鄒超杰，唐義凱，杜書文，程宇琪

（1）昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院精神科，云南 昆明 650032;2）清華大學生命科學學院，清華大學麥戈文腦研究院，北京 100084）

認知障礙（包括記憶損傷）是精神疾病患者臨床表型中的核心癥狀，但是其病理機理至今尚未完全闡明。約85%的精神分裂癥患者伴隨著認知缺陷，包括學習能力[1]、工作記憶[2]、短時程記憶[3]缺陷，社交能力降低[4]，恐懼、焦慮，選擇性注意力等方面[5]?，F(xiàn)階段的研究認為海馬、前額葉皮層等腦區(qū)和認知功能的實現(xiàn)緊密相關(guān)，精神疾病患者的海馬存在一定程度的異常，如精神分裂癥[6]和阿爾滋海默癥（Alzheimer;AD）[7]患者海馬的體積萎縮在全腦形態(tài)變化中尤其顯著。大腦海馬體積偏小的雙胞胎在經(jīng)歷創(chuàng)傷后，其患有創(chuàng)傷后應激障礙（post-traumatic stress disorder，PTSD）的概率會大大增加[8]。精神分裂癥患者呈現(xiàn)工作記憶時，其海馬和背側(cè)前額葉皮層（dorsolateral prefrontal cortex；DLPFC）之間的連接活性和同步性顯著性降低[9]。這些結(jié)果說明海馬結(jié)構(gòu)異常及海馬和DLPFC 之間的神經(jīng)活動失調(diào)可能是導致認知功能障礙的重要原因。

在細胞水平上，Rho 家族小G 蛋白在神經(jīng)發(fā)育和認知方面有著重要的作用[10-12]，并首次被發(fā)現(xiàn)不同亞家族的小G 蛋白介導模式動物中不同學習記憶成分的遺忘調(diào)控機制，如Rac1 蛋白的激活能夠促進果蠅嗅覺學習記憶和小鼠學習記憶的主動遺忘[13]，CDC42 蛋白則在果蠅學習范式中被證明參與調(diào)控果蠅特定記憶成分-抗麻醉敏感記憶（anesthesia-resistant memory；ARM）的遺忘[14]。同時多種精神疾病中都發(fā)現(xiàn)伴有一定程度的小G蛋白表達水平異常。自閉癥易感基因突變的果蠅模型中逆轉(zhuǎn)學習能力的嚴重缺陷是由于由Rac1介導的主動遺忘通路不能被正常激活所導致的[15]；自閉癥易感候選基因2（autism susceptibility candidate 2 gene，AUTS2）作為Rac1 和CDC42 蛋白的上游調(diào)控因子參與調(diào)控神經(jīng)元突觸可塑性從而進一步影響學習記憶[16]。精神分裂癥患者大腦DLPFC 椎體神經(jīng)元中的樹突棘密度同正常人相比顯著降低，CDC42 蛋白在皮層和灰質(zhì)中的mRNA表達水平也顯著低于正常人[17]。Datta 等人[18]的研究認為CDC42 作為一個關(guān)鍵性的調(diào)控蛋白，在大腦中的異常表達是造成神經(jīng)元樹突棘密度降低的主要原因，對CDC42 相關(guān)通路的進一步研究有助于筆者進一步揭示精神疾病認知缺陷的病理機制。

筆者推測海馬中CDC42 蛋白的異?？赡苁菍е戮窦膊≈谐霈F(xiàn)認知障礙的重要原因。本研究采用小鼠作為研究對象，通過分子生物學手段操縱小鼠海馬區(qū)中CDC42 蛋白的活性，結(jié)合多種動物行為學范式來探索小G 蛋白CDC42 與小鼠認知缺陷之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗所用動物為7～8 周齡雄性C57/B6J 小鼠，購買自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。飼養(yǎng)于SPF 級動物房，5 只每籠，溫度23 ℃，濕度50%，小鼠自由進水進食，墊料1 周更換2次，飼養(yǎng)房間由電腦控制光照時間12 h/12 h，保證小鼠正常的晝夜節(jié)律。本研究所有小鼠的使用和操作已得到清華大學動物倫理委員會的許可。

1.2 實驗方法

1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建初始質(zhì)粒pCyPet-CDC42（T17N）和 pCyPet-CDC42（Q61L）（Addgene plasmid # 22784和# 22783，來自Klaus Hahn 實驗室）以及AAV核心骨架載體pAAV-CaMKIIα-EGFP（Addgene plasmid # 50469，來自Bryan Roth 實驗室）購買自Addgene。濃度為1 μg/μL 的質(zhì)粒用于分子克隆。經(jīng)過酶切、回收、連接、轉(zhuǎn)化、測序后得到pAAV-CaMKIIα-EGFP-CDC42（T17N）和pAAVCaMKIIα-EGFP-CDC42（Q61L）用于腺相關(guān)病毒AAV 的包裝。

