孟楨楨， 趙偉， 趙昂， 黃暉， 廉凱， 曹園**

(1.國藥葛洲壩中心醫(yī)院 骨外科, 湖北 宜昌 443002； 2.湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院 & 襄陽市中心醫(yī)院 骨科， 湖北 襄陽 441021)

骨肉瘤(osteosarcoma，OS)是一種進(jìn)展迅速，轉(zhuǎn)移性高和預(yù)后不良的原發(fā)惡性腫瘤[1-2]?，F(xiàn)階段OS的診斷和治療均有了較大改善，但由于手術(shù)切除后腫瘤轉(zhuǎn)移頻繁和腫瘤復(fù)發(fā)，OS的治愈率仍不樂觀[3-4]。因此，闡明OS發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，尋找新的生物標(biāo)志物勢在必行。微小RNA(microRNA,miRNA/miR)是一類高度保守的內(nèi)源性非編碼RNA，也是OS等多種腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[5-6]。既往研究表明，miR-410通過Wnt /β-連環(huán)蛋白(β-catenin)信號通路，并靶向dickkopf相關(guān)蛋白1，在結(jié)直腸癌細(xì)胞中作為癌基因發(fā)揮作用[7]；miR-410-3p還可通過調(diào)控第10號染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號通路促進(jìn)前列腺癌進(jìn)展[8]；miR-410在結(jié)直腸癌中高表達(dá)，促進(jìn)結(jié)直腸癌的遷移、侵襲和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，來促進(jìn)癌癥進(jìn)展[9]。資料顯示，趨化素樣因子超家族成員3(CKLF like MARVEL transmembrane domain containing 3,CMTM3)能抑制腫瘤的發(fā)生與侵襲，是一種腫瘤抑制因子[10]。CMTM3在胃癌組織中下調(diào)表達(dá)[11]，miR-135b-5p通過靶向CMTM3促進(jìn)胃癌進(jìn)展[12]。然而miR-410-3p和CMTM3在OS中的表達(dá)與作用，以及miR-410-3p是否通過靶向CMTM3調(diào)控OS細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡，這方面的研究尚不多見。因此，本研究分析miR-410-3p和CMTM3與64例OS患者臨床病理特征的關(guān)系，并通過體外培養(yǎng)OS細(xì)胞分析miR-410-3p的表達(dá)情況，利用噻唑藍(lán)溴化四唑(thiazolyl blue tetrazolium bromide,MTT)、流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)檢測miR-410-3p對OS細(xì)胞增殖和凋亡的影響，分析其對CMTM3的調(diào)控，探索miR-410-3p作用的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1臨床組織樣本 選取2017年1月—2018年12月收治的64例OS患者的OS組織及瘤旁組織標(biāo)本，要求患者均無其他惡性腫瘤、放療或化療病史，向所有患者或<18歲患者的法定監(jiān)護(hù)人提供書面知情同意書。所有活檢標(biāo)本立即放入液氮中，-80 ℃貯存。

