江銀輝， 楊碧， 劉翔， 田詢， 禹文峰， 齊曉嵐， 吳昌學(xué)

(貴州醫(yī)科大學(xué) 地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 & 貴州省醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng) 550004)

真菌病毒是一類感染真菌的病毒，包含單分體病毒科(Totiviridae)、雙分病毒科(Partitiviridae)、巨大雙分核糖核酸病毒科(Megabirnaviridae)、產(chǎn)黃青霉病毒科(Chrysoviridae)、四分病毒科(Quadriviridae)、內(nèi)源核糖核酸病毒科(Endornaviridae)及呼腸孤病毒科(Reoviridae)共7個(gè)科[1-2]。大多數(shù)真菌病毒感染寄主是隱形的、且不引起明顯的癥狀，但是有些真菌病毒感染能夠引起寄主明顯的致病力減弱[3-4]。因此，這些能夠引起寄主真菌致病力衰退的真菌病毒具有控制真菌引起的危害的潛力[5]。黃曲霉(Aspergillusflavus，A.flavus)是自然界中廣泛存在的一種真菌，它可以感染許多農(nóng)業(yè)作物，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[6]；此外，黃曲霉污染的食品含有大量的黃曲霉毒素B，可引起急性黃曲霉病或者肝細(xì)胞的癌變[7]；同時(shí)黃曲霉也是一種條件致病菌，能夠感染免疫缺陷病人[6]。目前，只有抗真菌藥物用于治療曲霉病，但抗真菌藥物往往對(duì)人體有毒性，容易導(dǎo)致耐藥菌株產(chǎn)生[8]。因此，迫切需要一種新的治療策略來控制黃曲霉感染。真菌病毒已經(jīng)用于植物病原真菌的生物防治，如Cryphonectriaparasitica、Sclerotiniasclerotiorum、Helminthosporiumvictoriae、Botrytiscinerea[9]。隨著真菌病毒的報(bào)道越來越多，真菌病毒作為治療人類真菌感染的治療策略逐漸受到重視[10]，一些能導(dǎo)致黃曲霉弱致病力的真菌病毒具有治療黃曲霉感染的潛力[11]。在前期的研究中分離得到一種真菌病毒，對(duì)其進(jìn)行測(cè)序分析并命名為aspergillus flavus partitivirus 1(AfPV1)，能夠選擇性感染黃曲霉，使寄主發(fā)生表型衰退，但被真菌病毒AfPV1感染的黃曲霉對(duì)外界壓力的變化尚未知[12]，本研究對(duì)真菌病毒AfPV1感染對(duì)寄主黃曲霉抵抗外界壓力的影響進(jìn)行了系統(tǒng)研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1菌株和細(xì)胞株 真菌病毒AfPV1(NCBI GenBank No. MK344768，No. MK344769，No. MK344770)，LD-F1為脫病毒并具有嘧啶磺胺抗性標(biāo)記的黃曲霉菌株，用病毒AfPV1感染黃曲霉菌株LDF1獲得菌株LD-F1-b，以上黃曲霉菌株和病毒由本課題組前期獲得。小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，購(gòu)自美國(guó)美國(guó)菌種保藏中心ATCC公司。人肺泡上皮細(xì)胞A549，為貴州醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室王琴容老師惠贈(zèng)。

1.1.2主要試劑和儀器 超凈臺(tái)購(gòu)自蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司，生化培養(yǎng)箱購(gòu)自天津賽得利斯，冷凍高速離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)GENE公司，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、Triton-X100和嘧啶磺胺均購(gòu)自美國(guó)sigma公司，剛果紅(congo red，CR)、氯化鈉(NaCl)和過氧化氫(H2O2)均為國(guó)產(chǎn)分析純，酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢測(cè)試劑盒(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)購(gòu)于四正柏生物科技有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1孢子懸液制備 將黃曲霉菌株LD-F1、LD-F1-b分別接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA；馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g及瓊脂粉13 g，蒸餾水定容至1 000 mL，121 ℃滅菌20 min)平板上30 ℃培養(yǎng)5 d，用10 mL含0.1%吐溫80的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS；pH為7.2～7.4)沖洗PDA平板表面，然后用滅菌的擦鏡紙過濾掉菌絲，收取黃曲霉孢子，6 000 r/min離心10 min，棄上清，PBS(含0.1%吐溫80)再次重懸，6 000 r/min離心，通過血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求調(diào)整曲霉分生孢子的濃度。