1.2.2 病毒制備293FT細胞培養(yǎng)24h后用vigofect 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染60 h 后收集細胞，用鹽溶液（150 mM NaCl，20 mM Tris PH8.0）平衡柱子，加入樣品后，用鹽溶液（1×1 mL 200 mM NaCl，20 mM Tris pH8.0-discard；1×1 mL 300 mM NaCl，20 mM Tris pH8.0-discard；1×1.5 mL 400 mM NaCl，20 mM Tris pH8.0；1×3 mL 450 mM NaCl，20 mM Tris pH8.0；1×1.5 mL 500 mM NaCl，20 mM Tris pH8.0）依次洗脫，收集后3 次洗脫溶液，用AMICON μL TRA-4（100 000 MWCO；Milipore；CatNO：UFC810024）將6 mL 洗脫液濃縮至最小體積。進行AAV 病毒滴度判定（1×1012gc/mL）。

1.2.3 立體定位病毒注射具體實驗流程參照[19]，分別將病毒AAV-CaMKII-GFP、AAV-CaMKII-CDC42-DN-GFP 和AAV-CaMKIICDC42-CA-GFP 立體定位注射到小鼠的雙側(cè)海馬區(qū)（每組20只）。注射過病毒的小鼠放回原籠飼養(yǎng)2 周。

1.2.4 免疫印跡CDC42 蛋白活性檢測注射病毒2 周后，每組隨機取4 只小鼠斷頸處死，迅速分離出海馬組織，加入10 倍于海馬重量的1×裂解液（Millipore 5×Mg2+lysis/ wash buffer.Cat.92590）和1%的蛋白酶抑制劑（Cytoskeleton Proteinase inhibitor.Cat.# PIC02），冰上研磨15 s 并靜置10 min；4 ℃高速離心機（Eppendorf 5417R）12 000 r/min 離心10 min，取上清（重復2次）；BCA 法測定樣品蛋白濃度，使用免疫共沉淀法檢測Active CDC42 濃度。同時檢測Actin 和Total CDC42 的蛋白濃度。

使用一抗Anti-CDC42antibody（1∶2000對于Active-CDC42的蛋白，1∶4000對于總CDC42蛋白），Anti-Actin antibody（1∶8 000）4 ℃過夜。二抗Anti-Mouse HRP-linked IgG，2.5∶4 000對 于Active-CDC42的蛋白，1∶4000對于總CDC42蛋白，1∶8 000 對Actin 蛋白。

1.2.5 免疫熒光注射病毒2 周后，每組隨機取4 只小鼠處死灌流，取出腦組織，4%多聚甲醛中過夜固定（4 ℃）；固定好的組織震蕩切片后染色（DAPI 1∶4 000），在共聚焦顯微鏡下觀察。

1.3 行為學實驗

每組剩余的12 只小鼠用來進行相關(guān)的行為學實驗。

1.3.1 曠場實驗用于檢測小鼠注射病毒以后的基本活動情況，如運動情況（locomotor activity）和焦慮程度（anxiety）[20]。行為箱（亞克力有機玻璃板50 cm×50 cm×40 cm）正上方有攝像頭記錄動物的運動軌跡和行為，箱子中央有Anymaze 軟件（購自Stoelting Co.公司）自動劃分的中央?yún)^(qū)域（30 cm×30 cm，小鼠不可見）。如果小鼠表現(xiàn)為焦慮，則圍繞箱子四周邊緣移動，而不傾向于去中央?yún)^(qū)域探索。小鼠在箱體內(nèi)自由探索1 h，記錄其在箱體內(nèi)的軌跡速度和距離（每10 min 為一個時間節(jié)點）。

1.3.2 社交行為實驗第1天，將小鼠放入行為箱中自由探索10 min，取出置于原籠飼養(yǎng)；第2天在箱體內(nèi)放入1 只新的老鼠（置于透明圓筒中），放入實驗小鼠自由探索10 min 形成社交記憶。用Anymaze 軟件劃分新小鼠所在的區(qū)域，實驗小鼠距離新小鼠2 cm 以內(nèi)且探索時間大于10 s，被認為是有效探索，記錄10 min 內(nèi)的探索時間；24 h后，測試實驗小鼠10 min 內(nèi)對熟悉小鼠和陌生小鼠的探索時間（新放入的小鼠為陌生小鼠，兩只新小鼠交換位置排出空間記憶的影響）。

