劉小瓊，曹杰永，劉春亮，堵偉鋒（.安徽省藥品審評查驗中心，合肥 005；.合肥合源藥業(yè)有限公司，合肥 0088；.滁州市食品藥品檢驗中心，安徽 滁州 9000；4.安徽省食品藥品檢驗研究院，合肥 005）

沙格列汀是一種強(qiáng)效降糖藥，其生產(chǎn)工藝是起始物料Ⅰ與甲磺酸反應(yīng)得到中間體，中間體再與起始物料Ⅱ經(jīng)過多步反應(yīng)后生成。在生產(chǎn)過程中，中間體上的甲磺酸基團(tuán)可能會與甲醇、乙醇、異丙醇等生成甲磺酸甲酯（MMS）、甲磺酸乙酯（EMS）、甲磺酸異丙酯（IMS）等甲磺酸酯類化合物，如圖1。甲磺酸酯類是一類典型的基因毒性物質(zhì)，能破壞服用者體內(nèi)的DNA 結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生致癌物質(zhì)，為了保證藥品的安全性，藥品監(jiān)管系統(tǒng)不斷完善基因毒性雜質(zhì)控制的指導(dǎo)細(xì)則[1-3]，藥物研發(fā)以及藥品生產(chǎn)企業(yè)不斷探索甲磺酸酯類雜質(zhì)的檢驗方法[4-6]。目前已報道的甲磺酸酯類的檢驗方法有氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）法、液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）法等，但運用GC-MS 法檢測沙格列汀中的基因毒性雜質(zhì)尚未見報道，僅有GC 法[7]測定的研究，可這種方法存在靈敏度低、檢測限高的問題，對小劑量的沙格列汀制劑來說存在漏檢出甲磺酸酯類雜質(zhì)的可能，本文利用GC-MS 對沙格列汀的甲磺酸酯類雜質(zhì)進(jìn)行檢測，該法檢測限更低，靈敏度和準(zhǔn)確度更高，能更有效評價沙格列汀的安全性。

圖1 沙格列汀反應(yīng)步驟及甲磺酸酯類的結(jié)構(gòu)Fig 1 Reaction of saxagliptin，and structure of methanesulfonates

1 儀器與試藥

GCMS-QP2010 Plus 型氣質(zhì)聯(lián)用儀（日本島津公司），XS-105 型電子天平、MS105DU 型電子天平（精度：0.01 mg，瑞士梅特勒公司），KQ-500超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），MMS對照品（批號：I2009166，純度：98.57%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），EMS 對照品（批號：AQX836，純度：97.00%，上海畢得醫(yī)藥科技有限公司），IMS 對照品（批號：D8NRR0ED，純度：99.06%，安徽澤升科技有限公司），沙格列?。ㄅ枺篠G-190801R1、SG-190901R1、SG-190902R1、SG-200401、SG-200402、SG-200403，合肥合源藥業(yè)有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

毛細(xì)管色譜柱（CP-SIL 8 CB，30.0 m×0.32 mm，1.0 μm）；質(zhì)譜檢測器；氦氣作為載氣。

參數(shù)設(shè)定情況： 起始柱溫60 ℃， 以10 ℃·min－1的速率升溫至150 ℃，保持1 min，再以30 ℃·min－1速率升溫至200 ℃，保持13 min；柱流速設(shè)定為2.0 mL·min－1；進(jìn)樣口溫度設(shè)定為200 ℃；分流比設(shè)定為5∶1；進(jìn)樣量為1.0 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

EI 離子源（設(shè)定為70.0 eV）；SIM 檢測模式。離子源的溫度設(shè)定為200 ℃，接口溫度設(shè)定為240 ℃；線性模式；MMS 的質(zhì)荷比（m/z）設(shè)定為80，EMS 的m/z設(shè)定為79，IMS 的m/z為123。

2.3 溶液的制備

混合對照品溶液：精密稱取3 種甲磺酸酯類對照品各適量置同一量瓶中，用甲醇溶解定容，制備成3 種雜質(zhì)的質(zhì)量濃度均為0.51 μg·mL－1的溶液。同時用作系統(tǒng)適用性溶液。

