韋慧麟，任亞鋒，白俊敏，王永福，牛秋妍，陳凈

1.河南中醫(yī)藥大學康復醫(yī)學院，河南 鄭州 450046；2.河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院康復中心，河南 鄭州 450000

脊髓損傷的發(fā)病率較高，超過80%的脊髓損傷患者都經歷了某種程度的膀胱功能障礙，原因是神經系統(tǒng)損傷，導致神經源性逼尿肌反射異常和括約肌功能不全。目前，脊髓損傷后腎衰竭的病死率已急劇下降，但對神經源性膀胱相關癥狀的治療和由該病導致的生活質量下降仍然是臨床亟待解決的問題[1]。近年來，信號通路研究逐漸成為脊髓損傷后各種并發(fā)癥發(fā)病機制研究的熱點，為神經源性膀胱的治療提供了新思路。針灸療法具有功效顯著、安全性高、操作簡單、成本低的優(yōu)勢，大量研究證實，針刺干預對脊髓損傷所致神經源性膀胱有效[2]。因此，探討針刺干預脊髓損傷后神經源性膀胱所依賴的信號通路及其作用機制具有重要意義，可以為未來實驗研究提供客觀的理論依據(jù)和實踐參考。

1 針刺干預脊髓損傷后神經源性膀胱信號通路

1.1 細胞凋亡信號通路細胞凋亡是繼發(fā)性脊髓損傷重要的病理生理機制，會造成脊髓組織中多條信號途徑中斷和局部微環(huán)境失衡。細胞凋亡信號通路主要有線粒體凋亡途徑(內源性途徑)、死亡受體凋亡途徑(外源性途徑)和內質網途徑等。其中，線粒體途徑是研究較為透徹的經典凋亡途徑，主要活化機制為：線粒體膜間隙中的細胞色素C(cytochrome C，Cytc)凋亡誘導因子等促凋亡蛋白在三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate，ATP)等的作用下釋放至胞漿內，與凋亡蛋白酶激活因子-1(apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1)形成多聚復合體，繼而激活下游靶蛋白Caspase-3、Caspase-9，最終導致細胞凋亡。目前，針刺干預脊髓損傷后神經源性膀胱主要是通過抑制線粒體途徑介導的相關凋亡因子表達，同時借助各通路間的交互關系，共同抑制細胞凋亡，從而促進膀胱功能恢復。

Xu等[3]以電針(疏密波：疏波10 Hz、5 s，密波50 Hz、9 s，20 min，每天1次)次髎、中極、三陰交和大椎穴治療骶上脊髓損傷后大鼠神經源性膀胱，連續(xù)干預7 d后發(fā)現(xiàn)，大鼠脊髓組織凋亡率降低，膀胱順應性增加，其作用機制可能與膀胱組織中促凋亡蛋白Cyt-C、caspase-3和caspase-9的表達下調有關，有助于重塑脊髓功能，提高盆底肌群的協(xié)調性。艾坤等[4]采用相同的針刺手法進行實驗研究，發(fā)現(xiàn)電針次髎、中極、三陰交穴可直接抑制膀胱逼尿肌細胞中caspase-3蛋白的激活，提高逼尿肌收縮能力，舒張尿道外括約肌，對大鼠骶髓損傷后逼尿肌無反射型膀胱具有一定的保護作用。有研究發(fā)現(xiàn)，電針大椎、次髎、中極、三陰交等穴位可以降低骶部脊髓損傷大鼠膀胱組織中Apaf-1、Cyt-C和活化caspase-3、caspase-9蛋白的表達，促進脊髓功能恢復，調節(jié)膀胱及盆底神經支配，從而抑制逼尿肌反射亢進[3]。