1.3.3 條件恐懼反射實驗采用HABITEST 公司的條件恐懼反射行為系統(tǒng)。（1）痕跡恐懼記憶范式：訓練階段：將小鼠放入條件恐懼反射行為箱，適應90 s 后給予10 s 的聲音刺激，間隔15 s 后給予2 s 0.6 mA 的電刺激。重復3 次（每次間隔4 min）。軟件自動檢測并記錄小鼠恐懼程度，用小鼠不動（freezing）的時間占總時間的百分比來表示。測試階段：24 h后，將小鼠放入訓練的原環(huán)境中，記錄4 min 內(nèi)小鼠freezing 的時間。96 h 后進行同樣的測試。（2）環(huán)境恐懼記憶范式：訓練階段同痕跡恐懼記憶范式；測試階段：將訓練后的小鼠放入新行為箱中，3 min 后給予聲音刺激，記錄4 min內(nèi)小鼠freezing 的時間96 h 后進行同樣的測試。測試結(jié)束放回原籠飼養(yǎng)。

1.4 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計和差異分析均在GraphPad Prism 8 軟件中進行。進行差異分析的數(shù)據(jù)先經(jīng)過Shapiro-Wilk Test 判斷其是否符合正態(tài)分布規(guī)律，若符合則使用方差分析（ANOVAs）來比較多組間的統(tǒng)計學差異；若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，則在組間使用Mann-Whitney 檢驗或Kruskal-Wallis方差分析。所有統(tǒng)計數(shù)據(jù)均用平均值（Mean）±方差（SEM）的形式體現(xiàn)，本文中數(shù)據(jù)差異均為實驗組和對照組間的差異，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 腺病毒AAV 表達操縱海馬區(qū)CDC42 蛋白的活性

為了在海馬區(qū)特異性的操縱CDC42 蛋白的表達活性，采用腺相關(guān)病毒AAV 來操縱海馬區(qū)特定細胞基因的表達。CDC42蛋白基因上的氨基酸突變，可以顯著增強（CA-AAV-CaMKII-cdc42 consist active；CDC42-CA）或抑制（DN-AAVCaMKII-cdc42 dominant negative；CDC42-DN）內(nèi)源性CDC42 蛋白的活性。筆者采用亞克隆的方法，將原始質(zhì)粒所包含的CDC42 突變體克隆到AAV載體當中。將病毒注射到小鼠背部海馬CA1 區(qū)和DG 區(qū)（圖1A），2 周后發(fā)現(xiàn)AAV 病毒可以正確表達在小鼠海馬區(qū)（圖1B）。通過蛋白免疫印跡實驗發(fā)現(xiàn)盡管AAV 只在海馬中表達，但是能夠特異性的增加或降低CDC42 蛋白在海馬區(qū)的表達活性（圖1C）。

圖1 AAV-CaMKII-CDC42-GFP 特異性地操縱海馬區(qū)CDC42 蛋白的活性Fig.1 AAV-CaMKII-CDC42-GFP specifically regulated CDC42 activity in hippocampal neurons.

2.2 激活海馬區(qū)CDC42 活性能使小鼠產(chǎn)生焦慮的行為表型

用曠場實驗（見實驗方法）來檢測小鼠注射完病毒后的運動情況及焦慮程度。小鼠在陌生的環(huán)境中趨向于在邊緣區(qū)域運動，當熟悉環(huán)境后會更多的停留在中央?yún)^(qū)域，同時其運動速度也會下降。如果小鼠表現(xiàn)為焦慮，則其更喜歡在邊緣區(qū)域活動。記錄60 min 內(nèi)各組小鼠在邊緣區(qū)域的運動距離和速度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)40 min后，激活海馬區(qū)CDC42 蛋白活性的小鼠在邊緣區(qū)的運動距離和速度都遠高于健康組小鼠（圖2A、2B），同時50 min后，激活海馬區(qū)CDC42 蛋白活性的小鼠在中央?yún)^(qū)域的時間明顯減少。這意味著CDC42-CA小鼠到新環(huán)境后的焦慮程度更高，在1 h 內(nèi)尚未得到緩解（圖2C）。抑制海馬區(qū)CDC42 蛋白活性的小鼠沒有表現(xiàn)出明顯的焦慮癥狀。

圖2 只有激活海馬區(qū)CDC42 蛋白活性使小鼠產(chǎn)生焦慮的行為表型Fig.2 Only activation of CDC42 activity in hippocampal neurons produced an anxiety-like behavior in mice