1.1.2細(xì)胞來源 OS細(xì)胞系MG63、U2-OS、OS187及健康人成骨細(xì)胞hFOB1.19購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.1.3主要試劑與儀器miR-410-3p、anti-miR-410-3p、空載體(pcDNA)、pcDNA-CMTM3、si-NC、CMTM3抑制物(si-CMTM3,廣州銳博生物)，TRIzol、Lipofectamine 2000及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Invitrogen)，實(shí)時定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR)試劑盒(美國ThermoFisher)，MTT及放射免疫沉淀法(radio-immunoprecipitation assay,RIPA)裂解液(美國Sigma)，Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(江蘇凱基生物)，CMTM3蛋白抗體(美國Abcam)，細(xì)胞周期蛋白D1(cyclinD1)、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2,Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)及β肌動蛋白(β-actin)蛋白抗體(美國Cellular Signaling Technology)；BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國Beckman);Spectra Max M5酶標(biāo)儀(德國QIAGEN)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理 MG63、U2-OS、OS187及hFOB1.19細(xì)胞培養(yǎng)于杜氏改良依格爾(duchenne's modified eagle's medium，DMEM)高糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)、37 ℃的5%CO2培養(yǎng)箱。實(shí)驗(yàn)分為anti-miR-410-3p組(轉(zhuǎn)染anti-miR-410-3p)、anti-miR-con組(轉(zhuǎn)染anti-miR-con)、未轉(zhuǎn)染組 (空白培養(yǎng)細(xì)胞，NC)、pcDNA-CMTM3組(轉(zhuǎn)染pcDNA-CMTM3)、pcDNA組(轉(zhuǎn)染pcDNA)、anti-miR-410-3p+si-con組(共轉(zhuǎn)染anti-miR-410-3p與si-con)、anti-miR-410-3p+si-CMTM3組(共轉(zhuǎn)染anti-miR-410-3p與si-CMTM3)。MG63細(xì)胞轉(zhuǎn)染時，于6孔板中接種1×104個細(xì)胞。根據(jù)Lipofectamine 2000試劑操作規(guī)程，將anti-miR-410-3p、pcDNA-CMTM3、si-CMTM3及各自陰性對照轉(zhuǎn)染入70%融合的MG63細(xì)胞，培養(yǎng)48 h備用。

1.2.2qPCR檢測miR-410-3p和CMTM3 mRNA表達(dá) 為檢測miR-410-3p和CMTM3 mRNA表達(dá)，使用TRIzol試劑提取OS組織、瘤旁組織與hFOB1.19、MG63、U2-OS、OS187細(xì)胞及各組MG63細(xì)胞總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，U6為參照，20 μL反應(yīng)體系為cDNA 2 μL、SYBR Green Mix 10 μL、上下游引物各0.5 μL，無菌水補(bǔ)足；反應(yīng)條件為95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s，40個循環(huán)后，進(jìn)行qPCR反應(yīng)。miR-410-3p正向引物序列5′-GGTTGTCTGTGATGAGTTCGC-3′，反向引物序列5′- CTGAAAACAGGCCATCTGTGT-3′；CMTM3正向引物序列5′-TGGCCAAGAAAGTCGCAAGA-3′，反向引物序列5′- GAAACCCGGGTCGCTGTCTC-3′。收集Ct值，根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算miR-410-3p和CMTM3 mRNA表達(dá)量。

1.2.3雙螢光素酶活性檢測 利用starBase(http://starbase.sysu.edu.cn/)軟件預(yù)測出miR-410-3p與CMTM3 3′UTR部分堿基可以互補(bǔ)配對。分別構(gòu)建含有miR-410-3p結(jié)合位點(diǎn)的野生型(wild type，WT)CMTM3(WT-CMTM3)和突變型(mutant type，MUT)CMTM3(MUT-CMTM3)的報(bào)告基因載體(由廣州銳博生物構(gòu)建)，與miR-410-3p或anti-miR-410-3p共轉(zhuǎn)染，48 h后測定雙螢光素酶活性。

1.2.4MTT法檢測細(xì)胞增殖 按1.2.1項(xiàng)下對數(shù)期生長的anti-miR-410-3p組、anti-miR-con組、NC組、pcDNA-CMTM3組、pcDNA組、anti-miR-410-3p+si-con組、anti-miR-410-3p+si-CMTM3組細(xì)胞，于96孔板中接種MG63細(xì)胞1×104個，培養(yǎng)至24 h、48 h、72 h時，于37 ℃將細(xì)胞與5 g/L MTT溶液100 μL反應(yīng)4 h，37 ℃與二甲基亞砜200 μL于搖床反應(yīng)10 min，酶標(biāo)儀讀取各孔細(xì)胞490 nm波長處的吸光度值(optical density，OD490 nm)值。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 按1.2.1項(xiàng)下對數(shù)期生長的anti-miR-410-3p組、anti-miR-con組、NC組、pcDNA-CMTM3組、pcDNA組、anti-miR-410-3p+si-con組、anti-miR-410-3p+si-CMTM3組細(xì)胞，根據(jù)Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒操作規(guī)程，將1×103個/L MG63細(xì)胞懸浮于緩沖液500 μL，分別于室溫避光條件下與Annexin V-FITC 5 μL、碘化丙啶(propidiumIodide，PI)5 μL染色液混勻；15 min后于流式細(xì)胞儀測量MG63細(xì)胞凋亡。