1.2 細胞間信號通路

1.2.1 腦源性神經營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)/酪氨酸受體激酶B(tyrosine kinase receptor B，TrkB)信號通路BDNF是調控神經細胞發(fā)育、再生和存活的一種蛋白質，通常與其高親和力TrkB結合，發(fā)揮促神經恢復的作用，脊髓損傷后膀胱組織的修復與髓內細胞中BDNF蛋白及基因表達的增加有關[5]。針灸可以促進細胞BDNF的表達與激活，影響絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)/細胞外信號調節(jié)蛋白激酶(extracellular signal-regulated protein kinase，ERK)、磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3-kinases，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)和cAMP等信號傳導途徑，抑制神經變性，改善神經元功能[6]。連續(xù)10 d電針(疏密波：疏波2 Hz，密波15 Hz，強度1 mA，20 min，每天1次) 關元穴、水道穴，可以提高脊髓損傷后尿潴留大鼠膀胱平滑肌興奮性，其作用機制可能與上調BDNF與TrkB在脊髓組織中的表達有關，且電針關元穴的治療效果明顯優(yōu)于電針水道穴[7]。

1.2.2 超極化激活環(huán)狀核苷酸門控通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gate cation channel，HCN)膀胱Cajal間質細胞(interstitial cells of Cajal，ICCs)可能是膀胱自身源性的興奮性調節(jié)機制的樞紐，通過細胞間的各種離子通道或受體，將神經興奮性信號傳輸至逼尿肌[8]。HCN在哺乳動物中有4種亞型(HCN1-4)，且僅在膀胱ICCs細胞中表達，其中HCN1通道是最重要的一種。研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)14 d電針(疏密波：密波20 Hz，疏波4 Hz，15 min，每天1次)次髎穴[9]，連續(xù)10 d電針(連續(xù)脈沖電流，頻率2 Hz，強度0.5 mA，20 min，每天1次)中髎、中極、關元穴[10]，可以有效減少脊髓損傷后大鼠膀胱組織中ICC數(shù)量和HCN通道數(shù)量，降低膀胱逼尿肌中HCN mRNA及其蛋白質表達，改善大鼠膀胱逼尿肌的不穩(wěn)定收縮頻率和儲存過程中逼尿肌的最大壓力。

1.2.3 縫隙連接蛋白(connexin，Cx)Cx是細胞間興奮傳導通道，小鼠逼尿肌興奮性改變和Cx43表達與脊髓損傷平面有關，骶上脊髓損傷小鼠逼尿肌反射亢進，Cx43表達升高，骶下脊髓損傷小鼠的狀態(tài)則相反[11]。尿道上皮Cx43的表達與ATP釋放存在同步晝夜節(jié)律，腺苷酸活化蛋白激酶(Amp-activated proteinkinase，AMPK)是參與多種信號通路的關鍵蛋白，其活化機制主要是減少ATP消耗，維持細胞能量穩(wěn)態(tài)，降低小鼠逼尿肌Cx43 mRNA及蛋白表達[12]。

1.2.4 平滑肌肌動蛋白(smooth muscle actin，SMA)SMA是一種廣泛存在于細胞的微絲蛋白，有α、β、γ三種形式，其中α-SMA主要分布于膀胱肌層，是肌細胞收縮裝置的一部分。膀胱順應性與逼尿肌收縮肌絲中α-SMA的表達密切相關，脊髓橫斷后，α-SMA表達的減少會降低逼尿肌收縮功能，使膀胱呈現(xiàn)無力、大容量的弛緩狀態(tài)[13]。連續(xù)10 d電針(疏密波，疏波2 Hz，密波15 Hz，強度 1 mA，20 min，每天1次)關元穴，能有效增加脊髓損傷尿潴留大鼠逼尿肌中α-SMA的表達，降低逼尿肌最小張力，提高膀胱收縮頻率及興奮性[14]。Mitsui等[15]在探討交感神經放松逼尿肌平滑肌及黏膜肌層的功能時發(fā)現(xiàn)，二者均表達出α-SMA免疫反應性，黏膜肌層是逼尿肌主要的收縮元件。