1.2.2黃曲霉對(duì)細(xì)胞壁壓力、滲透壓、氧化壓力的測(cè)定 參考Takahashi-Nakaguchi等[13]的方法有改動(dòng)。對(duì)照組為不含任何試劑的酵母葡萄糖固體培養(yǎng)基(yeast glucose solid medium，YGM；酵母膏1 g，葡萄糖10 g，瓊脂15 g，蒸餾水定容至1 000 mL，121 ℃滅菌20 min)；細(xì)胞壁壓力組為含有100 mg/L、150 mg/L CR的YGM固體培養(yǎng)基；透壓壓力組為含有0.8 mol/L、1.2 mol/L、1.6 mol/L NaCl的YGM固體培養(yǎng)基；化壓力組為含有4 mmol/L、8 mmol/L H2O2的YGM固體培養(yǎng)基。取新鮮的孢子懸液10 μL(濃度為1×106CFU/mL)，分別接種到以上培養(yǎng)基的9 cm培養(yǎng)皿上，于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，每天測(cè)量菌落直徑并記錄。生長(zhǎng)抑制百分率=[(對(duì)照組直徑-實(shí)驗(yàn)組直徑)/對(duì)照組直徑]×100%。

1.2.3黃曲霉對(duì)紫外線耐受的測(cè)定 取30 μL黃曲霉孢子懸液(濃度為1×103CFU/mL)接種在含有沙氏固體培養(yǎng)基(sabouraud dextrose agar，SDA；蛋白胨10 g，葡萄糖40 g，瓊脂13 g，蒸餾水定容至1 000 mL，121 ℃滅菌20 min)的9 cm培養(yǎng)皿上，涂布均勻，并在60 W/cm2的紫外線下照射30 s、60 s、90 s、120 s、150 s、180 s，然后置于30 ℃培養(yǎng)箱中，黑暗條件下培養(yǎng)48 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，對(duì)照組不予照射。紫外殺傷率=[(對(duì)照組菌落數(shù)-紫外對(duì)照組菌落數(shù))/對(duì)照組菌落數(shù)]×100%。

1.2.4黃曲霉對(duì)巨噬細(xì)胞殺滅耐受的測(cè)定 參考Lau等[14]的方法有改動(dòng)。將巨噬細(xì)胞RAW264.7用完全培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清)重懸鋪在6孔培養(yǎng)板(4×105個(gè)細(xì)胞/孔)、37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h、棄培養(yǎng)液，用PBS洗2遍，每孔重新加入2 mL完全培養(yǎng)基。將制備黃曲霉分生孢子懸液加入上述6孔板中，每孔107個(gè)孢子，37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h、棄培養(yǎng)液，加PBS清洗細(xì)胞5次(清除細(xì)胞外未被黏附的分生孢子)，每孔重新加入2 mL完全培養(yǎng)基。將6孔板放回細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h，對(duì)照組不予培養(yǎng)，然后以終濃度為0.2% Triton-X100室溫處理20 min裂解細(xì)胞，梯度稀釋后接種于SDA培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)48 h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。孢子死亡百分率=[(0 h菌落數(shù)-1 h菌落數(shù))/0 h菌落數(shù)]×100%。

1.2.5黃曲霉分子孢子對(duì)人肺癌上皮細(xì)胞的黏附 參考Takahashi-Nakaguchi等[13]的方法有改動(dòng)。將人肺癌上皮細(xì)胞A549用用完全培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清)重懸鋪在6孔培養(yǎng)板(1×105細(xì)胞/孔)，37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞融合。將黃曲霉分生孢子懸液，于上述6孔板中加入102個(gè)孢子，37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h棄上清培養(yǎng)液，加PBS清洗細(xì)胞3次(除去細(xì)胞外未被黏附的分生孢子)，每孔加5 mL SDA培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)26 h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。孢子黏附百分率=(每孔菌落數(shù)/每孔加入102個(gè)孢子)×100%。