1.2.6Western blot檢測目的蛋白表達(dá) 取OS組織、瘤旁組織hFOB1.19、MG63、U2-OS、OS187細(xì)胞及各組MG63細(xì)胞anti-miR-410-3p組、anti-miR-con組、NC組、pcDNA-CMTM3組、pcDNA組、anti-miR-410-3p+si-con組、anti-miR-410-3p+si-CMTM3組細(xì)胞，MG63細(xì)胞中總蛋白用RIPA裂解液提取，10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)和轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯膜、5%脫脂奶粉中封閉，4 ℃與CMTM3、CyclinD1、Bcl-2、Bax及內(nèi)參β-actin抗體(1 ∶1 000稀釋)等一抗孵育12 h；次日用Tris-HCl-Tween緩沖液洗膜10 min，洗3次；加二抗(1 ∶5 000稀釋)，37 ℃孵育1 h；TBST洗膜10 min，洗3次；蛋白條帶通過化學(xué)發(fā)光液顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-410-3p和CMTM3的表達(dá)

qPCR和Western blot檢測結(jié)果表明，與瘤旁組織比較，OS組織內(nèi)miR-410-3p表達(dá)量升高，CMTM3 mRNA和蛋白表達(dá)量降低(P<0.05)，見圖1。

注：A、B分別為miR-410-3p、CMTM3 mRNA的表達(dá)，C、D分別為CMTM3蛋白的Western blot檢測結(jié)果和相對表達(dá)結(jié)果；(1)與瘤旁組織比較，P<0.05。

2.2 miR-410-3p、CMTM3表達(dá)與OS患者臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

結(jié)果表明，miR-410-3p和CMTM3與OS患者的腫瘤Enneking分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.01)，但均與患者的性別、年齡、腫瘤大小無相關(guān)性(P>0.05)。見表1。

表1 miR-410-3p和CMTM3表達(dá)與OS患者臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

2.3 MG63、U2-OS、OS187及hFOB1.19細(xì)胞中miR-410-3p和CMTM3的表達(dá)

qPCR檢測miR-410-3p表達(dá)結(jié)果顯示，與健康人成骨細(xì)胞hFOB1.19比較，OS細(xì)胞系MG63、U2-OS、OS187中miR-410-3p表達(dá)升高(P<0.05)；選擇差異最顯著的MG63細(xì)胞展開后續(xù)研究，qPCR和Western blot檢測結(jié)果表明，與hFOB1.19細(xì)胞比較，MG63、U2-OS、OS187細(xì)胞內(nèi)CMTM3 mRNA和蛋白表達(dá)量降低(P<0.05)。見圖2。

注：A、B分別為miR-410-3p、CMTM3 mRNA的相對表達(dá)結(jié)果，C、D分別為CMTM3蛋白的Western blot檢測結(jié)果和相對表達(dá)結(jié)果；(1)與hFOB1.19組比較，P<0.05。

2.4 miR-410-3p靶向調(diào)控CMTM3的表達(dá)

生物信息學(xué)預(yù)測miR-410-3p的靶基因CMTM3(圖3A)。雙螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖3B)，與miR-con組相比，miR-410-3p組內(nèi)WT-CMTM3螢光素酶相對活性降低(P<0.05)，但對MUT-CMTM3螢光素酶相對活性無影響(P>0.05)；Western blot檢測CMTM3蛋白表達(dá)結(jié)果表明(圖3C和3D)，與miR-con組相比，miR-410-3p組內(nèi)CMTM3蛋白表達(dá)量降低(P<0.05)；與anti-miR-con組相比，anti-miR-410-3p組內(nèi)CMTM3蛋白表達(dá)量升高(P<0.05)。

