楊建婷，梁引庫，王全華*（.兵器工業(yè)五二一醫(yī)院藥劑科，西安 70065；.陜西理工大學生物科學與工程學院，陜西 漢中 73000）

臨床上真菌感染性疾病不斷增多，白念珠菌（又稱白假絲酵母菌）是最常見的一種條件致病性真菌病原體，定植于人體的各個部位，其生長主要受宿主免疫力、壓力、微生物菌落和其他因素的影響[1]。隨著真菌耐藥性不斷升高且日益嚴重，開發(fā)新型抗白念珠菌的植物藥成為近些年來的研究熱點[2]。我國科學家經(jīng)過幾十年的探索，發(fā)現(xiàn)許多中草藥具有抗真菌作用，對白念珠菌有抑制作用的中藥有決明子、苦參、黃芩、烏梅等[3]。中草藥活性成分抗白念珠菌的作用機制是通過破壞菌體的細胞壁、細胞膜和細胞質(zhì)的形態(tài)和結(jié)構(gòu)而達到抗真菌作用[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，蒲公英提取物對金黃色葡萄球菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌和大腸埃希菌等均有不同程度的抑制作用[5]。還有學者發(fā)現(xiàn)，通過水提、醇提、超聲提取法等分別提取出蒲公英多糖、黃酮和酚酸等，利用平板打孔法研究各活性成分對沙門菌、痢疾桿菌、大腸埃希菌、葡萄球菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果，結(jié)果顯示不同提取方法對四種菌的抑制作用不同[6]。本文在蒲公英提取物對細菌抑菌作用的研究基礎上，研究其對真菌的抑制作用，以白念珠菌為研究對象，從最低抑菌濃度（MIC）、掃描電鏡（SEM）、抑菌動力學、細胞膜通透性和對細胞壁葡聚糖合成的影響五個方面，研究蒲公英提取物對白念珠菌的抑制作用及機制，旨在從植物中尋找抗真菌藥物，為開發(fā)廣譜、高效、低毒的抗真菌藥物提供參考。

1 材料

1.1 菌株

白念珠菌（Candida albicans，C.albicans，批號：ATCC10231，該菌株凍干菌種由陜西理工大學陜西省資源生物重點實驗室菌種保藏中心提供），－80℃低溫冰箱凍存，實驗前復蘇傳代使用。

1.2 試藥

氫氧化鈉、濃鹽酸（37%）、無水乙醇、戊二醛、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、氯化鉀（天津市富宇精細化工有限公司）；吐溫80（Tween 80）、二甲基亞砜（DMSO）（天津市光復精細化工研究所）；氯霉素（上海瑞楚生物科技有限公司）；葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂粉（北京奧博星生物技術有限責任公司）；溴化鉀（PIKE，光譜純，北京英萊克科技發(fā)展有限公司）；蒲公英全草（漢中市中藥材市場，經(jīng)陜西理工大學吳三橋教授鑒定為菊科植物蒲公英）。

1.3 儀器

紫外分光光度計UV250（日本島津）；電熱恒溫培養(yǎng)箱DHP-9162（上海一恒科學儀器有限公司）；立式壓力蒸汽滅菌鍋LDZX-50KBS（上海申安醫(yī)療器械廠）；臺式高速離心機TGL-20（湖南湘儀儀器開發(fā)有限公司）；超低溫冰箱－80℃DW-86L338J（青島海爾特種電冰柜有限公司）；超凈工作臺SW-CJ-1F（蘇州凈化有限公司）；低溫冷凍干燥機SJIA-10N（寧波市雙嘉儀器有限公司）；掃描電子顯微鏡JSM-6390LV（日本電子公司）；紅外光譜儀FT-IR（美國Nicolette 公司）；真空干燥箱XMTD-8222（上海精宏實驗設備有限公司）。

2 方法

2.1 蒲公英活性成分的提取分離與純化

蒲公英有效成分根據(jù)圖1 工藝路線進行提取。提取樣品Ⅰ經(jīng)干燥后密封凍存。

圖1 蒲公英活性成分的分離純化工藝路線Fig 1 Extraction and purification of active ingredients in dandelion

2.2 液相色譜分析條件

色譜柱：DiKMA Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速：1.0 mL·min－1；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。乙腈為流動相A，0.1%甲酸水溶液為流動相B，使用梯度洗脫（0 ～10 min 92% B；10 ～24 min，92% →86%B；24 ～35 min，86%→77%B；35 ～56 min，77%→76%B；56 ～60 min，76%→68%B）[7]。

