彭嚴， 陳文章, 湯磊

(1.貴州神奇藥業(yè)有限公司， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學 醫(yī)藥衛(wèi)生管理學院， 貴州 貴陽 550004； 3.貴州醫(yī)科大學 貴州省化學合成藥物研發(fā)利用工程技術研究中心， 貴州 貴陽 550004)

癌癥一直是威脅人類健康和生命的重大疾病，據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構發(fā)布的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2020年全球癌癥新發(fā)病例1 920萬，死亡病例996萬，已成為僅次于心腦血管疾病嚴重威脅人類健康的第二大殺手[1]。人類一直不斷嘗試采用各種手段和方法來攻克癌癥。得益于科學技術的發(fā)展，臨床上除手術外，癌癥的治療也經(jīng)歷了放療、化療、小分子靶向藥物及免疫療法4大突破性進展。其中，化學藥物在腫瘤治中發(fā)揮著不可替代的作用，一直是抗腫瘤藥物研究的熱點[2]。天然藥物是人類預防和治療疾病的重要物質(zhì)來源，從中分離出有抗腫瘤活性的藥物或先導物一直是抗腫瘤藥物研究的重點(圖1)，如阿霉素和紫杉醇就是其中代表性的抗腫瘤藥物，并在臨床上得到了廣泛應用[3]。芫青科昆蟲斑蝥用于治療腫瘤，在我國有著悠久的歷史，藥學典籍《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有斑蝥治療癬瘡、潰瘍及癰疽等病癥的記載[4]。上世紀70年代左右研究人員從斑蝥中分離得到倍半萜類抗腫瘤活性成分-斑蝥素(圖2)，通過減少癌細胞對氨基酸的攝取，抑制蛋白質(zhì)合成，刺激巨噬細胞、淋巴細胞、多形核細胞產(chǎn)生白細胞介素，從而提高機體免疫力，增強機體對腫瘤細胞的殺傷作用達到治療目的[5]。但因斑蝥素的劇烈毒性及對泌尿系統(tǒng)嚴重刺激性，限制了其臨床應用[6-7]。

注：黑色方框為斑蝥酸鈉的化學結構。

上世紀70年代研究人員發(fā)現(xiàn)斑蝥經(jīng)氫氧化鈉水解后得到的斑蝥酸鈉(圖2)基本保留了斑蝥素的抗癌效果，同時毒性明顯降低，最為重要的是斑蝥酸鈉也可促進骨髓造血干細胞成熟、分化，對白細胞有升高作用，可減輕放化療對骨髓造血系統(tǒng)的副作用[7-8]。另外，斑蝥酸鈉還可刺激機體內(nèi)巨噬細胞、淋巴細胞及多核細胞產(chǎn)生白細胞介素，提高機體免疫力，增強機體對腫瘤細胞的殺傷作用[5,9]，以注射劑開發(fā)上市，但進入80年代因企業(yè)改制等原因，斑蝥酸鈉也銷聲匿跡。因此，將其重新開發(fā)用于臨床具有重大的社會意義。

圖2 斑蝥素及斑蝥酸鈉的化學結構

鑒于斑蝥酸鈉獨特的調(diào)節(jié)免疫及抗癌作用，上世紀90年代后期本課題組對斑蝥酸鈉進行了重新開發(fā)，完成了斑蝥酸鈉原料藥、斑蝥酸鈉注射液的技術開發(fā)，并在此基礎上開發(fā)了斑蝥酸鈉維生素 B6 注射液和斑蝥酸鈉片2個新產(chǎn)品；斑蝥酸鈉系列藥品共獲得注冊批件7個，獲授權中國發(fā)明專利5件，4個品種的藥品標準獲批為國家藥品標準；斑蝥酸鈉注射液、斑蝥酸鈉維生素B6注射液分別進入地方或全國醫(yī)保目錄；近年來2個產(chǎn)品在全國29個省市自治區(qū)400余家醫(yī)院使用，用量達8 500萬只，按療程使用的患者超過200萬人次；自上市以來，創(chuàng)造了極為顯著的經(jīng)濟效益。斑蝥酸鈉系列產(chǎn)品的技術開發(fā)為癌癥患者特別是肝癌、肺癌患者提供了更多的治療選擇，產(chǎn)品的生產(chǎn)和銷售助推企業(yè)不斷發(fā)展壯大。斑蝥酸鈉系列產(chǎn)品的研制開發(fā)還推動了多個省級及國家級化學藥研發(fā)平臺的建設，彌補了貴州省在化學藥研發(fā)技術力量方面的不足，社會效益顯著。