1.3 Wnt/β-catenin信號通路Wnt信號通路是由配體蛋白Wnt與七次跨膜蛋白受體Frizzled相結合而激發(fā)一系列下游信號蛋白轉錄的轉導途徑，共有Wnt/β-catenin通路、平面細胞極性Wnt/PCP通路、Wnt/Ca2+通路3條分支，其中研究最多、最經典的為Wnt/β-catenin 信號通路，它在整個生物進化過程中十分保守，主要活化機制為Wnt信號與Fzd受體結合，引發(fā)膜上輔助性受體被糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)磷酸化，與胞質內大蛋白復合物中的支架蛋白Axin結合，從而使β-catenin從復合物中解離，防止被泛素化，最終使活性因子β-catenin在胞內富集并轉位到核內，與調控元件TCF結合，激活靶轉錄基因。Wnt/β-catenin信號通路被證實與針刺干預脊髓損傷后細胞凋亡、軸突引導、干細胞分化、神經元存活等有關[16]，該通路中 Wnt-1、β-catenin、GSK-3β等重要分子可能是治療脊髓損傷后神經源性膀胱功能障礙的作用靶點，干預機制為誘導內源性神經干細胞 (endogenous neural stem cells，ENSCs)增殖分化為神經元，促進突觸再生和神經修復[17]。

轉錄調控蛋白β-catenin是鈣黏蛋白復合物的主要成分之一，其在胞質中的穩(wěn)定性以及在核內的積累是這條信號通路的核心。研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)7 d電針(疏密波：疏波10 Hz，密波50 Hz，留針20 min，每天1次)大椎、次髎穴，可以提高大鼠脊髓組織中Wnt-1、β-catenin mRNA及Ngn1蛋白等的表達水平，顯著改善T10脊髓橫斷后膀胱逼尿肌反射亢進大鼠的泌尿功能[18]。CyclinD1作為細胞周期調控中最重要的亞單位，與β-catenin的表達呈正相關，是該信號通路的下游靶基因，上述電針針法可以上調脊髓組織中CyclinD1 mRNA表達，促進脊髓內源性神經干細胞的增殖與活化[19]。

1.4 PI3K/AKT/mTOR信號通路PI3K是一種脂類激酶，可被多種細胞因子、生長因子和激素等信號激活，其中，神經生長因子(nerve growth factor，NGF)是神經營養(yǎng)因子家族中的關鍵成員，與其絡氨酸蛋白激酶受體A(tyrosine kinase，TrKA)的結合與膀胱逼尿肌興奮性密切相關，可以抑制脊髓損傷局部細胞自噬，重建膀胱功能[20]。研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)7 d針刺夾脊穴可以增加脊髓組織中NGF與TrKA的表達，促使PI3K/AKT信號通路磷酸化，下調脊髓組織中自噬標志蛋白LC3B表達，上調P-AKT、P-mTOR和自噬特異性底物P62表達，從而抑制脊髓損傷后神經元細胞的自噬，重塑脊髓神經功能，改善膀胱尿潴留癥狀[21]。研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)4周電針(直刺 4～5 mm，疏密波，2 Hz，20 min，每天1次，每周5次)第2骶后孔神經，可以使NGF及其受體TrkA增殖，激活下游PI3K/AKT通路，激活相關抗凋亡因子，改善膀胱神經支配[22]。

mTOR是PI3K/AKT信號通路下游的一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，激活的mTOR可以有效減少神經組織損傷和繼發(fā)性脊髓損傷[23]。mTOR有mTORC1和mTORC2兩種功能復合物，其中mTORC1是細胞增殖、凋亡和自噬的主要調節(jié)劑，可以激活下游靶蛋白p70S6K與4EBP1，促使核糖體活化、多肽翻譯、嘧啶合成及細胞骨架形成[24]。研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)28 d電針(深度5～7 mm，頻率2 Hz，強度1 mA，20 min，每天1次)脊髓損傷后大鼠大椎穴、命門穴，可以上調脊髓組織中p-PI3K/PI3K、p-mTOR/mTOR和p-p70S6/p70S6比值，下調負調控因子PTEN和caspase-3表達水平，促進脊髓神經功能恢復[25]。此外，PI3K/AKT信號通路的激活也可以上調或下調關鍵細胞周期的相關基因轉錄和蛋白質水平，包括CyclinD1、CyclinE、Bcl-2、CDK2和CDK4等，共同發(fā)揮抗細胞凋亡作用[26]。