注：A為miR-410-3p與CMTM3的3′UTR靶向結(jié)合，B為miR-410-3p與CMTM3的雙螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)，C、D為CMTM3蛋白的Western blot檢測結(jié)果和相對表達(dá)結(jié)果；(1)與miR-con組比較，P<0.05；(2)與anti-miR-con組比較，P<0.05。

2.5 抑制miR-410-3p表達(dá)對OS MG63細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的影響

與anti-miR-con組相比，miR-410-3p組內(nèi)miR-410-3p表達(dá)量、48 h和72 h細(xì)胞活性、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達(dá)量降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)量升高(P<0.05)。見圖4。

注：A為miR-410-3p相對表達(dá)量，B為抑制miR-410-3p表達(dá)對MG63細(xì)胞增殖的影響，C為流式細(xì)胞術(shù)檢測抑制miR-410-3p表達(dá)的MG63細(xì)胞凋亡情況，D為抑制miR-410-3p表達(dá)對MG63細(xì)胞凋亡率的影響，E、F分別為MG63細(xì)胞中Cyclin D1、Bcl-2、Bax蛋白的Western blot檢測結(jié)果和相對表達(dá)結(jié)果；(1)與anti-miR-con組比較，P<0.05。

2.6 CMTM3過表達(dá)對OS MG63細(xì)胞增殖、凋亡的影響

與pcDNA組相比，pcDNA-CMTM3組內(nèi)CMTM3、Bax蛋白表達(dá)量、細(xì)胞凋亡率增加(P<0.05)，48 h和72 h的細(xì)胞活性、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達(dá)量降低(P<0.05)。見圖5。

注：A、B分別為CMTM3、Cyclin D1、Bcl-2及Bax蛋白的Western blot檢測結(jié)果和相對表達(dá)結(jié)果，C、D分別為細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡；(1)與pcDNA組比較，P<0.05。

2.7 抑制CMTM3表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制miR-410-3p表達(dá)對OS MG63細(xì)胞增殖、凋亡的作用

與anti-miR-con組相比，miR-410-3p組內(nèi)CMTM3、Bax蛋白表達(dá)量、細(xì)胞凋亡率增加(P<0.05)，48 h和72 h的細(xì)胞活性、Cyclin D1及Bcl-2蛋白表達(dá)量降低(P<0.05)；與anti-miR-410-3p+si-con組相比，anti-miR-410-3p和si-CMTM3組內(nèi)CMTM3、Bax蛋白表達(dá)量、細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)，48 h和72 h的細(xì)胞活性、Cyclin D1及Bcl-2蛋白表達(dá)量增加(P<0.05)。見圖6。

注：A為CMTM3、Cyclin D1、Bcl-2和Bax蛋白的Western blot檢測結(jié)果和相對表達(dá)結(jié)果，C、D分別為細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡；(1)與anti-miR-con組比較，P<0.05；(2)與anti-miR-410-3p+si-con組比較，P<0.05。

