劉秀盈，劉靜靜，朱晶晶，馮義超，王建勛（北京中醫(yī)藥大學生命科學學院，北京 102488）

腫瘤微環(huán)境（tumor micro-environment，TME）是指腫瘤細胞周圍存在的微環(huán)境，包括位于腫瘤病灶中心、邊緣或附近的非惡性細胞、血管、淋巴器官或淋巴結、神經(jīng)、細胞間成分和代謝物。缺氧和免疫抑制是TME 的標志，這一特殊的環(huán)境有利于腫瘤細胞在生物體內(nèi)的生存和遷移，而對免疫細胞起著抑制作用，其中包括細胞免疫的主體——T 細胞[1]。絲裂原活化蛋白激酶1（mitogenactivated protein kinase 1，MAP4K1）是一種免疫抑制調(diào)節(jié)激酶，在造血細胞中有限制性表達，是MAPK 信號通路的重要組成部分[2]，本文就MAP4K1 影響T 細胞在TME 中的功能的研究進展作一綜述。

MAP4K1，亦稱造血祖細胞激酶1（hematopoietic progenitor kinase 1，HPK1），是一種造血細胞特異性表達的絲氨酸-蘇氨酸激酶，是哺乳動物Ste20 相關蛋白激酶MAP4K 的家族成員，家族中包括MAP4K1、MAP4K2、MAP4K3、MAP4K5、MAP4K6 等，它們具有高度相似的蛋白質(zhì)結構，在JNK-p38 MAPK 通路擔任重要角色。MAP4K1由一個N 末端的激酶結構域、SH3 結合的富含脯氨酸的中間基序和C 末端的一個檸檬酸同源結構域組成，這表明激酶和支架功能在MAP4K1 的各種活動中都可能是重要的[2-3]。

1 MAP4K1 是T 細胞表面特異的抗原受體（TCR）信號的負調(diào)節(jié)因子

MAP4K1 是TCR 信號下游SH2 攜帶蛋白的一個激酶[4]。MAP4K1 缺失的T 細胞不能磷酸化SLP76 蛋白的第376 號位點的絲氨酸，這導致激活蛋白1（AP-1）和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）途徑表達下調(diào)[5-8]。細胞生物學研究表明，細胞質(zhì)中的MAP4K1 在TCR 激活時被招募到質(zhì)膜上，而活性MAP4K1 則使接頭蛋白SLP76 磷酸化，從而激活SLP76 作為負調(diào)節(jié)蛋白14-3-3p 的對接位點，進而引起蛋白酶體介導的SLP76 的降解，最終破壞TCR 信號復合體的穩(wěn)定[2]。MAP4K1缺失的T 細胞在TCR 信號通路中，ERK MAPK活性、AP-1 和活化T 細胞核因子（NFAT）介導的基因轉錄水平升高，從而導致白介素2（IL-2）分泌水平升高[2，9]。

2 MAP4K1 的缺失促進T 細胞向腫瘤遷徙

被抗原激活的T 細胞需要趨化信號來引導其向腫瘤遷移。在荷瘤K46M 小鼠（MAP4K1點突變體）的腫瘤引流淋巴結中發(fā)現(xiàn)趨化因子CX3CL1 的轉錄水平升高，并且在K46M 小鼠體內(nèi)的腫瘤中觀察到CD4＋和CD8＋腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）增加以及在K46E（MAP4K1點突變體）小鼠體內(nèi)的腫瘤中CD8＋TIL 增加，由此推論MAP4K1 激酶活性的喪失可能是趨化因子介導的腫瘤趨化作用增強的原因[6]?？乖T導的CD8＋細胞毒性T 淋巴細胞朝著不斷增加的趨化因子梯度遷移，這一過程需要將β2 整合素，淋巴細胞功能相關抗原1（LFA-1）與其同源配體表達于內(nèi)皮細胞上的細胞間黏附分子-1（ICAM-1）結合[10]，LFA-1 與ICAM-1 的親和力由TCR 和趨化因子受體提供的信號調(diào)節(jié)[11]。MAP4K1 通過與SLP76的SH2 結構域結合，使其無法與脫顆粒適配蛋白（ADAP）形成超分子復合物[12]。在這個模型中，沒有證據(jù)表明MAP4K1 是通過其激酶活性介導負調(diào)控功能的，而是通過其蛋白支架能力與基于ADAP 的LFA-1 激活復合物競爭并破壞其最終產(chǎn)物的形成來實現(xiàn)的[13]。