1 斑蝥酸鈉原料藥的制備

斑蝥酸鈉作為半合成化學抗腫瘤藥物，其合成原料斑蝥素主要提取自藥用斑蝥，包括黃黑小斑蝥和南方大斑蝥，含量約占蟲體的1.0%～1.5%[10]。斑蝥酸鈉的制備主要包括斑蝥素的提取和水解[9,11]。在從斑蝥蟲體中提取分離斑蝥素的過程中易殘留脂質(zhì)和肽類雜質(zhì)，如何確保提取物斑蝥素的純度是成功制備斑蝥酸鈉的關鍵和難點之一。針對這一問題，項目組通過考察和優(yōu)化不同組合、不同比例的有機溶劑，發(fā)現(xiàn)石油醚和乙醇混合溶劑中脫脂效果最佳；粗提物純化2次，再經(jīng)重結晶即可得到無色的斑蝥素精制品,且收率在原基礎上提高30%[12]。斑蝥素經(jīng)氫氧化鈉水解、精制即得斑蝥酸鈉純品。

2 斑蝥酸鈉制劑研發(fā)

為增強斑蝥酸鈉的治療效果，拓展在臨床抗腫瘤治療中的應用，項目組將斑蝥酸鈉與維生素B6配伍制成新的復方制劑，在保留斑蝥酸鈉抗腫瘤的同時，協(xié)同增強其刺激白細胞生成作用，以降低不良反應的發(fā)生[13]。臨床研究顯示，斑蝥酸鈉維生素B6注射液不但可用于肝癌、肺癌及乳腺癌等，還廣泛應用于骨轉移癌、惡性胸腔積液及宮頸癌等惡性腫瘤的治療[13]。為更好地滿足臨床應用的不同需求，項目組進一步研制開發(fā)了可用于口服的斑蝥酸鈉片[14]。斑蝥酸鈉維生素B6注射液和斑蝥酸鈉片均為全國獨家品種，拓展了斑蝥酸鈉制劑的治療疾病譜，為腫瘤患者提供了更多的治療選擇[15]。為進一步降低斑蝥酸鈉的副作用，提高治療效果，項目組于2013年公開了1種斑蝥酸鈉納米組合物及其制備方法，是將斑蝥酸鈉同一定比例的鹽酸嗎啉雙胍、聚丙烯酸樹脂Ⅱ及單硬脂酸甘油等混合，通過納米技術制備得到腸溶性納米微囊，該納米微囊可以避免斑蝥酸鈉轉化為斑蝥素，減少毒副反應[16]。隨后，項目組又報道了斑蝥酸鈉緩控釋制劑的制備方法，由該法制備的緩控釋制劑能減少服藥次數(shù)、維持血藥濃度平穩(wěn)、延長有效抗腫瘤作用時間及降低副作用[17-18]。為了改善斑蝥酸鈉的組織靶向性，項目組開發(fā)了1種磁性斑蝥酸鈉維生素B6復方制劑，該復方制劑由磁性斑蝥酸鈉脂質(zhì)體、磁性Fe3O4、磷脂及膽固醇等組成，可降低血管刺激性和毒副作用，提高藥物的穩(wěn)定性和用藥安全性[19]。

3 斑蝥酸鈉質(zhì)控方法研究

項目組采用氣相色譜法，準確測定了3種制劑中斑蝥酸鈉的含量，并增加鑒別、檢查等項目，建立了斑蝥酸鈉原料藥及制劑的質(zhì)量標準，這些標準均通過國家藥典委員會審定后成為了國家藥品標準[14]。在此基礎上，采用靈敏度和準確性更高的液質(zhì)聯(lián)用技術建立了斑蝥酸鈉的檢測方法，明確0.05 ng為產(chǎn)品臨床應用安全及有效性的上限。

4 斑蝥酸鈉抗腫瘤及機制的研究

斑蝥酸鈉分子量小，易進入細胞內(nèi)，組織分布廣，可通過多種機制起到抗癌作用[20-22]。斑蝥酸鈉抗癌機制早期研究表明，其抗癌機制主要有以下3方面：(1)減少癌細胞 DNA、RNA 的前體物質(zhì)攝入, 從而抑制核酸的代謝[20-21]；(2)抑制蛋白質(zhì)的合成[6,22]；(3)改變線粒體膜的通透性，強化磷酸化，降低環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP )-磷酸二酯酶活性，提高癌細胞內(nèi)cAMP同時改變能量代謝，進而抑制癌細胞[23-24]。