2.3 調(diào)控海馬區(qū)CDC42 蛋白活性影響小鼠的條件恐懼記憶

為了檢測海馬神經(jīng)元中CDC42 蛋白活性的改變是否對小鼠的學習記憶產(chǎn)生影響，筆者首先通過條件恐懼記憶的訓練范式對小鼠進行訓練和測試（圖3A）。訓練結(jié)束后立即測試各組小鼠的學習情況（即學習值），發(fā)現(xiàn)注射完病毒的各組小鼠學習能力無差異，P＞0.05（圖3B）。幾分鐘后，將訓練后的小鼠放入新環(huán)境中（紅色），發(fā)現(xiàn)訓練結(jié)束后，新環(huán)境不會對各組小鼠的恐懼記憶產(chǎn)生影響（圖3C）。

圖3 CDC42 活性變化不影響小鼠的學習能力且新環(huán)境對恐懼記憶的表現(xiàn)無影響Fig.3 CDC42 activity regulation did not affect the learning and the new environment did not affect the performance of fear memory in mice

筆者檢測了小鼠的24 h 痕跡恐懼記憶（圖4A），結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制海馬區(qū)CDC42 蛋白活性的小鼠對于聲音的恐懼記憶高于對照組小鼠，而激活海馬區(qū)CDC42 蛋白活性的小鼠對于聲音的恐懼記憶低于對照組小鼠（圖4B）。在96 h 之后測試了小鼠的環(huán)境恐懼記憶，將小鼠放回到訓練時的環(huán)境中（綠色），不給予聲音，記錄小鼠的freezing 情況（圖4A）。與之前結(jié)果一致，筆者發(fā)現(xiàn)抑制海馬區(qū)CDC42 蛋白活性的小鼠的小鼠表現(xiàn)出恐懼記憶增加，而激活海馬區(qū)CDC42 蛋白活性的小鼠則表現(xiàn)出記憶遺忘加快的現(xiàn)象（圖4C）。因此，筆者推斷通過改變海馬中CDC42 蛋白的活性能改變條件恐懼記憶的可塑性，進而進一步影響了小鼠的記憶認知表型。為了進一步研究該相關(guān)性，筆者又對注射了AAVCDC42-DN 和AAV-CDC42-CA 的小鼠進行了其他行為范式的訓練測試。

圖4 調(diào)控海馬區(qū)神經(jīng)元CDC42 蛋白活性雙向影響小鼠的條件恐懼記憶Fig.4 Regulation of CDC42 activity in hippocampal neurons bidirectionally affected fear conditioning memory

2.4 調(diào)控海馬神經(jīng)元CDC42 蛋白活性不影響小鼠社交記憶

社交能力的降低是臨床上用來評價精神疾病患病程度的重要指標之一。如圖5A 所示，實驗組小鼠首先與1 只新小鼠接觸并形成社交記憶，間隔24 h后，將實驗小鼠放置在包括熟悉小鼠和另一只陌生小鼠的環(huán)境中（2 只新放入的小鼠交換位置，避免小鼠的空間記憶產(chǎn)生干擾），通過記錄實驗小鼠對于熟悉小鼠和陌生小鼠的社交活動時間來分析小鼠的社交記憶（圖5A）。

圖5 調(diào)控海馬神經(jīng)元中CDC42 蛋白的活性不影響小鼠社交記憶Fig.5 Regulation of CDC42 activity in hippocampal neurons had no effect on social memory of mice

通過分析不同實驗組小鼠的社交時間以及小鼠頭部指向小鼠的時間參數(shù)，筆者并未發(fā)現(xiàn)激活海馬神經(jīng)元中CDC42 蛋白活性和抑制海馬神經(jīng)元中CDC42 蛋白活性的小鼠對照組相比其社交記憶有顯著性的差異，P＞0.05（圖5B、圖5C）。因此，筆者認為無論激活或抑制小鼠海馬神經(jīng)元CDC42蛋白的活性均不會影響小鼠的社交記憶。