1.2.6黃曲霉對(duì)巨噬細(xì)胞一氧化氮(NO)和炎癥因子產(chǎn)生的影響 將巨噬細(xì)胞RAW264.7重懸鋪在6孔培養(yǎng)板(2×106細(xì)胞/孔)，37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，每孔加入4×106個(gè)孢子與細(xì)胞共培養(yǎng)6 h；陽(yáng)性對(duì)照為終濃度為1 mg/L的LPS處理，陰性對(duì)照為PBS處理。根據(jù)格里斯(Griess)反應(yīng)，使用NO檢測(cè)試劑盒檢測(cè)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的NO，ELISA試劑盒測(cè)定細(xì)胞因子IL-10、IL-6、IL-1β、IFN-β、TNF-α。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 對(duì)細(xì)胞壁壓力、滲透壓、氧化壓力的耐受

為了觀察AfPV1對(duì)寄主黃曲霉抗逆性的影響，測(cè)定了菌株LD-F1-b和LD-F1對(duì)細(xì)胞壁壓力、滲透壓、氧化壓力的耐受。研究發(fā)現(xiàn)，AfPV1感染使寄主黃曲霉對(duì)氧化脅迫和滲透脅迫的敏感性增強(qiáng)(圖1A和1B)，但對(duì)細(xì)胞壁脅迫抗性(CR)沒有顯著影響(圖1C)。

注：A～C為H2O2、Nacl、CR不同濃度的生長(zhǎng)抑制率；(1)與菌株LD-F1比較，P<0.001。

2.2 對(duì)紫外線的耐受能力

AfPV1的感染減弱了寄主黃曲霉對(duì)紫外線的耐受。與LD-F1相比，LD-F1-b對(duì)紫外線照射極為敏感，當(dāng)紫外線照射時(shí)間達(dá)到150 s時(shí)，LD-F1-b分生孢子的死亡率為100%(圖2)。

注：(1)與菌株LD-F1比較，P<0.001。

2.3 對(duì)巨噬細(xì)胞殺滅的耐受情況

巨噬細(xì)胞吞噬3 h后的黃曲霉的分生孢子死亡率均高于巨噬細(xì)胞吞噬1 h后的死亡率(圖3)。在巨噬細(xì)胞吞噬1 h或3 h后，LD-F1-b分生孢子的死亡率高于LD-F1。見圖3。結(jié)果表明病毒AfPV1降低了寄主黃曲霉抵抗巨噬細(xì)胞殺滅的能力。

注：(1) 與菌株LD-F1比較，P<0.05。

2.4 對(duì)人肺腺癌細(xì)胞的黏附能力

與LD-F1相比，LD-F1-b的分生孢子對(duì)肺上皮細(xì)胞A549的黏附能力降低(圖4)，提示病毒AfPV1降低了黃曲霉孢子的對(duì)肺上皮細(xì)胞的黏附能力。

注：(1)與菌株LD-F1比較，P<0.001。

2.5 對(duì)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO和細(xì)胞因子的影響

在巨噬細(xì)胞與黃曲霉分生孢子共培養(yǎng)后，檢測(cè)了巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO和細(xì)胞因子TNF-α、IFN-β、IL-1β、IL-6和IL-10。結(jié)果表明，陽(yáng)性對(duì)照組LPS刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生了TNF-α、IFN-β、NO、IL-1β、IL-6、IL-10，但黃曲霉不能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO和IL-6；LD-F1-b能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-10、IFN-β，而在LD-F1處理組沒有觀察到IL-10、IFN-β的產(chǎn)生。與LD-F1相比，LD-F1-b誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生更高濃度TNF-α。在IL-1β的檢測(cè)中，LD-F1誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β的濃度高于LD-F1-b。見圖5。

注：A～F分別為PBS、LPS、LD-F1-b、LD-F1對(duì)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO和細(xì)胞因子TNF-α、IFN-β、IL-1β、IL-6及IL-10的影響；(1)與陽(yáng)性對(duì)照LPS處理比較，P<0.001。