混合對照品母液：稱取對照品MMS、EMS和IMS 約10 mg，精密稱定，置同一量瓶中，用甲醇溶解定容至100 mL，再從量瓶中精密量取10.0 mL 置200 mL 量瓶中，用甲醇稀釋定容即可。

供試品溶液的制備：取待測供試品沙格列汀，用甲醇溶解并稀釋定容成質(zhì)量濃度為1.7 mg·mL－1的溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性考察 分別取空白溶劑（甲醇）、系統(tǒng)適用性溶液1.0 μL 進(jìn)樣，以SIM 模式采集，記錄質(zhì)譜圖，結(jié)果如圖2，質(zhì)譜圖顯示空白溶劑對3種甲磺酸酯類雜質(zhì)的檢測沒有影響，專屬性較好。

圖2 SIM 質(zhì)譜圖Fig 2 SIM mass spectra

2.4.2 準(zhǔn)確度考察 精密稱取3 份批號為SG-200402 的沙格列汀原料藥170 mg，分別置于3個100 mL 量瓶中，再分別向不同量瓶中移入5.0、10.0 以及15.0 mL 混合對照品母液，加甲醇溶解并定容，搖勻，即得到50%、100%、150%限度濃度供試品溶液，每個濃度平行制備3 份。精密量取1.0 μL 上述限度濃度供試品溶液以及混合對照品溶液，進(jìn)樣，計算。結(jié)果顯示MMS 在各限度濃度的平均回收率分別是96.51%、98.45%、97.98%，RSD均小于2.0%；EMS 在各限度濃度的平均回收率分別是95.21%、98.91%、98.50%，RSD均小于2.5%；IMS 在各限度濃度的平均回收率分別是94.48%、96.45%、95.83%，RSD均小于2.0%。表明本方法的準(zhǔn)確度好。

2.4.3 重復(fù)性考察 吸取1.0 mL 混合對照品母液置10 mL 量瓶中，用甲醇定容，搖勻作為備用液；向10 mL 量瓶中加入17 mg 批號為SG-200402 的沙格列汀原料藥，用甲醇溶解并定容，搖勻，作為不加雜質(zhì)的樣品；向10 mL 量瓶中加入17 mg 同批次沙格列汀原料藥和1.0 mL 混合對照品母液，用甲醇溶解并定容，搖勻，作為加限度濃度雜質(zhì)的樣品（相當(dāng)于100%限度濃度供試液）。取上述備用液、6 份不加雜質(zhì)的樣品和加限度濃度雜質(zhì)的樣品各1.0 μL，進(jìn)樣，計算。結(jié)果在不加雜質(zhì)的情況下，樣品中3 種甲磺酸酯類未檢出；在樣品中加入限度濃度雜質(zhì)后，3 種甲磺酸酯類的平均檢出量分別為0.030%、0.029%和0.029%，RSD分別為2.4%、2.4%和3.0%，表明本方法的重復(fù)性較好。

2.4.4 穩(wěn)定性考察 取“2.4.2”項下100%限度濃度供試品溶液作為穩(wěn)定性考察溶液，室溫放置，分別于4、8、12、16、20、24 h 后，進(jìn)樣測定，記錄圖譜，結(jié)果放置不同時間后的3 種甲磺酸酯類雜質(zhì)含量的RSD值分別為2.8%、2.6%、3.3%，表明24 h 內(nèi)供試品溶液中雜質(zhì)含量波動較小，溶液較穩(wěn)定。

2.4.5 檢測限與定量限考察 用甲醇逐級稀釋混合對照品母液配制成不同濃度的溶液，分別精密量取上述濃度溶液各1.0 μL，進(jìn)樣，按S/N為3∶1 計算MMS、EMS 和IMS 的檢測限分別為6.21、6.14、6.17 ng·mL－1；按S/N為10∶1 計算MMS、EMS 和IMS 的定量限分別為0.0261、0.0255 和0.0255 μg·mL－1。

2.4.6 線性考察 分別精密量取混合對照品母液1.0、1.5、2.5、5.0、8.0、10.0 mL，置于6 個50 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為系列濃度對照品溶液。精密量取上述溶液各1.0 μL，分別進(jìn)樣，記錄圖譜，計算，結(jié)果見表1。MMS、EMS 和IMS 分別在0.1045 ～1.0448、0.1019 ～1.0185 和0.1020 ～1.0203 μg·mL－1的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果Tab 1 Linearity