2.3 MIC 測定

將活化后的白念珠菌單菌落接種于沙式液體培養(yǎng)基，37℃、200 r·min－1培養(yǎng)12 h，用沙式液體培養(yǎng)基將菌液濃度調(diào)至1×107CFU·mL－1，配制280 mg·mL－1蒲公英樣品Ⅰ母液，備用。分別向裝有2 mL 沙式培養(yǎng)基的試管中加入蒲公英樣品Ⅰ，使培養(yǎng)基中蒲公英樣品Ⅰ最終質(zhì)量濃度為0、4.0、8.0、16.0、32.0、48.0、64.0 mg·mL－1，以0 mg·mL－1作為對照，按5%（V/V）接入備用菌液，分別于37℃、200 r·min－1培養(yǎng)24 h，用分光光度計測A600nm值。與前一濃度相比較，當A600nm下降≥95%時的樣品的濃度即為蒲公英樣品Ⅰ的MIC[8]。每組設置3 個平行。

2.4 SEM

用1×107CFU·mL－1菌液配制280 mg·mL－1蒲公英樣品Ⅰ母液，備用。取2 mL 懸浮菌體，分別加入蒲公英樣品Ⅰ母液，使溶液中蒲公英樣品Ⅰ最終濃度為0、0.5、1、2×MIC，以0×MIC作為對照，分別于37℃、200 r·min－1培養(yǎng)。當培養(yǎng)至5 h 時，取1 mL 的菌體樣品，4℃、8000 r·min－1離心6 min，PBS（pH 5.8）洗滌2 次。加入2.5%戊二醛過夜固定，使用呈梯度濃度的乙醇溶液（50%、60%、70%、80%、90%）重懸浸泡10 min，于4℃、8000 r·min－1離心6 min；乙醇重懸浸泡10 min，4℃、8000 r·min－1離心6 min，2 次，脫水，用真空冷凍干燥機干燥12 h。鍍金后上SEM 觀察[9]。每組設置3 個平行。

2.5 抑菌動力學分析

用1×107CFU·mL－1菌液配制280 mg·mL－1蒲公英樣品Ⅰ母液，備用。分別向裝有4 mL 沙式液體培養(yǎng)基的試管中加入蒲公英樣品Ⅰ，使培養(yǎng)基中蒲公英樣品Ⅰ最終濃度為0、1、3×MIC，以0×MIC作為空白對照，按5%（V/V）接入備用菌液，分別于37℃、200 r·min－1培養(yǎng)，每隔3 h 取樣200 μL，測其A600nm值。每組設置3 個平行。按式1 計算白念珠菌存活率和抑菌率[10-11]。

式1：存活率（%）＝A600nm（加入抗菌樣的吸光度）/A600nm（未加入抗菌樣的吸光度）×100%。

2.6 核酸吸光度法研究細胞膜通透性

按照“2.3”項下方法培養(yǎng)白念珠菌，將菌液于6000 r·min－1離心10 min，收集菌體，pH 5.8 PBS 洗3 次。用含0.01% Tween 80 的pH 5.8 PBS懸浮菌體，調(diào)整為1×109CFU·mL－1。分別向裝有2.5 mL 懸浮菌體的10 mL 試管中加入蒲公英樣品Ⅰ，使溶液中蒲公英樣品Ⅰ最終濃度為0、0.5、1、2×MIC，以0×MIC作為空白對照，37℃、200 r·min－1培養(yǎng)，分別于0、1、2、4、6 h 取樣200 μL，6000 r·min－1離心10 min 后測上清液A260nm值[12]。每組設置3 個平行。

2.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析使用SPSS 22.0、Origin 8.0 軟件，物質(zhì)結(jié)構(gòu)式繪制使用ChemDraw 軟件，圖片處理使用Photoshops 5.0。數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學評估，使用單因素方差分析（ANOVA）來比較差異組，P＜0.05 代表差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 蒲公英抑菌成分的分離及鑒定

HPLC 分析蒲公英樣品Ⅰ組分（見圖2），發(fā)現(xiàn)該組分在280 nm 處主要有8 種化合物，其保留時間依次為21.5、27.9、30.3、37.2、38.9、39.8、44.7 和66.2 min，相對百分含量分別為11.45%、3.96%、10.48%、34.24%、3.91%、11.80%、3.65%和4.21%。經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)峰1、峰2、峰3、峰4、峰5 和峰6 依次被初步確定為4-香豆酸、阿魏酸、槲皮素戊糖苷、3，5-二-O-咖啡?？崴帷?，5-二-O-咖啡?？鼘幩岷湍鞠菟?，而峰7 和峰8為未知化合物。

