龍黎， 羅新華， 張茜

(貴州省人民醫(yī)院 感染科, 貴州 貴陽 550002)

研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)乙型肝炎病毒(HBV)進(jìn)入宿主肝細(xì)胞內(nèi)時，核衣殼中松弛環(huán)狀DNA(rcDNA)將易位到肝細(xì)胞核內(nèi),形成游離的閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)，成為HBV前基因組RNA合成的模板[1]。在肝細(xì)胞胞漿中，HBV可以重新合成rcDNA再次進(jìn)入肝細(xì)胞細(xì)胞核，以此來維持肝細(xì)胞中cccDNA池的穩(wěn)定性[2]。因此，對cccDNA進(jìn)行研究可為乙肝抗病毒治療提供新的方向[3]。目前上市并用于抗乙肝病毒的藥物有2類：一類是核苷(酸)類似物(NAs)，它能有效抑制病毒復(fù)制及肝臟炎癥活動，但對于cccDNA的作用較小[4-5]；另一類是干擾素類(IFNs)，在治療時的血清學(xué)轉(zhuǎn)換率高于NAs，但仍不能完全實(shí)現(xiàn)功能性治愈，并且藥物不良反應(yīng)較多，在肝硬化失代償期、嚴(yán)重肝功不全、肺心腎等重要臟器功能障礙、自身免疫性疾病等患者禁用[6]，即便采取不同方式聯(lián)合或序貫治療，功能性治愈率仍相當(dāng)有限。CRISPR/Cas9是細(xì)菌的一種免疫防御系統(tǒng)，其主要作用是抵抗外源性入侵[7]。CRISPRRNA與反式激活rRNA可以通過堿基互補(bǔ)配對原則形成核蛋白復(fù)合物，引導(dǎo)Cas9蛋白對與crRNA配對的DNA靶點(diǎn)進(jìn)行剪切[8]。有研究發(fā)現(xiàn)HBVcccDNA中的preS1段對于產(chǎn)生HBsAg起到關(guān)重要作用[4]，因此，本研究以人肝癌HepAD38或HepG2.2.15細(xì)胞為研究對象，采用CRISPER/Cas9基因編輯技術(shù)對HBVcccDNA中的preS1段進(jìn)行基因敲除后、使用傳統(tǒng)抗病毒藥物及免疫調(diào)節(jié)劑處理細(xì)胞，觀察其抗病毒活性及細(xì)胞中HBV復(fù)制情況，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 研究材料

人肝癌HepAD38或HepG2.2.15細(xì)胞系由重慶醫(yī)科大學(xué)病毒性肝炎研究所饋贈，杜爾貝科改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清、雙抗購買自美國GIBCO公司，胰蛋白酶和DMSO購自 Hyclone 公司，DAPI(4′,6-二脒基-2-苯基吲哚)及 lipofectamine 2000購買自 Invitrogen 公司，質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，轉(zhuǎn)染級質(zhì)粒提取試劑盒購自 Promega 公司，F(xiàn)lag單克隆抗體購自Stratagene公司，乙型肝炎病毒表面抗原定量(HBsAg)定量檢測使用雅培Abbott試劑盒，質(zhì)粒構(gòu)建、引物合成及 DNA測序由漢恒生物科技有限公司協(xié)助完成，乙型肝炎病毒核心相關(guān)抗原(HBcrAg)和乙型肝炎病毒前基因組RNA(HBV pgRNA)檢測由金域檢驗(yàn)完成。