3 討論

筆者通過腺病毒注射在小鼠海馬組織表達CDC42 蛋白的氨基酸突變從而調(diào)控CDC42 蛋白活性，通過條件恐懼記憶范式，社交記憶范式和曠場實驗以及結(jié)合生化和免疫熒光的方法證明了CDC42 蛋白能夠參與到認知障礙以及焦慮的行為表型中。這進一步證明了筆者的研究假設即精神患者大腦海馬區(qū)CDC42 蛋白活性的異?？赡芎筒∪吮憩F(xiàn)出的認知障礙（記憶損傷）有關(guān)。研究中發(fā)現(xiàn)只有增加CDC42 蛋白活性能夠影響小鼠的焦慮行為，筆者猜測只有激活CDC42 蛋白能夠?qū)е抡{(diào)控焦慮相關(guān)的下游分子環(huán)路的改變從而改變了小鼠的行為，而抑制CDC42 蛋白活性并不能負向調(diào)控相關(guān)的信號通路，因此不影響小鼠的焦慮行為。

同時，結(jié)果顯示調(diào)控海馬CDC42 蛋白活性能夠雙向調(diào)控小鼠的條件恐懼記憶，但是不影響小鼠的社交記憶，這意味著CDC42 蛋白活性的改變只參與特定類型的記憶調(diào)控（類似于Rac1 和CDC42 蛋白對果蠅學習記憶遺忘的調(diào)控模型），而非所有記憶類型的調(diào)控。在果蠅嗅覺懲罰記憶范式中[13]，Rac1 蛋白參與調(diào)控果蠅麻醉敏感記憶的主動遺忘，而CDC42 蛋白在果蠅學習范式中被證明參與調(diào)控果蠅特定記憶成分抗麻醉敏感記憶的遺忘，但并不參與記憶的形成[14]。除此之外，在其它模式動物中也有發(fā)現(xiàn)Rac1 蛋白和CDC42蛋白在神經(jīng)突觸可塑性上的不同作用，如在海兔（Aplysia）上的研究表明CDC42 蛋白，參與了長時程易化的過程，而Rac1 蛋白并不參與該過程[21]；在小鼠中發(fā)現(xiàn)Rac1 蛋白的缺失能夠特異性的影響海馬的突觸可塑性，進而導致工作記憶的缺陷[22]，而CDC42 蛋白的缺失能夠特異性的損害神經(jīng)突觸可塑性，并影響久遠的記憶[23]。這意味著小G 蛋白Rac1 和CDC42 在大腦中可能參與調(diào)控不同的學習記憶類型，但是其具體分工及機制還需要在更高等的動物模型上進行進一步的研究和驗證。從本文的數(shù)據(jù)可以進一步猜測，精神分裂癥等精神疾病患者社交需求的降低并不是由海馬中的CDC42 來參與調(diào)控的，這一過程可能存在其它的分子機制或其它的腦區(qū)來調(diào)控。

目前針對認知障礙的病理機制尚未有完整的解釋，之前的研究主要集中在神經(jīng)遞質(zhì)的發(fā)放紊亂、神經(jīng)損傷以及基因遺傳等方面。本工作中發(fā)現(xiàn)的CDC42 蛋白活性異常和部分記憶類型的損傷以及焦慮行為相關(guān)，但還需要在更多的行為學范式上檢測其對不同記憶類型的影響，如新物體識別、水迷宮實驗等。同時，除海馬外，其它在認知功能中起重要作用的腦區(qū)（如皮層、杏仁核等）中也有著小G 蛋白的表達異常，CDC42 蛋白在這些腦區(qū)中的活性改變也可能參與到該認知障礙理論中。其次還可以利用一些阻斷CDC42 蛋白活性的化合物，探索這些化合物的使用是否對造成的記憶損傷有改善作用。另外，有研究表明精神分裂癥高危因子DISC1 能通過Rac1 蛋白調(diào)節(jié)谷氨酸能突觸的樹突棘形成[24]，精神分裂癥病人樹突棘中觸發(fā)CDC42 蛋白介導的肌動蛋白纖絲重組的級聯(lián)信號通路發(fā)生了改變[25]，這意味著小G 蛋白的上游調(diào)控因子在精神分裂癥中可能也有著直接的作用，如果能夠找到CDC42 蛋白上游的調(diào)控因子或蛋白，驗證這些蛋白在認知損傷中的功能，這將進一步完善精神分裂癥中影響認知缺陷的CDC42 信號通路。

本研究運用分子生物學結(jié)合動物行為學的方式在動物模型中來探索小G 蛋白CDC42 和精神疾病認知缺陷之間的關(guān)系?，F(xiàn)階段CDC42 蛋白和精神疾病之間的研究主要集中在臨床患者，特別是患者去世后的尸檢、影像學研究等方面，變量多且復雜，個體差異明顯且具有局限性，目前并沒有很好的動物模型可以用來探究其病理機制。通過AAV 病毒表達載體構(gòu)建的這一CDC42 突變模型能夠化繁為簡、特異性的作為部分認知障礙機制的研究模型。