1.5 cAMP/PKA信號通路垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽(pituitary adenylate cyclase activating polypeptide，PACAP)是1989年日本學者在綿羊下丘腦中發(fā)現(xiàn)的一種神經肽，有PACAP-38、PACAP-27兩種生物活性。PACAP可以通過第二信使cAMP激活細胞質基質中的蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)，促使PKA的催化亞基C進入細胞核，磷酸化環(huán)磷酸腺苷反應元件結合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)和功能蛋白，調節(jié)靶基因轉錄，產生細胞效應和基因表達，維持生物體多種生理系統(tǒng)的平衡。PACAP根據(jù)目標組織中的受體亞型表達產生差異性下游效應，生物組織學證實了PACAP及其同源受體PAC1在下尿道組織中的特異性分布[27]。膀胱功能的恢復與cAMP/PKA信號通路的激活密切相關，可以抑制神經細胞凋亡，保護脊髓神經調控作用[28]。PKA還可以使肌球蛋白輕鏈激酶失活，影響其與Ca2+-鈣調蛋白復合物的親和力，使其對鈣離子失敏，促使膀胱平滑肌細胞舒張[29]。

激活cAMP/PKA信號通路，調控膀胱逼尿肌內收縮元件磷酸化，是針刺重建脊髓損傷后神經源性膀胱功能的重要機制。研究表明，連續(xù)7 d電針(疏密波：疏波10 Hz，密波50 Hz，20 min，每天1次)次髎、中極、三陰交、大椎等穴，可以增加受損脊髓組織中PAC1R、PACAP-38蛋白表達[30]，促進膀胱逼尿肌內MLCK、MLCP的磷酸化[31]，降低骶上脊髓損傷后神經源性膀胱大鼠逼尿肌的病理損害程度，促進平滑肌細胞舒張，降低膀胱內壓。研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù) 7 d 以毫針(0.25 mm×13.0 mm)針刺(斜入約 2 mm，20 min，每天1次)夾脊穴，配合低頻電刺激，可以上調脊髓損傷后尿潴留模型大鼠脊髓和膀胱逼尿肌組織中PACAP蛋白表達，增加脊髓和逼尿肌組織內cAMP、PKA含量，促進脊髓神經修復，誘導逼尿肌舒張，改善膀胱功能[32]。

1.6 MAPK信號通路膀胱逼尿肌細胞收縮功能的改變與MAPK信號通路的激活密切相關[33]。MAPK信號通路在細胞增殖、分化、凋亡、血管生成中發(fā)揮重要作用，主要包括ERK1/2、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、p38MAPK和ERK5共4條通路[34]。目前已發(fā)現(xiàn)，JNK和p38 MAPK通路主要與細胞凋亡和炎癥反應有關，ERK/MAPK信號通路是研究最深入的MAPK信號通路，與細胞的增殖和分化密切相關[35]。

研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)15 d毫針針刺(進針約2 mm，留針15 min，每天1次)大椎、腎俞、足三里能明顯抑制小鼠脊髓組織內p38MAPK信號通路的激活，下調脊髓組織中p-p38MAPK的蛋白含量，下調小鼠血清中IL-1β的蛋白表達，共同改善小鼠神經功能損傷癥狀[36]。電針夾脊穴能夠抑制ERK5信號通路下游因子CREB、Bcl-2的表達與活化，抑制脊髓損傷大鼠神經細胞凋亡[37]。激活ERK1/2信號通路可以調節(jié)脊髓施萬細胞的增殖，有效修復脊髓損傷后大鼠神經功能，減少二次脊髓損傷[38]。