4.1 肝癌

桂尤勝等[7]報導斑蝥酸鈉在體外作用于人肝癌細胞系Bel-7402，48 h時使肝癌細胞凋亡(40.02±2.05)%，可將癌細胞生長阻斷于G2+M 期，除可誘導肝癌細胞的凋亡外，還能抑制肝癌細胞的生長與增殖；高偉等[25]認為斑蝥酸鈉也可將HepG2細胞阻斷在G2+M期，作用機制可能與下調(diào)Survivin表達和激活胱天蛋白酶3(Caspase-3)有關；張萌等[26]考察了不同濃度斑蝥酸鈉維生素B6注射液對人肝癌HepG2細胞的作用，發(fā)現(xiàn)斑蝥酸鈉維生素B6可顯著抑制HepG2細胞的增殖，誘導細胞凋亡，時間和濃度效應顯著，G0/G1期細胞比例顯著升高，而S期細胞比例顯著降低。以上研究表明，斑蝥酸鈉維生素B6可抑制人肝癌HepG2細胞的增殖，誘導其凋亡，并引發(fā)G0/G1期阻滯，考慮可能與斑蝥酸鈉維生素B6參與調(diào)控磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)通路的機制有關。此外，Luo等[27]也證實，在負載斑蝥酸鈉的微球用藥后，肝癌HepG2細胞同樣受阻滯于G0/G1期；吳曉慧等[28]將不同濃度的斑蝥酸鈉維生素B6作用于人肝癌SMMC-7721細胞株，發(fā)現(xiàn)細胞增殖和侵襲力均受到抑制，且呈濃度依賴性，細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,p-ERK1/2) 蛋白的表達降低且程度與藥物劑量相關。因此考慮斑蝥酸鈉維生素B6可能通過抑制 ERK1/2 蛋白磷酸化，對人肝癌SMMC-7721細胞的增殖、侵襲及轉移發(fā)揮抑制作用，這一結果也被黃富豪等[29]研究證實。此外，吳曉慧等[30]研究顯示，斑蝥酸鈉維生素B6注射液還能抑制肝癌細胞SMMC-7721中乙酰肝素酶的表達，該酶的抑制可能有助于抑制肝癌細胞SMMC-7721的增殖和侵襲。人肝癌組織中廣泛存在S100鈣結合蛋白A3(S100 calcium binding protein A3,S100A3)基因，該基因的高表達與腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉移密切相關。孫文藝[31]發(fā)現(xiàn)斑蝥酸鈉對HepG2 和 Huh7肝癌細胞系內(nèi)S100A3的表達具有明顯抑制作用，從而誘導肝癌細胞HepG2和Huh7的凋亡。這一結果隨后被Tao等[32]研究證實。徐文會等[33]考察了不同濃度的斑蝥酸鈉對體外培養(yǎng)人肝癌細胞HepG2的影響，檢測在濃度和作用時間兩個尺度下斑蝥酸鈉對細胞增殖及其對血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達水平的影響，發(fā)現(xiàn)肝癌細胞增殖受到明顯抑制，VEGF 的分泌水平一定程度降低，并呈時間-劑量依賴關系。推測制腫瘤血管生成是斑蝥酸鈉抑制肝癌生長的可能作用機制之一。

近年來大量臨床實驗結果顯示，斑蝥酸鈉有良好的抗肝癌效果[34]。值得注意的是，多個研究報道指出斑蝥酸鈉聯(lián)合其他療法治療肝癌效果可能更佳[35-37]。田秀嶺等[38]考察了斑蝥酸鈉維生素B6注射液聯(lián)合肝動脈化療栓塞(transcatheter arterial chemoembolization,TACE)治療中晚期肝癌患者的療效及不良反應，結果顯示聯(lián)合治療不僅可降低肝癌進展率和毒副反應發(fā)生率，還可提高患者的生活質(zhì)量和長期生存率；許耀燦等[39]對41例晚期肝癌患者的研究結果顯示，斑蝥酸鈉維生素B6注射液同步低劑量放療序貫奧沙利鉑+氟尿嘧啶+亞葉酸鈣(oxaliplatin + fluorouracil + leucovorin，F(xiàn)OLFOX4)方案能延長患者的總體生存周期，降低不良反應，值得進一步開展隨機對照臨床研究；朱小慧[40]結果表明，斑蝥酸鈉聯(lián)合化療治療可有效改善晚期非小細胞肺癌的免疫功能，降低血清腫瘤標志物水平，提升臨床療效。