1.2 研究方法

1.2.1HBVgRNA質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定 選用pHBAAV-CMV-Sacas9-U6-gRNA作為載體，BsaI 單酶切pHBAAV-CMV-Sacas9-U6-gRNA載體，目的gRNA序列插入該載體2個BbsI酶切位點(diǎn)之間，由U6啟動子啟動。設(shè)計(jì)gRNA序列并安排合成引物，將單鏈的引物退火成雙鏈，連接入線性化載體，轉(zhuǎn)化子外送測序驗(yàn)證，將正確的克隆進(jìn)行高純度質(zhì)粒抽提。gRNA1為5′-gGGAGCTGGAGCATTCGGGCT-3′，gRNA2為5′-gAGGAGCTGGAGCATTCGGG-3′，gRNA3為5′-gAGGTAGGAGCTGGAGCATT-3′。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) 利用HepAD38細(xì)胞系通過培養(yǎng)基中Tet的存在與否來調(diào)節(jié)HBV的復(fù)制，從培養(yǎng)基中去除Tet后，HBV開始復(fù)制并從細(xì)胞中分泌出來，而添加Tet則能完全抑制HBV復(fù)制的原理[9-10]。去HepAD38細(xì)胞在杜爾貝科改良的DMEM中培養(yǎng)，培養(yǎng)基中分別添加10%滅活胎牛血清、100 000 IU/L青霉素、100 000 g/L鏈霉素、100 000 g/L卡那霉素、400 000 g/L的G418及300 g/L 的Tet(用于抑制HBV復(fù)制)或不添加任何Tet(用于誘導(dǎo)HBV復(fù)制)。HepG2.2.15細(xì)胞也使用DMED培養(yǎng)基培養(yǎng)，并向其中添加相同濃度的胎牛血清和雙抗及谷氨酰胺2 mL。

1.2.3HBVpreS1敲除細(xì)胞系的建立 將表達(dá)嘌呤霉素抗性基因及Cas9、sgRNA的載體轉(zhuǎn)入到HepAD38或HepG2.2.15細(xì)胞，在無Tet培養(yǎng)基中生長48 h，細(xì)胞的融合度達(dá)到85%～90%。加入4 g/L的嘌呤霉素進(jìn)行細(xì)胞篩選，去除未轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞，收集上清培養(yǎng)基和細(xì)胞進(jìn)行ELISA和實(shí)時PCR檢測。對照細(xì)胞包括未轉(zhuǎn)導(dǎo)的HepAD38細(xì)胞作為HBV復(fù)制的陽性對照(無Tet的培養(yǎng)基中培養(yǎng))，因HepG2.2.15細(xì)胞與HepAD38細(xì)胞相似，能穩(wěn)定分泌HBV病毒相關(guān)HBsAg、乙型肝炎病毒DNA(HBVDNA)、HBVpgRNA等病毒標(biāo)志物，故選用未轉(zhuǎn)導(dǎo)的HepG2.2.15細(xì)胞作為相關(guān)實(shí)驗(yàn)的陰性對照。

1.2.4細(xì)胞固定及細(xì)胞核染色 從37 ℃恒溫箱中取出轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，PBS清洗3次，加入4%甲醛溶液2 mL，室溫固定25 min，PBS清洗3次，在中心區(qū)域加入4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)70 μL，置入37 ℃恒溫孵箱內(nèi)放置10 min進(jìn)行細(xì)胞核染色，染色結(jié)束后用雙蒸水清洗3次，在中心區(qū)域加入雙蒸水100 μL，用Flag單克隆抗體標(biāo)記，放入孵箱內(nèi)孵育30 min，PBS清洗10min/次，共3次；加入二抗，室溫下孵育30 min，清洗步驟同前；向中心區(qū)域加入雙蒸水100 μL，在激光共聚焦顯微鏡下觀察saCas9蛋白核定位情況。

1.2.5HBV-CRISPR和HepAD38系統(tǒng)中的抗病毒活性 將CRISPR處理的HepAD38細(xì)胞以及未經(jīng)CRISPR處理的HepAD38細(xì)胞接種在96孔板中，每孔濃度約50 000個；再將TDF或IFN-α加入到CRISPR處理的HepAD38細(xì)胞的孔板中，最終濃度為0.001～10 mmol/L?？瞻讓φ誋epAD38細(xì)胞的孔板中加入等體積DMSO。