2.4.7 耐用性考察 按照“2.4.3”項下備用液、不加雜質(zhì)的樣品和加限度濃度雜質(zhì)樣品的制法制備耐用性考察所需的測試溶液，單因素考察初始柱溫、分流比、柱流速、離子源溫度以及控制模式對測定結(jié)果的影響（見表2）。精密量取上述測試溶液1.0 μL，進(jìn)樣，計算。本方法耐用性考察情況見表3。通過實驗可以發(fā)現(xiàn)，在變動色譜條件后，不加雜質(zhì)的樣品依然未檢出；加限度濃度雜質(zhì)樣品中的3 種甲磺酸酯類的RSD在3.9%～6.6%，備用液的峰面積穩(wěn)定，峰面積RSD的最大值為5.0%，小于限度要求的10%。表明色譜條件的變動不會影響檢測結(jié)果，本檢驗方法的耐用性良好。

表2 色譜參數(shù)變動情況Tab 2 Changes of chromatographic conditions

表3 耐用性考察情況Tab 3 Durability test

2.5 樣品檢測

對6 批次沙格列汀原料藥進(jìn)行處理，按要求配制相應(yīng)的供試品溶液，各取1.0 μL 的混合對照品溶液和供試品溶液進(jìn)樣，結(jié)果見圖3。6 批次沙格列汀原料藥中均未檢出3 種甲磺酸酯類雜質(zhì)，滿足雜質(zhì)含量小于0.03%的限度要求。

圖3 混合對照品溶液（A）和供試品溶液（B）的質(zhì)譜圖Fig 3 Mass spectra of mixed reference（A）and test solution（B）

3 討論

3.1 升溫程序的確定

由于沙格列汀原料藥中需要檢測的基因毒性雜質(zhì)較多，雜質(zhì)間的差異性較大，為了更好地分離出被測組分，明確采取系統(tǒng)程序升溫法開展實驗。經(jīng)過摸索[8-9]，發(fā)現(xiàn)按照“起始柱溫60 ℃，以10 ℃·min－1的速率升溫至150 ℃，保持1 min，再以30 ℃·L－1速率升溫至200 ℃，保持13 min”的程序進(jìn)行升溫，分離效果最好。

3.2 質(zhì)譜定量離子的確定

本實驗采用SIM 監(jiān)測模式，通過對空白溶液和系統(tǒng)適用性溶液進(jìn)行質(zhì)譜采集，觀察采集圖譜可以看出MMS、EMS 在m/z80 和m/z79 處有最高豐度，故選定其作為相應(yīng)雜質(zhì)的定量離子；IMS 在m/z43 處有最高豐度，由于此處的檢測結(jié)果容易受到系統(tǒng)及溶劑的影響，故選擇豐度僅次于最高處的m/z123 作為定量離子[10]。

3.3 基因毒性雜質(zhì)限度的確定

TTC 法是常用的基因毒性雜質(zhì)限度制訂方法，企業(yè)為了收緊和方便控制原料藥中的基因毒性雜質(zhì)，統(tǒng)一設(shè)定TTC 值為1.5 μg·d－1，按照沙格列汀片的最大日劑量是5 mg 計算，可得出基因毒性雜質(zhì)的控制限度應(yīng)為0.03%[11-12]。本方法選擇樣品的質(zhì)量濃度為1.7 mg·mL－1，若雜質(zhì)達(dá)到控制上限0.03%時，對照品質(zhì)量濃度是本方法選定的0.51 μg·mL－1，可直接比對樣品和對照品中對應(yīng)的甲磺酸酯類峰面積判定基因毒性雜質(zhì)是否超出限度。

4 結(jié)論

本文采取的檢驗方法具有靈敏度高、準(zhǔn)確度好等優(yōu)勢，運用GC-MS 法檢測沙格列汀原料藥中的基因毒性雜質(zhì)甲磺酸酯類，可大大提高藥品的使用安全系數(shù)，降低患者的用藥風(fēng)險。