4.2 肺癌

近年來，使用兼具提高免疫能力的斑蝥酸鈉聯(lián)合化療在治療肺癌，特別是非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)方面取得了較大進展[41]。多個獨立研究表明，斑蝥酸鈉聯(lián)合化療治療肺癌療效顯著，明顯優(yōu)于單純化療，斑蝥酸鈉聯(lián)合化療可減輕患者免疫功能損傷和炎癥反應，減少不良反應，延展患者生存周期[42-44]。房傳賜[45]報道了斑蝥酸鈉聯(lián)合順鉑/紫杉醇治療NSCLC晚期患者中的臨床療效，結果表明聯(lián)合治療化療組高于順鉑/白蛋白紫杉醇化療組，并相較于化療組對中醫(yī)證候改善更明顯；進一步研究顯示，斑蝥酸鈉可抑制人肺癌A549細胞的增殖和遷移能力，其分子機制可能與抑制PI3K/AKT/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號通路相關蛋白有關。隨后，該信號通路被王玲等[46]證實。陳奕霖等[47]評估了斑蝥酸鈉維生素B6注射液聯(lián)合化療對NSCLC患者免疫功能的影響，發(fā)現(xiàn)實驗組患者的血紅蛋白下降、白細胞下降、肝腎功能損傷以及惡心嘔吐等不良反應的發(fā)生率均低于對照組，表明斑蝥酸鈉維生素B6注射液聯(lián)合化療治療能夠調(diào)節(jié)NSCLC患者的免疫功能、提高患者的生活質(zhì)量，降低化療期間患者的不良反應；張芝庭等[48]報道斑蝥酸鈉產(chǎn)品在治療表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)野生型或轉移型NSCLC時效果良好，療效與多西他賽相當，且與其聯(lián)用效果更佳。

4.3 結腸癌

斑蝥酸鈉應用于輔助結腸癌的治療近年來也取得系列進展。劉通等[49]通過Meta分析斑蝥酸鈉維生素B6注射液聯(lián)合化療治療結直腸癌臨床效果，結果顯示聯(lián)合化療可明顯提高結直腸癌的近期療效，改善患者生活質(zhì)量，降低不良反應，效果優(yōu)于單純化療；劉倩[50]研究顯示，斑蝥酸鈉維生素B6注射液聯(lián)合奧沙利鉑和卡培他濱(olisaplatin + capecitabine,XELOX)方案治療晚期結腸癌臨床療效確切，可有效改善患者血清T淋巴細胞亞群情況以及卡氏評分，降低不良反應發(fā)生情況；史曉宇等[51]研究也表明，加用斑蝥酸鈉維生素B6注射液可顯著提高患者生活質(zhì)量，降低不良反應發(fā)生率，提高細胞免疫功能；李嫦娥等[52]研究也證實，斑蝥酸鈉維生素B6聯(lián)合腹腔鏡完整腸系膜切除術治療結腸癌效果顯著，可改善患者T淋巴細胞亞群陽性率，延長生存期；徐艷琴等[53]研究顯示斑蝥酸鈉呈劑量依賴形式抑制結腸癌SW480、HCT116細胞的增殖和誘導細胞凋亡，低、中、高劑量實驗組SW480、HCT116細胞中信號轉導和轉錄激活因子3(signal transducer and aactivator of transcription 3,STAT3)、磷酸化-STAT3(phosphorylated,p-STAT3)、B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,bcl-2)及髓細胞瘤病毒癌基因(myelocytomatosis viral oncogene,C-myc)蛋白相對表達量顯著降低，提示斑蝥酸鈉抑制結腸癌細胞的機制可能與STAT3信號通路蛋白表達降低有關。

4.4 骨肉瘤

Kong等[54]報道斑蝥酸鈉能以劑量依賴的方式抑制骨肉瘤MG-6細胞的增殖，還可抑制AKT的磷酸化，同時不抑制 mTOR、c-Jun氨基末端激酶(c-jun N-terminal kinase,JNK )或P38磷酸化，PI3K/AKT刺激劑類胰島素1號增長因子(insulin-like growth factors 1,IGF-1)逆轉了斑蝥酸鈉誘導的MG-63 細胞中的細胞周期停滯；Ji等[55]報道斑蝥酸鈉可以靶向作用于STAT3，阻止EGFR 抑制后STAT3 的反饋激活，緩解或消除EGFR抑制劑在治療骨肉瘤的耐藥問題；康肖等[56]研究表明，斑蝥酸鈉維生素B6抑制MG-63細胞增殖效果明顯，其機制可能與下調(diào)Survivin基因的表達有關。