1.2.6HBV復(fù)制 取HepAD38和HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用0.22 μm Millex?GP過濾器過濾，采用酶聯(lián)免疫吸附試(ELISA)法檢測上清液中HBsAg、HBcrAg的含量，用RT-PCR方法檢測HBVDNA、pgRNA水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 HBV gRNA質(zhì)粒的構(gòu)建

將特異性干擾片段gRNA1、gRNA2及gRNA3分別連接入表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測序驗(yàn)證。序列分析表明插入片段gRNA1、gRNA2及gRNA3的基因序列與前期設(shè)計(jì)序列完全一致，插入方向正確，融合區(qū)域的讀碼框正確，表明質(zhì)粒HBVgRNA構(gòu)建成功。見圖1。

注：灰色區(qū)域?yàn)槟康男蛄小?/p>

2.2 熒光共定位HBV gRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepAD38細(xì)胞

在共聚焦顯微鏡下觀察到成功構(gòu)建敲除細(xì)胞系的HepAD38細(xì)胞，分別發(fā)出藍(lán)色、紅色熒光，發(fā)出藍(lán)色熒光為經(jīng)DAPI染色的細(xì)胞核，發(fā)出紅色熒光的為經(jīng)Flag標(biāo)記轉(zhuǎn)染了gRNA的細(xì)胞，2者間有重疊。結(jié)果提示在HepAD38細(xì)胞中g(shù)RNA質(zhì)粒與 DAPI染色具有共定位，2者能共同定位于細(xì)胞核上(圖2)。

圖2 HBV gRNA質(zhì)粒在HepAD38細(xì)胞中的定位(熒光粒，×400)

2.3 Cas9/sgRNA組合靶向HBV對抗原分泌和病毒復(fù)制的影響

HepAD38細(xì)胞是一種很好的慢性乙肝病毒感染模型，可以檢測Cas9/sgRNA組合是否對于HBV病毒具有抗病毒特性。結(jié)果顯示HepG2.2.15細(xì)胞(陰性對照)和未經(jīng)Tet處理的HepAD38細(xì)胞(陽性對照)上清液中HBVDNA、HBVRNA明顯復(fù)制，HBsAg和HBcrAg水平明顯升高，經(jīng)Tet處理的HepAD38細(xì)胞中HBV復(fù)制明顯抑制。經(jīng)sgRNA干預(yù)的3株細(xì)胞HBV復(fù)制被明顯抑制，上清中HBVDNA、HBVRNA、HBsAg和HBcrAg水平較兩個對照組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，并且sgRNA-3抗病毒作用最強(qiáng)。見圖3。

注：(1)與陽性對照組相比，P <0.05；(2)與陽性對照組相比，P <0.001。

2.4 Cas9/sgRNA聯(lián)合抗病毒藥物的抗病毒作用

為了進(jìn)一步評估逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(TDF)和免疫調(diào)節(jié)劑(IFN-α)能否增強(qiáng)Cas9/sgRNA抗HBV復(fù)制的能力，本研究先評估了表達(dá)Cas9/sgRNA細(xì)胞和對照組細(xì)胞中的病毒抑制水平。選擇抗病毒能力最強(qiáng)的sgRNA-3轉(zhuǎn)染細(xì)胞，采用TDF或IFN-α處理后，檢測細(xì)胞上清中抗原分泌和病毒復(fù)制情況，結(jié)果顯示聯(lián)合抗病毒治療能有效增強(qiáng)抗病毒效應(yīng)，細(xì)胞上清中的病毒復(fù)制水平和抗原水平均下降(P<0.05)，并且sgRNA-3聯(lián)合IFN-α對于抑制HBV RNA和HBsAg的分泌更有優(yōu)勢(圖4)。

