張 志 高會霞 田岳飏 李硯峰 鄭立恒 李雅楠

1.石家莊市第五醫(yī)院檢驗科，河北石家莊 050021；2.河北省榮軍醫(yī)院檢驗科，河北保定 071000；3.河北省胸科醫(yī)院檢驗科，河北石家莊 050000；4.石家莊平安醫(yī)院實驗診斷學(xué)部，河北石家莊 050000

布魯氏菌病（以下簡稱“布病”）是由病原體布魯氏菌感染引起的人獸共患性傳染病，屬自然疫源性疾病。該病在全世界范圍內(nèi)廣泛分布，國外主要流行于地中海、中東、西亞、非洲及拉丁美洲等地區(qū)[1-6]，國內(nèi)多見于內(nèi)蒙古、西北、東北等半牧或純牧區(qū)[7-10]。在石家莊地區(qū)，布病多發(fā)于每年的3 月至7 月，發(fā)病人群以牛羊養(yǎng)殖戶和農(nóng)民為主[11]。近年來，隨著畜牧業(yè)的發(fā)展，布病的發(fā)病率有所上升，成為重要的公共衛(wèi)生問題之一[12]。

高變八聚體寡核苷酸指紋（hypervariable octameric oligonucleotide finger-prints，HOOF-Prints）基因分型法是以八個多態(tài)性可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列（variable number tandem repeats，VNTR）位點為基礎(chǔ)對布魯氏菌進(jìn)行分子流行病學(xué)研究的方法[13]，能夠提供菌株的親緣關(guān)系，有助于判斷新暴發(fā)或流行菌株的來源及在傳播進(jìn)程中的生物表型變異。本研究擬通過HOOFPrints 基因分型法[13-14]對石家莊市第五醫(yī)院收治布病確診患者的分離菌株進(jìn)行分子流行病學(xué)研究，以期了解本地主要流行菌株，為本地布病防控提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016 年1 月至2018 年12 月石家莊市第五醫(yī)院（以下簡稱“我院”）就診的145 例布病確診患者為研究對象。其中男110 例，女35 例；年齡15～85 歲，平均（48.6±15.9）歲。所有病例均為散發(fā)，病例間無明確的流行病學(xué)關(guān)聯(lián)。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)（20201013）。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《布魯氏菌病診療指南（試行）》[15]的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②持續(xù)或間歇性發(fā)熱超過7 d；③進(jìn)行布魯氏菌菌種檢測，陽性結(jié)果經(jīng)河北省疾控中心復(fù)核；④簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①來診前經(jīng)抗菌治療；②非石家莊市常住人口。

1.3 研究方法

1.3.1 樣本提取 采集布病患者的血液、骨髓、其他體液或排泄物等標(biāo)本，經(jīng)分離培養(yǎng)獲得布魯氏菌菌株。每一菌株對應(yīng)一個獨立的患者。

1.3.2 PCR 使用Qiagen 公司的MericonTMDNA Bacteria Kit 按照試劑說明書進(jìn)行操作。用無菌接種環(huán)刮取培養(yǎng)基上生長良好的菌落，置于含200 μl 細(xì)菌裂解液的2 ml 螺旋帽離心管中，擰緊螺帽，于振蕩器中充分振蕩5 min。100℃金屬浴10 min。待離心管恢復(fù)到室溫后，以13 000 g 離心5 min（離心半徑為10 cm），取上清液備用。參照文獻(xiàn)[13]進(jìn)行，針對8 個VNTR 位點分別設(shè)計8 對特異性引物（表1），由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。反應(yīng)體系共20 μl：DNA 2 μl，正向引物1 μl，反向引物1 μl，PCR mix 10 μl，ddH2O 6 μl。94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火40 s，72℃延伸30 s，35 個循環(huán)；72℃充分延伸10 min。PCR產(chǎn)物送北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序。

表1 8 個VNTR 位點正反向引物

1.4 構(gòu)建系統(tǒng)樹圖

使用BioNumerics 8.0 軟件中非加權(quán)組平均法生成系統(tǒng)樹圖。

2 結(jié)果

2.1 145 株布魯氏菌測序結(jié)果

145 株布魯氏菌每個位點重復(fù)次數(shù)不同，基本序列為AGGCAGT，在第一位和第二位堿基位點存在個體變異，如gGGCAGT、AaGCAGT，重復(fù)次數(shù)不等。見圖1。