3 MAP4K1 的缺失減緩T 細胞耗竭

抗原的持續(xù)刺激、TME 中抑制性免疫細胞和細胞因子的存在、抑制性受體表達上調(diào)、T 細胞相關轉錄因子的變化以及代謝因素均可導致T 細胞耗竭。如何防止T 細胞耗竭，從而延長其效應功能，是目前免疫腫瘤學的重要研究內(nèi)容。已有證據(jù)充分證明，胸腺細胞選擇相關高遷移率盒蛋白（TOX）和核受體4A1（NR4A1）是T 細胞耗竭的驅(qū)動因素，進一步研究發(fā)現(xiàn)與野生型T 細胞相比，MAP4K1敲除的T 細胞中TOX 和NR4A1的表達水平顯著降低，且CD8＋T 細胞耗竭由MAP4K1-NFκB-Blimp1 信號級聯(lián)驅(qū)動[14]。故而MAP4K1 的缺失能夠有效減緩T 細胞耗竭。

4 MAP4K1 對調(diào)節(jié)性T 細胞（Tregs）的影響

在腫瘤免疫的背景下，Tregs 抑制抗腫瘤免疫應答，MAP4K1敲除的Tregs 缺乏有效抑制TCR 誘導的效應性T 細胞增殖反應的能力。與野生型Tregs 相比，MAP4K1敲除的Tregs 通過持續(xù)升高的ERK MAPK 和RelA 核因子κB（NFκB）磷酸化來響應TCR 信號。多重細胞因子分析顯示，在抗CD3ε和抗CD28 嵌合抗原受體T 細胞（CAR-T）的共刺激域交聯(lián)的刺激下，MAP4K1敲除的Tregs 表現(xiàn)出異常的細胞因子表達，包括IL-2、IFN-γ和趨化因子如巨噬細胞炎性蛋白1-α和巨噬細胞炎性蛋白1-β的表達增加[15]。經(jīng)過對Tregs 的穩(wěn)態(tài)水平進行評估，發(fā)現(xiàn)與野生型Tregs 相比，MAP4K1敲除的Tregs的穩(wěn)態(tài)水平更高[2，15]。

5 MAP4K1 的缺失增強T 細胞殺傷腫瘤的能力

MAP4K1敲除的CD4＋T 細胞可通過細胞間直接的相互作用或IL-2 的介導改善CD8＋T 細胞活化的啟動，促進CD8＋效應細胞向記憶細胞的分化。CD4＋T 細胞還協(xié)調(diào)樹突狀細胞激活CD8＋T 細胞，將腫瘤抗原交叉提呈給CD8＋T 細胞，或者通過誘導IL-2 的產(chǎn)生來激活CD8＋T 細胞。值得注意的是，有研究發(fā)現(xiàn)MAP4K1 缺失使小鼠腫瘤引流區(qū)淋巴結中CD4＋Ki67＋（增殖細胞的相關抗原）和CD8＋Ki67＋T 細胞顯著增加，這進一步證明了荷瘤小鼠MAP4K1 激酶失活后CD4＋和CD8＋T 細胞之間的正相互作用[6]。

MAP4K1敲除使 CD8＋T 細胞的擴增和效應功能更強大，這證明了MAP4K1 的缺失在產(chǎn)生和維持有效的細胞毒性和記憶性CD8＋T 細胞中起關鍵作用的結論。MAP4K1敲除的 CD8＋T 細胞在腫瘤細胞刺激后表現(xiàn)出更高的激活狀態(tài)和更高的CD69表達水平，并在體外刺激時顯著增加IFN-γ和TNF-α的釋放水平[16]。此外，MAP4K1敲除的脾淋巴細胞在體外被相同腫瘤細胞再次攻擊時表現(xiàn)出明顯更好的回憶反應及更強的腫瘤殺傷能力[6]。

在Lewis 肺癌模型中，輸注MAP4K1敲除的T 細胞可以賦予宿主小鼠抵抗肺癌的能力，揭示了MAP4K1 在T 細胞對腫瘤抗原的固有反應中的重要性[17]。如K46E 和K46M 小鼠中GL261膠質(zhì)瘤和1956 肉瘤的生長均得到了控制[5-6]。其中，K46E 小鼠體內(nèi)的GL261 腫瘤中檢測到更多的CD8＋T 細胞的浸潤，IFN-γ和TNF-α表達水平升高。同樣，K46M 小鼠中1956 腫瘤的生長速度被有效緩解，對此模型中TIL 的分析結果顯示，Treg 浸潤顯著減少，因此CD8＋Treg 細胞比率相應增加。定量PCR 和轉錄組學分析顯示，參與介導抗腫瘤免疫的免疫細胞標志物在K46M 小鼠中升高，其中最顯著的是CD4、CD8、IFN-γ、TNF-α、顆粒酶B、CD28（T 細胞共刺激分子）、CD11c 和CD11b（黏附蛋白白細胞整合素家族成員，可用于標記白細胞）。在腫瘤抗原背景下抑制MAP4K1 的功能使CD8＋T 細胞的數(shù)量和活性都得到改善，甚至能夠誘導高親和力CD8＋T 細胞反應，對腫瘤進行更有效的殺傷[18]。

6 靶向MAP4K1 的藥物

目前并沒有靶向MAP4K1 的藥物上市，6 項與之相關的臨床試驗，均為Ⅰ期試驗，其中5 項標注為MAP4K1 的拮抗劑，1 項是通過基因編輯技術與CAR-T 聯(lián)用，詳見表1。