4.5 胰腺癌

盡管胰腺癌的治療可以采用多種化學療法，但迄今為止尚未獲得最佳療效[57]。研究發(fā)現(xiàn)化療藥物治療胰腺癌容易產(chǎn)生耐藥問題，該問題的產(chǎn)生與胰腺癌顯示出高發(fā)生率的抑癌基因腫瘤蛋白p53(tumor protein p53,TP53)突變有關[58]；Liu等[59]研究顯示，斑蝥酸鈉可激活TP53基因功能，改善化療藥物所致的耐藥性，其以劑量依賴性方式降低胰腺癌細胞的活力，包括人原發(fā)性胰腺癌細胞PANC-1、AsPC-1、SW1990及BXPC-3，并誘導胰腺癌細胞凋亡和DNA損傷。斑蝥酸鈉的TP53激活作用可被TP53靶向的短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,shRNA)處理強烈消除[59]。此外，斑蝥酸鈉還通過JAK2-STAT3通路抑制腫瘤生長，該通路被shRNA-TP53抑制并與吉西他濱聯(lián)合觸發(fā)。斑蝥酸鈉聯(lián)合吉西他濱抑制胰腺腫瘤的離體和體內(nèi)生長效果強于吉西他濱，提示斑蝥酸鈉可能是一種具有良好抗胰腺癌功效的潛在藥物[59]。

4.6 乳腺癌

乳腺癌已取代肺癌成為全球第一大癌癥，乳腺癌的治療形勢嚴峻，但將斑蝥酸鈉應用于乳腺癌的治療取得了較好的效果。全昌銀等[60]研究顯示，斑蝥酸鈉維生素B6治療能提高晚期乳腺癌患者療效和生活質(zhì)量，降低不良反應的發(fā)生；郭曉鶯等[61]認為斑蝥酸鈉維生素B6輔助乳腺癌化療可抑制血清白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白細胞介素17(interleukin-17,IL-17)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)及巨噬細胞游走抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)的表達，改善患者的免疫功能，提高化療效果，從而延長患者的生存時間；趙瑞鵬等[62]也證實斑蝥酸鈉能提乳腺癌放療后機體免疫能力，斑蝥酸鈉聯(lián)合其它療法值得臨床推廣應用。

4.7 胃癌

胃癌是斑蝥酸鈉主要適應癥之一，其作用機制的研究也取得了一定的進展。梁楓[63]報道斑蝥酸鈉在體外具有抑制人胃癌細胞BGC823株和人食管癌細胞Eca109株增殖的作用，且對胃癌細胞的抑制作用強于對食管癌細胞的抑制，其機理可能與抑制Bcl-2有關，突變型TP53基因表達水平下降可能是斑鰲酸鈉抗腫瘤的機理之一；王珍[64]研究顯示，斑蝥酸鈉可明顯抑制裸鼠人胃癌移植瘤的生長及淋巴結轉移，其作用機制可能與下調(diào)VEGF-C及VEGFR-3蛋白的表達有關，從而降低腫瘤組織中淋巴管的生成和抑制胃癌淋巴轉移；單福新等[65]研究顯示，給予胃黏膜癌前病變大鼠模型進行斑蝥酸鈉注射液給藥處理后，與對照組相比，給藥組胃黏膜IL-8、炎癥因子TNF-α與C反應蛋白表達水平均有所降低，并有效抑制VEGF-C、VEGF-3蛋白的表達，這可能是其抑制胃癌的機制之一；蔣立新[66]研究結果表明，消化道腫瘤切除術后患者應用斑螯酸鈉維生素B6注射液可改善患者的免疫功能；甘云輝等[67]認為斑蝥酸鈉維生素B6注射液聯(lián)合奧沙利鉑加口服替吉奧(oxaliplatin+tegafur, gimeracil and oteracil porassium capsules，SOX)方案能改善晚期胃癌患者miR-18a、miR-34a表達水平和免疫細胞計數(shù)，改善SOX方案的治療效果，提高其治療安全性。斑蝥酸鈉在除上述癌癥治療中取得系列進展外，在賁門癌[68]、鼻咽癌[69]、膠質(zhì)母細胞瘤[70]以及惡性胸腔積液[71-72]治療方面也有顯著的療效。

5 總結與展望

斑蝥酸鈉在多種癌癥的臨床治療中顯示出積極的療效，尤其是聯(lián)合其他療法時能顯著降低毒副作用、提高腫瘤患者免疫能力及改善生活質(zhì)量。然而關于斑蝥酸鈉制劑的臨床應用，還需觀察總結更多符合循證醫(yī)學要求的高質(zhì)量臨床試驗，也需借助現(xiàn)代分子生物學手段深入探索作用機制。有理由認為，更多、更明確的斑蝥酸鈉作用機制的發(fā)現(xiàn)和闡述，將更好地支撐斑蝥酸鈉制劑在臨床上的合理應用。