S rRNA基因測序和遺傳進化樹分析，并通過藥敏試驗和小鼠致病試驗對其進行耐藥性和致病性分析，為大腸桿菌引起灰鶴腹瀉的防治提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍培養(yǎng)基(EMB)、鮮血瓊脂培養(yǎng)基、革蘭染液，均購自青島海博生物技術有限公司；BGI D2 000 Plus DNA Ladder、BGI 2×Super PCR Mix，均購自武漢華大基因科技有限公司；細菌基因組提取試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司；瓊脂糖，購自廈門太陽馬生物工程有限公司；磁珠法PCR清潔試劑盒，購自上海碩美生物科技有限公司；18種藥敏紙片，購自湖南比克曼生物科技有限公司。PCR引物合成及測序由武漢華大基因科技有限公司完成。

1.2 主要儀器 PCR儀，伯樂生命醫(yī)學產品(上海)有限公司產品；高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司產品；凝膠成像系統，上海天能科技有限公司產品；超凈工作臺，浙江孚夏醫(yī)療科技有限公司產品；恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海躍進醫(yī)療器械有限公司產品；電熱式壓力蒸汽滅菌器，浙江新豐醫(yī)療器械有限公司產品。

1.3 樣品采集及細菌分離純化 用無菌棉簽采集灰鶴泄殖腔內容物，置于裝有無菌生理鹽水的離心管內，充分混勻后，離心，將上清液接種于麥康凱瓊脂平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h后，用接種環(huán)挑取紅色菌落接種于另一麥康凱瓊脂平板，繼續(xù)37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h，如此反復純化細菌5次，最后1次將菌株分別接種于鮮血瓊脂培養(yǎng)基和伊紅美藍培養(yǎng)基，觀察2種培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)特征，再挑取單菌落進行革蘭染色，顯微鏡下觀察細菌的染色特點和形態(tài)特征。

1.4 生化鑒定 參照《獸醫(yī)微生物學實驗教程》[4]中生化試驗培養(yǎng)基配制方法、操作步驟和結果判定方法，對分離菌進行生化鑒定，觀察并記錄結果。

1.5 16S rRNA基因PCR擴增及系統進化樹分析 常規(guī)提取分離菌株的基因組DNA，制備DNA模板并進行16S rRNA的PCR擴增，PCR所用引物序列見表1。PCR反應體系(30 μL)：1 μL DNA模板，15 μL 2×GC Buffer Ⅰ，2 μL引物(上、下游各1 μL)，最后加ddH2O至30 μL。PCR反應條件：96 ℃預變性5 min；96 ℃變性20 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min，于4 ℃保存。參照磁珠法PCR清潔試劑盒說明書純化PCR產物，純化后進行1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察條帶大小，回收PCR產物后寄至武漢華大基因科技有限公司進行測序，測序結果進行NCBI-BLAST比對并用鄰接法(Neighbor-Joining algorithm,N-J)構建系統發(fā)育樹。

表1 引物信息

1.6 藥敏試驗 用紙片擴散法(Kirby-Bauer，K-B)[5]對分離菌進行藥物敏感性試驗，參照美國臨床和實驗室標準化協會(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)標準，調整菌液濃度至5×108CFU/mL，將菌液均勻涂布于普通瓊脂平板，靜置片刻后，用無菌鑷子將18種常用抗菌藥藥敏紙片貼于平板表面，37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h，游標卡尺測量抑菌圈直徑，結果按耐藥(R)、敏感(S)和中介(I)判定。

1.7 致病性試驗 將12只BALB/c小鼠(體重18～22 g，雌雄各半)隨機分成試驗組和對照組，每組6只。試驗組腹腔注射細菌懸液(生理鹽水將菌液調配至濃度為2.12×109CFU/mL)，每只0.5 mL，對照組腹腔注射等量生理鹽水，觀察小鼠死亡情況，剖檢死亡小鼠，做剖檢記錄，并于病變明顯部位取樣分離病原菌。將剖檢小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟固定于4%多聚甲醛內，制作病理組織切片，觀察各器官的組織形態(tài)學變化。

2 結果

2.1 細菌分離純化 分離菌株可在鮮血培養(yǎng)基上生長，無溶血環(huán)；在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上生長為紅色菌落，菌落呈圓形、半透明，表面濕潤光滑，邊緣整齊；在伊紅美藍培養(yǎng)基上形成紫黑色菌落，菌落有金屬光澤，呈圓形，表面光滑濕潤，邊緣整齊。革蘭染色顯示菌體呈長短不一的短桿狀，兩端鈍圓，紅色，散在分布。

2.2 生化鑒定 分離菌株可發(fā)酵葡萄糖、乳糖、蔗糖和麥芽糖，對甘露醇、MR試驗和吲哚試驗呈陽性反應，對硝酸鹽、尿素酶、硫化氫、V-P試驗、檸檬酸鹽反應呈陰性反應。上述結果與《伯杰細菌鑒定手冊》[6]比對，初步判定分離菌株為大腸桿菌，命名為HH1。

2.3 16S rRNA基因PCR擴增及系統進化樹分析 將PCR產物進行1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，樣品均可得到明亮的大小為1 500 bp的電泳條帶(圖1)，與預期大小相符，符合測序條件。測序結果進行NCBI-BLAST比對，結果顯示，HH1與大腸桿菌的同源性達99%。用MEGA 7.0軟件構建系統進化樹，結果顯示，HH1與大腸桿菌(MT424913.1.seq、MH111527.1.seq、MK729001.1.seq、OK325789.1.seq、MW175585.1.seq)聚為一簇，親緣關系最近(圖2)。PCR擴增、系統進化樹分析結果結合生化鑒定結果，判定HH1為大腸桿菌。