3 討論

越來越多的證據(jù)表明，miRNA異常表達(dá)與各種腫瘤密切相關(guān)，包括OS[13-14]。本研究分析顯示，miR-410-3p與OS Enneking分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，提示miR-410-3p可能是腫瘤發(fā)生發(fā)展中重要的調(diào)節(jié)因子；同時miR-410-3p在OS細(xì)胞系MG63、U2-OS、OS187中表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步的功能實(shí)驗(yàn)表明miR-410-3p參與OS進(jìn)展。有研究顯示，miR-410-3p在不同腫瘤中扮演著致癌基因或抑癌基因的角色，發(fā)揮著雙重作用[15-16]。在促性腺瘤細(xì)胞和促皮質(zhì)激素腺瘤細(xì)胞中miR-410-3p表達(dá)上調(diào)，但在促生長腺瘤細(xì)胞中起抑癌作用[17]；前列腺癌組織和細(xì)胞系中的miR-410-3p表達(dá)上調(diào)，下調(diào)的miR-410-3p抑制細(xì)胞增殖、遷移，并加速細(xì)胞凋亡，miR-410-3p具有致癌功能[8]。而miR-410-3p在鼻咽癌和非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)下調(diào)，miR-410-3p過表達(dá)可以減弱非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖，miR-410-3p表現(xiàn)出抑癌功能[18-19]。miR-410-3p在膠質(zhì)瘤組織中下調(diào)，直接靶向Ras相關(guān)蛋白1A(ras-related protein 1A,RAP1A)在膠質(zhì)瘤中發(fā)揮腫瘤抑制作用[18]。本研究結(jié)果與Zhang等[8]的報(bào)道相同，OS細(xì)胞MG63中抑制miR-410-3p表達(dá)具有抗增殖和促凋亡的作用，說明miR-410-3p可能充當(dāng)致癌因子影響OS的發(fā)生發(fā)展過程。

CMTM3與多種腫瘤的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。例如，與匹配的非腫瘤組織相比，食管鱗癌組織中CMTM3 mRNA和CMTM3蛋白表達(dá)水平分別降低82.5%和75%，并且CMTM3低表達(dá)患者的生存時間明顯短于高表達(dá)患者[19]。本研究結(jié)果也表明CMTM3 mRNA和CMTM3蛋白在OS細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，提示CMTM3可能在OS進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。Lu等[12]報(bào)道指出，CMTM3作為胃癌的腫瘤抑制因子，CMTM3過表達(dá)時減弱胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞周期進(jìn)程，并促進(jìn)SGC-7901細(xì)胞凋亡，起著至關(guān)重要的作用；Li等[20]研究顯示，CMTM3可能是預(yù)防和/或治療肝細(xì)胞癌侵襲、轉(zhuǎn)移的潛在分子靶點(diǎn)，過表達(dá)CMTM3在體外明顯抑制肝細(xì)胞癌的細(xì)胞增殖、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)過程，在體內(nèi)減弱Balb/c裸鼠腫瘤的生長。然而CMTM3在OS中的作用尚不清楚。本研究中CMTM3與OS Enneking分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在明顯的相關(guān)性，CMTM3過表達(dá)抑制OS細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，與之前CMTM3在其他類型癌癥中作用的結(jié)果一致，為CMTM3作為抑癌基因影響腫瘤發(fā)生發(fā)展提供了新的證據(jù)。

已有證據(jù)表明，miRNA可能通過靶向調(diào)控其下游靶基因，影響癌癥等疾病的發(fā)生發(fā)展過程[21-22]。例如，miR-410-3p通過靶向Smad7促進(jìn)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心臟肥大[23]。本研究通過starBase分析的結(jié)果，將CMTM3鑒定為miR-410-3p在OS細(xì)胞中的直接靶標(biāo)，雙螢光素酶測定進(jìn)一步證實(shí)miR-410-3p通過直接結(jié)合CMTM3 3，UTR區(qū)域抑制CMTM3表達(dá)；抑制miR-410-3p表達(dá)對MG63細(xì)胞增殖、Cyclin D1及Bcl-2蛋白表達(dá)的抑制效果及其對MG63細(xì)胞凋亡、Bax蛋白表達(dá)的促進(jìn)效果均被抑制CMTM3表達(dá)所逆轉(zhuǎn)，說明miR-410-3p通過靶向調(diào)控CMTM3表達(dá)促進(jìn)OS進(jìn)程。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示了miR-410-3p失調(diào)對OS細(xì)胞增殖、凋亡的生物學(xué)意義和影響，miR-410-3p在OS細(xì)胞中高表達(dá)，通過靶向CMTM3調(diào)控OS細(xì)胞的增殖和凋亡，為OS的臨床診斷提供了潛在生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。