表1 與MAP4K1 相關的臨床試驗Tab 1 Clinical trials related to MAP4K1

6.1 小分子拮抗藥物

基因證據(jù)表明，MAP4K1 有可能成為免疫腫瘤學新的藥物靶點，這刺激了大量制藥公司以及學術研究機構進行以開發(fā)MAP4K1 小分子激酶抑制劑為重點的臨床前研究，結果表明在缺氧和富含腺苷的腫瘤微環(huán)境中，單獨抑制MAP4K1 或聯(lián)合抗程序性死亡受體1（PD-1）/程序性死亡受體 - 配體1（PD-L1）的免疫治療可能導致免疫耐受[19-20]。在拮抗劑的研發(fā)過程中，鑒于有相當多的Ste20 家族成員具有MAP4K 的功能，并且它們的激酶結構域與MAP4K1 有很高的序列同源性，因此想要開發(fā)一種高度選擇性的小分子而不抑制MAP4K1 的一個或多個密切相關的Ste20 家族成員是極具挑戰(zhàn)性的[5，21-22]。拮抗劑在應用過程中的一大難點即全身用藥的毒副作用，因此靶向給藥系統(tǒng)仍需不斷完善，以滿足臨床需求[23]。

6.2 基因編輯

通過輸注MAP4K1敲除的T 細胞以獲得強大的T 細胞功能，目前僅在小鼠身上得到成功[16]。CAR-T 療法是目前炙手可熱的免疫療法，有研究表明針對人類表皮生長因子受體2（HER2）、白細胞抗原分化簇19（CD19）和B 細胞成熟蛋白（BCMA）這3 個靶點聯(lián)合MAP4K1敲除的CAR-T 細胞體內(nèi)抗腫瘤功能均較聯(lián)合PD-1 敲除的CAR-T 細胞顯著增強[14]。MAP4K1 激酶缺失增強T 細胞功能的作用是T 細胞自主的，而不是反映MAP4K1敲除樹突狀細胞對T 細胞功能的影響[4]，故在T 細胞上單一的敲除MAP4K1應當能夠得到明顯的效果。將MAP4K1缺失的影響局限于受過基因編輯的T 細胞，自身安全性較全身性用藥有大大的提升，但是也增加了成本和制備時間。

6.3 蛋白降解靶向嵌合體（PROTACs）

降解靶蛋白是近些年抗腫瘤藥物研發(fā)的新策略，與傳統(tǒng)的直接功能抑制相比，在效率、作用持續(xù)時間和對抗補償信號方面，靶蛋白的細胞降解提供了實質(zhì)性的治療優(yōu)勢。采用此類小分子藥物預處理后，發(fā)現(xiàn)MAP4K1 抑制和降解顯著促進了CD4＋和CD8＋T 細胞的增殖以及IFN-γ的分泌，增強了抗腫瘤的效果[14]。與拮抗劑相似，如何克服其全身用藥的毒副作用也是非常重要的。

7 展望

T 細胞是免疫應答的主體細胞，但免疫細胞活化后會釋放非冗余的負調(diào)節(jié)因子（稱為免疫檢查點），這減弱了T 效應細胞的活性，使過度刺激對宿主造成損害的可能性降到最低。雖然最著名的檢查點是表達在T 細胞表面的負協(xié)同受體，如細胞毒性T 淋巴細胞相關蛋白4（CTLA-4）和PD-1，但細胞內(nèi)檢查點也是存在的，其中MAP4K1 備受關注，因為它與TCR 信號有密切關系。本文總結得出MAP4K1的敲低能夠減輕T細胞耗竭，增強T 細胞功能及細胞因子的釋放水平，提升T 細胞的穩(wěn)態(tài)水平。MAP4K1缺失的T細胞表現(xiàn)出較低的TCR 激活閾值，伴隨的高反應性表型，因此與PD-1 相似，MAP4K1 可能會是下一個腫瘤免疫治療的熱點研究對象。

如何抑制MAP4K1 功能的方法并不成熟，由于家族成員結構相似，拮抗劑的研發(fā)也并不完全安全，已經(jīng)有幾個化合物被證實與家族多個成員均可產(chǎn)生反應，蛋白降解靶向嵌合體（PROTACs）的研發(fā)也是困難重重，基因編輯技術雖然熱門但是距離能夠在臨床上應用也還有一段路要走。故而尋找更加安全和高效的靶向MAP4K1 的抑制劑，研究如何安全、便捷地進行基因敲除的研究非常重要。

綜上所述，本文總結了MAP4K1 在TME 中對T 細胞功能影響的最新進展，這對研究與MAP4K1相關的腫瘤免疫治療有重要意義，為開發(fā)以MAP4K1 為靶點的藥物以及抗腫瘤治療提供了新的思路與方案。