圖1 分離菌16S rRNA的PCR擴增

圖2 分離菌16S rRNA序列的系統進化樹(N-J法)

2.4 藥敏試驗 HH1對青霉素、紅霉素、多西環(huán)素和四環(huán)素耐藥，對慶大霉素、頭孢氨芐、頭孢哌酮、頭孢唑林、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢呋辛、哌拉西林、氨芐西林、卡那霉素、鏈霉素、阿米卡星、米諾環(huán)素和多黏菌素敏感(表2)。

表2 藥敏試驗結果

2.5 致病性試驗 試驗組小鼠于腹腔接種細菌懸液8 h后開始出現死亡，至接種17 h后全部死亡，對照組小鼠未見異常。剖檢死亡小鼠，可見小鼠胃呈明顯臌氣狀，脾臟、腎臟出現輕微充血，肺臟有明顯淤血斑塊。從死亡小鼠的肺臟內分離病原菌，經鑒定為大腸桿菌，與攻毒菌株一致。病理組織切片觀察可見，死亡小鼠肺臟肺泡內有明顯的滲出，其余內臟組織未見明顯病理變化。

死亡小鼠內臟病理切片結果顯示，心臟未見明顯異常，可見縱切心肌纖維及部分心肌纖維斷面，心肌細胞和結締組織細胞胞核清晰可見，心肌內毛細血管未見擴張；肝臟中央靜脈和肝血竇內見少量紅細胞，其他結構未見明顯異常，肝細胞胞質呈粉紅色，邊界清晰，胞核呈圓形，藍紫色，核仁清晰可見，肝細胞以中央靜脈為中心呈索狀排列，形成不規(guī)則的肝索；脾臟未見明顯異常，組織切片觀察可見明顯的白髓和紅髓區(qū)，白髓內可見中央動脈及動脈周圍淋巴鞘，紅髓內含較多紅細胞，脾小梁清晰可見；肺臟切片可見呼吸性細支氣管和大部分肺泡內有明顯滲出，部分肺泡外周見少量炎性細胞，肺泡壁略增厚(圖3)；腎小管部分管腔及管腔之間有紅細胞聚集，腎小球未見明顯異常。

圖3 分離菌致死小鼠肺臟病理切片觀察(200×)

3 討論

灰鶴是國家二級保護野生動物，被列入《瀕危野生動植物種國際貿易公約》(CITES)附錄Ⅱ中[7]，據報道，截至21世紀初，我國分布的灰鶴總數為21 632～22 401只[3]。張成林等[8]對我國鶴類疾病發(fā)生情況進行統計分析，發(fā)現引起鶴類發(fā)病的主要原因為細菌感染、寄生蟲感染和營養(yǎng)因素，細菌感染因素中大腸桿菌為引起鶴類發(fā)病的主要病原菌之一。張偉木等[9]證實，引起3例幼灰鶴死亡的致病性大腸桿菌血清型為O111B14。此外，在孔雀、蓑羽鶴和丹頂鶴等珍稀飛禽中均有因感染大腸桿菌而死亡的病例，因此，大腸桿菌正嚴重威脅著野生飛禽的生命健康[10-11]，給保護珍稀野生飛禽工作帶來諸多挑戰(zhàn)。

藥敏試驗結果顯示，HH1對青霉素、紅霉素、多西環(huán)素和四環(huán)素具有耐藥性。Dou等[12]報道，國內東部地區(qū)的243株禽致病性大腸桿菌中，有98%的菌株對四環(huán)素耐藥；胡紫萌等[13]分離鑒定的禽致病性大腸桿菌對四環(huán)素的耐藥率更是高達100%；郭長明等[14]分離的大腸桿菌對多西環(huán)素的耐藥率為100%；彭嚴嚴等[15]分離的9株鵝源大腸桿菌全部含β-內酰胺類耐藥基因；陳文靜等[16]研究表明，鴨源致病性大腸桿菌100%對紅霉素耐藥，上述研究結果與本試驗分離大腸桿菌的耐藥性結果一致，這可能是灰鶴在采食或遷徙的過程中與家禽接觸產生的相互感染。野生飛禽幾乎不使用抗菌藥，但其所攜帶致病菌卻表現多重耐藥性(對3種或3種以上抗菌藥耐藥)，這可能會嚴重危害公共衛(wèi)生安全，值得高度重視[17]。本試驗為救治灰鶴的臨床用藥提供理論依據，并取得了較好的治療效果。

本試驗16S rRNA基因測序結果顯示，分離菌株與大腸桿菌同源性最高，達99%。系統發(fā)育樹分析結果顯示，本試驗分離菌株與大腸桿菌(MT424913.1.seq、MH111527.1.seq、MK729001.1.seq、OK325789.1.seq、MW175585.1.seq)為同一聚類，親緣關系最近，而MH111527.1.seq和OK325789.1.seq均為來自于人類腸道內的大腸桿菌，表明該分離菌株有成為人獸共患病病原體的潛在性。

本試驗小鼠致病性試驗結果顯示，分離菌株HH1主要引起小鼠肺泡腔內明顯滲出，而對其他器官(心、肝、脾、腎)無明顯致病作用。研究發(fā)現，禽類等多種動物的肺炎、敗血癥和腸炎等疾病多是因腸外致病性大腸桿菌引起的[18]，近年來大腸桿菌引起動物呼吸系統病變死亡的報道較多，有學者分別從水貂肺臟[19]、狐貍肺臟[20]及因患呼吸系統疾病而死亡的水貂肺臟[21]內分離出致病性大腸桿菌。由此可見，本試驗分離到的大腸桿菌極有可能為禽腸外致病性大腸桿菌，且該菌具有一定的器官侵害傾向。