1.7 嘌呤能受體信號途徑嘌呤遞質主要有腺苷、ATP和二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)，嘌呤受體可分為P1和P2兩大類，其中P2受體又可分為P2X(包含P2X1～P2X7 7個亞型)和P2Y(包含P2Y1、P2Y2、P2Y4、P2Y6、P2Y11、P2Y12、P2Y13、P2Y14 8個亞型)兩大家族[39]。在家兔膀胱舒張時，膀胱上皮釋放的ATP可以刺激尿道感覺神經，產生激活排尿反射的信號[40]，由此可知ATP可能是膀胱的傳入信號，作用是使膀胱逼尿肌興奮[41]。在人和大鼠的逼尿肌肌膜中均發(fā)現(xiàn)有P2X受體，逼尿肌中P2X2受體表達量的增加[42]和P2X3、P2X5等受體表達的缺失都會影響脊髓損傷后膀胱收縮功能[43]。

ATP作為一種非腎上腺素非膽堿能神經遞質，在生物體內有廣泛的受體介導作用，可以作用于膀胱P2X多種亞型受體，其中，作用于P2X3、P2X5受體對脊髓損傷后膀胱功能的恢復尤為重要[44]。研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)12 d隔姜灸(每個穴位灸10 min)關元、命門、足三里、陰陵泉等穴，可以提高脊髓損傷大鼠脊髓神經節(jié)嘌呤能P2X3受體表達，從而改善膀胱功能[45]。連續(xù)14 d電針關元、次髎穴，可以提高脊髓損傷后大鼠逼尿肌ICC數(shù)量及表面受體P2X5的陽性表達率，改善逼尿肌的收縮功能[46]。此外，大鼠膀胱逼尿肌上的P2Y2、P2Y4受體表達與脊髓損傷節(jié)段有關，P2Y2、P2Y4表達增高可能是引起逼尿肌反射亢進的機制之一[47]。

2 小結與展望

各信號通路之間不是簡單的直線型結構，而是網狀調節(jié)模式，存在許多復雜的串擾效應，即一條信號轉導通路的激活信號分子可以調節(jié)另一條信號轉導通路中的信號分子，而激活的信號分子就是產生串擾效應的關鍵目標，也是實驗研究的重要靶目標。針刺干預脊髓損傷后神經源性膀胱信號通路的相關研究已成為當下的研究熱點，今后需關注以下方面：目前實驗研究多集中于單一信號分子或通路層面上，各通路之間的交互作用有待進一步證實；針刺穴位、干預方法及參數(shù)選擇缺乏統(tǒng)一標準，難以分析療效間關系，且針刺療效一般持續(xù)7 d，時間較短，且缺乏遠期隨訪；針刺通過干預MAPK信號通路、抑制脊髓組織細胞凋亡，從而提高膀胱逼尿肌細胞收縮功能，這一機制需要更多的臨床試驗來證實；目前已證實針刺可以激活cAMP/PKA信號通路，火針夾脊穴可以雙向調節(jié)Wnt/ERK多信號通路，進而干預脊髓損傷后膀胱功能的恢復[48]，但研究尚缺乏對這些通路上下游信號分子及其他相關轉錄蛋白的基因表達檢測，且尚無研究證實針刺改善脊髓損傷后膀胱收縮功能與這些信號通路間的直接關系；轉化生長因子TGF-β1與Smad3蛋白信號可能通過影響Cx43表達影響排尿功能[49]，這些蛋白信號分子為針刺干預脊髓損傷后膀胱逼尿肌功能研究提供了新的思路；現(xiàn)有研究已證實嘌呤能信號與脊髓損傷后神經源性膀胱運動與感覺功能有關，而五羥色胺、血管活性腸肽、降鈣素基因相關肽、P物質等亦可能是其重要分子機制，有望為今后臨床研究提供新的干預靶點[50]。