圖2 蒲公英樣品Ⅰ的HPLC 色譜圖Fig 2 HPLC chromatogram of dandelion sampleⅠ

3.2 MIC 的測定

結(jié)果表明隨著蒲公英樣品Ⅰ質(zhì)量濃度增加，白念珠菌A600nm逐漸下降，在32.0 mg·mL－1時，菌液A600nm為對照的0.048%，吸光值下降幅度達95%。表明蒲公英提取物對白念珠菌的抑制率可達95%，且隨著濃度增加，菌液A600nm下降幅度均大于95%。表明蒲公英提取物對白念珠菌的MIC值為32.0 mg·mL－1。

3.3 SEM 分析

SEM 觀察發(fā)現(xiàn)，對照組處理5 h 后，白念珠菌結(jié)構(gòu)完整，外觀飽滿，菌體成近乎橢圓形，表面光滑，折光性好（見圖3A ～C）。0.5×MIC樣品Ⅰ作用5 h 后的白念珠菌細胞表面基本和空白對照組一樣，但表面變得粗糙，折光性減弱（見圖3D ～F）。1.0×MIC樣品Ⅰ處理白念珠菌5 h后，多數(shù)白念珠菌細胞不再呈現(xiàn)橢球形，結(jié)構(gòu)基本完整，但表面有褶皺，部分菌體出現(xiàn)凹陷。表面比較粗糙，細胞體積開始縮?。ㄒ妶D3G ～I）。2.0×MIC樣品Ⅰ處理白念珠菌 5 h 后，全部白念珠菌細胞不再呈現(xiàn)橢球形，細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)不規(guī)則，細胞明顯縮小，表面褶皺且極度粗糙，部分菌體出現(xiàn)嚴重凹陷，細胞膜破損，導致內(nèi)容物外泄（見圖3K、L）；圖3J 顯示，全部白念珠菌細胞明顯縮小，表面褶皺、嚴重凹陷及細胞膜破損在圖片上不甚明顯，考慮是菌體細胞明顯縮小，在放大2000 倍時菌體形態(tài)變化掃描電鏡不能顯示出顯著性差異。綜上可知，樣品Ⅰ能夠使細胞體積縮小，結(jié)構(gòu)不對稱并且表面形成褶皺，從而破壞白念珠菌的正常形態(tài)。其原因可能是由于細胞內(nèi)容物的大量外泄使得白念珠菌細胞壁、細胞膜凹陷，形成褶皺。

圖3 白念珠菌的SEM 圖像Fig 3 SEM images of C.albicans

3.4 抑菌動力學分析

微生物生長包括四個時期：緩慢期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期。樣品Ⅰ對白念珠菌生長周期的抑制可根據(jù)生長曲線中的指數(shù)期進行分析。白念珠菌對數(shù)生長期的動力學方程可表示為[13]：

其中，μ是生長速率，N為t時刻的微生物數(shù)量。

假設微生物的比生長速率為一個常數(shù)，

抑菌動力學是通過繪制白念珠菌的抑制生長曲線來研究抗菌性能。樣品Ⅰ對白念珠菌生長曲線的影響如圖4 所示，由圖4 可知，空白對照組的菌體生長狀態(tài)良好，當加入樣品Ⅰ后，菌液的光密度值降低，表明樣品Ⅰ對白念珠菌有較好的抑制作用。當樣品Ⅰ濃度為1.0×MIC時A600nm隨時間有明顯變化，樣品濃度為3.0×MIC時A600nm變化不大，表明白念珠菌生長受到嚴重抑制，樣品Ⅰ對白念珠菌的抑菌作用增強。分析樣品Ⅰ對白念珠菌生長速率及白念珠菌的抑制率發(fā)現(xiàn)（見表1），正常情況下白念珠菌的比生長速率為0.05，分別加入1.0×MIC和 3.0×MIC的樣品Ⅰ后，其生長速率則分別減小到0.02 和0.00，加入3.0×MIC樣品Ⅰ后白念珠菌基本不生長，其抑制率達到了97.13%。由此可知樣品Ⅰ對白念珠菌的抑制作用主要是作用于其對數(shù)期的生長，使白念珠菌的生長速度大幅度的降低，而抗菌效果取決于樣品Ⅰ的濃度和作用時間[10]。

圖4 三種濃度的樣品Ⅰ對白念珠菌的抑菌曲線Fig 4 Antibacterial curves of three concentrations of sampleⅠ on C.albicans

表1 C.albicans 在不同濃度樣品Ⅰ中的抑制率及比生長速率(對數(shù)生長期)Tab 1 Inhibition rate and growth rate of C.albicans in different concentrations of sampleⅠ(logarithmic growth phase)