3 討論

隨著大量使用廣譜抗生素，對(duì)腫瘤患者進(jìn)行放療化療，以及對(duì)器官和干細(xì)胞移植的患者免疫抑制劑的使用，免疫力低下人群逐漸增多，導(dǎo)致曲霉病的發(fā)生率逐年升高，而黃曲霉是引起曲霉病的第二大病原菌[15]。而目前用于治療曲霉病的抗真菌藥物有限。目前，只有3類抗真菌藥物用于治療曲霉病，如多烯類(兩性霉素B)、三唑類(伊曲康唑、伏立康唑和泊沙康唑)和棘白菌素類(卡泊芬凈和米卡芬凈)[8,16]。此外，抗真菌藥物對(duì)人體有一定的毒性，而且隨著黃曲霉對(duì)現(xiàn)有抗真菌藥物產(chǎn)生耐藥性，使其治療效果不理想[16]。真菌病毒是一種能夠選擇性感染真菌的病毒，有些真菌病毒能夠引起寄主致病力衰退，因此具有治療病原真菌感染的潛力[10]。本研究前期得到一種能夠引起A.flavus表型嚴(yán)重衰退的真菌病毒AfPV1[12]。本研究中，真菌病毒AfPV1的感染使寄主黃曲霉對(duì)滲透脅迫、氧化脅迫和紫外線脅迫壓力更敏感。而這些脅迫壓力也被發(fā)現(xiàn)與黃曲霉的毒力因子密切相關(guān)[17]。由此，本研究推測(cè)真菌病毒AfPV1也可能降低寄主黃曲霉的致病力，具有一定的治療潛力。

免疫缺陷是曲霉感染的重要因素，而免疫系統(tǒng)抵抗感染主要是通過吞噬細(xì)胞來清除曲霉菌[18]。此外，真菌病毒AfPV1降低了分生孢子對(duì)宿主上皮細(xì)胞的黏附，降低了分生孢子被巨噬細(xì)胞殺滅的耐受。因此免疫細(xì)胞可能更容易清除掉真菌病毒AfPV1感染的黃曲霉孢子。在本研究中，真菌病毒AfPV1感染菌株的孢子誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生更高濃度TNF-α的趨勢(shì)，但其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。IL-6可以趨化和刺激中性粒細(xì)胞，通過自分泌和旁分泌方式刺激細(xì)胞生長(zhǎng)、促進(jìn)細(xì)胞分化，而曲霉上調(diào)IL-6 mRNA水平具有劑量效應(yīng)依賴[19]。本研究中，黃曲霉孢子處理組未檢測(cè)到IL-6，可能為共培養(yǎng)的孢子劑量偏低，刺激量不足。有研究表明，炎癥因子IL-1β在煙曲霉的感染過程中，雖然沒有直接參與對(duì)孢子和菌絲的清除和殺滅，但參與炎癥和免疫反應(yīng)相關(guān)細(xì)胞的分化中發(fā)揮著重要的作用，其中包括與抗原協(xié)同作用、促進(jìn)B 細(xì)胞生長(zhǎng)和分化、吸引中性粒細(xì)胞、引起炎癥介質(zhì)釋放等[20]。IL-10是免疫統(tǒng)中抗炎的細(xì)胞因子，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫平衡[21]。在過敏性支氣管肺曲霉病中，IL-10可以抑制炎癥反應(yīng)，發(fā)揮了抗炎、抗免疫的保護(hù)性作用，防止過度的炎性損傷[22]。黃曲霉感染后，本研究只檢測(cè)到低劑量的NO。在細(xì)菌感染過程中，IFN-β對(duì)宿主是有害的，其限制了產(chǎn)生保護(hù)性IL-17的T細(xì)胞反應(yīng)的發(fā)展[23]。有結(jié)果表明，IFN的表達(dá)水平不僅受真菌活性程度的影響，而且可能與免疫反應(yīng)的程度有關(guān)。在本研究中，巨噬細(xì)胞易于產(chǎn)生TNF-α炎癥因子，但真菌病毒AfPV1感染黃曲霉會(huì)導(dǎo)致巨噬細(xì)胞產(chǎn)生更多的TNF-α。