注：(1)與陽性對照組相比，P<0.05；(2)與陽性對照組相比，P<0.001。

3 討論

盡管有有效的疫苗，但HBV仍然是一種嚴(yán)重的人類病原體，全世界每年有超過2.4億人感染該病毒，有80萬人因?yàn)楦斡不透伟┒劳鯷11]。HBVcccDNA作為病毒蛋白表達(dá)的轉(zhuǎn)錄模板，它的內(nèi)在穩(wěn)定性阻止了目前的抗病毒療效[12-13]。因此，尋找清除cccDNA的方法被認(rèn)為是治療HBV感染的關(guān)鍵[13-14]。傳統(tǒng)的核苷類似物如ETV和TDF為HBV 逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，只能防止病毒粒子從HBV感染細(xì)胞中釋放，由于cccDNA穩(wěn)定存在于肝細(xì)胞中，因此HBV感染目前依然無法治愈[15]。最近，屬于CRISPR/Cas家族的RNA引導(dǎo)的DNA內(nèi)切酶被證明可以有效地切割和滅活HIV-1和HPV感染的人類細(xì)胞中的DNA病毒[16-18]，針對HBVDNA基因組的Cas9/sgRNA是否也能切割和降低感染HBV的細(xì)胞中HBVDNA，包括cccDNA水平的問題，本研究設(shè)計(jì)了用于識別HBV基因組的開放閱讀框S的保守序列，證明了CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以有效地滅活慢性感染細(xì)胞中的HBV。

未來實(shí)現(xiàn)HBV感染的功能性治愈的治療方法設(shè)想是不同抗病毒方法的結(jié)合[13-14,19]。特別是，體外工程設(shè)計(jì)核酸酶，如CRISPR/Cas9系統(tǒng)[20]，似乎是HBV新型特異性聯(lián)合治療的很有前途的組成部分，在各種HBV模型系統(tǒng)中，CRISPR/Cas9的抗病毒作用已經(jīng)被證實(shí)[21-24]。為了證明CRISPR/Cas9 RNA引導(dǎo)的核酸酶系統(tǒng)在HBV感染中的適用性，本研究在HBV基因組中選擇了前S1區(qū)域作為靶位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了3條不同的序列，并通過包含同源HBV DNA片段的指標(biāo)結(jié)構(gòu)確認(rèn)所有3個sgRNAS都是活躍的。通過慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)將Cas9/sgRNA轉(zhuǎn)染HepAD38細(xì)胞，并用標(biāo)簽標(biāo)記，確認(rèn)Cas9/sgRNA定位于細(xì)胞核中。為了確保任何觀察到的抑制作用不僅僅反映單個整合的 HBV 拷貝的突變激活，本研究在轉(zhuǎn)導(dǎo)前48 h去除了阻斷 HepAD38細(xì)胞中 HBV 轉(zhuǎn)錄的 Tet，產(chǎn)生容易被檢測到的未整合的 HBV DNA，結(jié)果顯示在引入的3種HBV特異性Cas9/sgRNA質(zhì)粒中的任何1種后，病毒DNA積累和抗原分泌都受到了很強(qiáng)的抑制。這與Lin等[25]報(bào)道當(dāng)Cas9和HBV表達(dá)質(zhì)粒能夠共轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞時HBV特異性Cas9/sgRNA能夠切割HBVDNA的結(jié)果一致。最后，本研究還測試了當(dāng)與已知的HBV生命周期抑制劑(TDF)和免疫調(diào)節(jié)劑(IFN-α)一起使用時，Cas9/sgRNA的表達(dá)是否能夠更有效地抑制HBV復(fù)制。結(jié)果顯示，在HepAD38細(xì)胞中HBV特異性Cas9/sgRNA對HBV復(fù)制的抑制作用增強(qiáng)。

綜上所述，本研究借助慢性HBV感染模型(HepAD38細(xì)胞)證明了Cas9/sgRNA靶向HBV DNA進(jìn)行切割可以抑制HBV病毒的復(fù)制，當(dāng)與HBV生命周期抑制劑(TDF)和免疫調(diào)節(jié)劑(IFN-α)一起使用時，能夠更有效地抑制HBV復(fù)制。這一新的結(jié)果可為細(xì)菌CRISPR/Cas系統(tǒng)作為治療DNA病毒感染的潛在方法提供了實(shí)質(zhì)性的支持。