3.5 細胞膜通透性分析

正常情況下，完整的細胞膜選擇性通透，會阻擋胞內(nèi)大分子物質(zhì)外流。而當導致膜損傷的殺菌劑存在時，殺菌劑會破壞細胞膜，本來不能透過細胞膜的具有紫外吸收的核酸類物質(zhì)便泄漏到培養(yǎng)液中，導致培養(yǎng)液在260 nm 處的吸光度值增大。因此，通過測定培養(yǎng)液260 nm 處的吸光度值能夠預測菌體細胞膜的完整性。由圖5 可知，空白對照組（0×MIC）的培養(yǎng)液在260 nm 波長的紫外吸光值隨著培養(yǎng)時間的增加逐漸增大，表明白念珠菌在培養(yǎng)過程中伴隨細胞膜破壞，菌體的死亡。分別加入0、0.5、1.0、2.0×MIC的樣品Ⅰ后，培養(yǎng)液的紫外吸收值也隨著培養(yǎng)時間的增加而增大，且都表現(xiàn)出在同一時間高于對照組的現(xiàn)象，且有些達到了顯著水平。這表明蒲公英樣品Ⅰ損壞了白念珠菌細胞膜，導致膜的通透性增加，進而導致細胞死亡。

圖5 三種濃度的樣品Ⅰ對白念珠菌細胞膜通透性的影響Fig 5 Influence of samplesⅠ at three concentrations on cell permeability of C.albicans

4 討論

白念珠菌細胞壁的主要成分是己糖或氨基己糖，對于維持細胞形態(tài)和胞內(nèi)高滲狀態(tài)起著重要作用。白念珠菌細胞膜主要由磷脂類、鞘脂類和麥角甾醇等組分構(gòu)成，是一種滲透屏障，是小分子和信號傳導的通路，并為各種功能蛋白提供基質(zhì)結(jié)構(gòu)。細胞壁和細胞膜對完成胞內(nèi)外物資交換、營養(yǎng)物質(zhì)吸收和生物合成等方面起重要作用，這些結(jié)構(gòu)一旦被破壞，其功能作用喪失，將導致真菌細胞死亡[14]。抗真菌藥物的作用機制包括作用于真菌細胞膜中甾醇合成、作用于真菌細胞壁合成、作用于核酸合成，其實質(zhì)都是破壞菌體的超微結(jié)構(gòu)。本文研究發(fā)現(xiàn)蒲公英提取物可以破壞白念珠菌的細胞膜，可能是其抗真菌活性的抑菌機制。但是，對中藥抗白念珠菌作用機制的研究，不應該只局限于電鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)變化和對白念珠菌的宏觀影響上，應從分子水平上探討中藥活性成分是如何作用于這些細胞結(jié)構(gòu)并使其發(fā)生改變，尤其是對生物膜主要成分合成酶的影響，分離酶基因從基因?qū)用娼沂局兴幙拐婢饔脵C制。

White 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，白念珠菌在受到外界環(huán)境的抑制時，其編碼目標酶ERG11基因會發(fā)生改變改變，而細胞外排泵基因CDR1、CDR2和MDR1會過表達進而菌體死亡。Denning[16]研究發(fā)現(xiàn)，從溶菌芽孢桿菌C3 分離得到的酰胺B（ATB）可誘導細胞凋亡，ATB 通過抑制細胞G2/M 期細胞周期停滯的微管蛋白聚合而發(fā)揮作用的。表面活性劑對白念珠菌的作用，主要是對菌絲發(fā)育、細胞膜形態(tài)有強烈的影響，這種影響與肌動蛋白骨架的異常組織和隨后的菌絲相關因子的極化轉(zhuǎn)運缺陷有關[17]。細胞壁β-葡聚糖在白念珠菌生長過程中起到了重要作用[18-19]?？ú捶覂敉ㄟ^抑制白念珠菌細胞壁β-葡聚糖的合成，從而達到抑制白念珠菌增長的目的[20]。本研究分析了樣品Ⅰ對白念珠菌的MIC值為32.0 mg·mL－1。抑菌動力學方程分析發(fā)現(xiàn)樣品Ⅰ對白念珠菌的抑制作用主要是作用于其指數(shù)生長期。樣品Ⅰ可破壞白念珠菌細胞結(jié)構(gòu)，導致細胞表面凹陷，形成褶皺。細胞膜通透性分析發(fā)現(xiàn)，樣品Ⅰ導致細胞內(nèi)容物外泄。這進一步表明蒲公英提取物是通過作用于白念珠菌細胞的細胞壁，通過破壞細胞壁進而導致內(nèi)容外泄而引起細胞凋亡的。

雖然在中藥抗白念珠菌的研究方法和作用機制方面已經(jīng)取得了不少進展，但仍然存在諸多未知領域，需要進一步深入探討，為真菌疾病的治療提供新的選擇。