圖1 部分VNTR 測序結(jié)果

2.2 145 株布魯氏菌的系統(tǒng)樹圖

本研究未發(fā)現(xiàn)石家莊地區(qū)有其他生物型別的布魯氏菌分布。從系統(tǒng)樹圖可以看出，同一生物種的布魯氏菌成簇聚集分布。145 株布魯氏菌分布在兩個大的分枝上，一枝以羊種（B.melitensis biover）為主，一枝以牛種（B.abortus biover）為主。羊種分枝占比最大，為90.34%（131/145）。其中，110 株與羊3 型進(jìn)化關(guān)系最近，占全部菌株的75.86%（110/145），其余21 株與羊2 型進(jìn)化關(guān)系最近，占全部菌株的14.48%（21/145）。牛種分枝占比小，為9.66%（14/145），其中牛1、2、4、6型分別占0.69%（1/145）、0.69%（1/145）、5.52%（8/145）和2.76%（4/145）。見圖2。

圖2 145 株布魯氏菌的系統(tǒng)樹圖

3 討論

布病起病隱匿，可以模擬多系統(tǒng)疾病，表現(xiàn)出廣泛的臨床多態(tài)性，為及時的臨床診斷帶來諸多困難，往往是排除各系統(tǒng)疾病后，由布病的細(xì)菌學(xué)和免疫學(xué)指標(biāo)提供診斷依據(jù)[16-19]。因此，進(jìn)行布病的流行病學(xué)研究能夠有助于了解本地布病的流行季節(jié)、人群分布、疾病特征等。分子流行病學(xué)能夠從基因水平闡明布病的進(jìn)化規(guī)律和流行趨勢，為布病的溯源和防控提供理論依據(jù)。

布魯氏菌常用的分型方法包括血清學(xué)檢測和生化檢測等方法。前者存在一定的假陰性或假陽性結(jié)果；后者操作繁瑣，只能在特殊檢測機(jī)構(gòu)進(jìn)行檢測。HOOF-Prints 基因分型法是以多態(tài)性VNTR 位點為基礎(chǔ)對布魯氏菌進(jìn)行分子流行病學(xué)研究的方法[13]，能夠提供菌株的親緣關(guān)系，有助于判斷新暴發(fā)或流行菌株的來源，以及在傳播進(jìn)程中的生物表型變異，為科學(xué)有效地控制布病的流行提供科學(xué)依據(jù)。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基于VNTR 基因分型研究被廣泛應(yīng)用于多種病原微生物的分型[20-22]。由于其高度的遺傳多態(tài)性，在分子流行病學(xué)研究中發(fā)揮著重要作用。目前，國內(nèi)對布魯氏菌分子流行病學(xué)的研究尚不多見，采用HOOF-Prints 基因分型法對石家莊地區(qū)布魯氏菌進(jìn)行基因分型的研究也尚未見報道，故本研究對石家莊地區(qū)145 株布魯氏菌進(jìn)行分子流行病學(xué)研究，以期了解本地的主要流行菌株及進(jìn)化關(guān)系。

布魯氏菌分為6 個生物種，19 個生物型（biover），分別為羊種（B.melitensis biover 1～3），牛種（B.abortus biover 1～7、9），豬種（B.suis biover 1～5），綿羊附睪種（B.ovis），沙林鼠種（B.neotomae）和犬種（B.canis）。在臨床上以羊、牛、豬種最為常見，其中羊種的致病力最強(qiáng)[23-26]。從系統(tǒng)樹圖看，石家莊地區(qū)布魯氏菌的流行生物種以羊種和牛種為主，羊種所占比例最大。其中，羊3 型和羊2 型為主要流行菌株，個別菌株呈聚集分布，牛種以牛4 型和牛6 型最常見，均為散在分布，這與我國布病疫情監(jiān)測結(jié)果相一致[27]。從菌株的進(jìn)化關(guān)系來看，石家莊地區(qū)布病呈散發(fā)流行，雖有個別菌株呈聚集分布，但在時空分布上并無關(guān)聯(lián)，提示羊型可能是石家莊地區(qū)的優(yōu)勢流行菌株，應(yīng)重點監(jiān)測其變化趨勢。菌株在進(jìn)化過程中存在一定的基因變異，但進(jìn)化距離相差不大，提示石家莊地區(qū)布魯氏菌呈多態(tài)性分布，但進(jìn)化進(jìn)程緩慢，仍處于可防可控的范圍內(nèi)。

HOOF-Prints 基因分型法對布魯氏菌的分辨率較高，能夠?qū)⒉煌木赀M(jìn)行區(qū)分，同時又能將同一生物型別菌株進(jìn)行聚類，在布病分子流行病學(xué)研究中具有優(yōu)勢。但是，本研究也存在一定的缺陷。第一，研究樣本較小，且僅為橫斷面研究，無法深入挖掘布魯氏菌的傳染來源和進(jìn)化過程；第二，本研究未將分子流行病學(xué)特征與患者的臨床特征、實驗室結(jié)果、耐藥情況等進(jìn)行相關(guān)分析。下一步，將進(jìn)行縱向研究，將分子流行病學(xué)與臨床相結(jié)合，為石家莊地區(qū)布病疫情防控提供理論依據(jù)。