丁清龍 蘇妙貞 周露

（廣東省食品檢驗(yàn)所 廣東廣州 510435）

1 前言

雙歧桿菌是細(xì)菌分類學(xué)層面上屬的名稱，是一類厭氧的、革蘭氏陽(yáng)性菌，被認(rèn)為是人體健康的重要標(biāo)志之一，可以在人體腸道內(nèi)定殖，阻止人體內(nèi)有害致病微生物的繁殖，調(diào)節(jié)人體腸道菌群的微生態(tài)平衡[1]，還具有防癌、降低膽固醇、抗衰老等多種對(duì)機(jī)體健康有益的作用[2-3]。根據(jù)2002年FAO/WHO對(duì)益生菌的定義，雙歧桿菌屬于益生菌的范疇。相關(guān)研究表明，攝入一定量的雙歧桿菌對(duì)維持和改善機(jī)體健康具有重要作用[4]。因此，雙歧桿菌常作為一種營(yíng)養(yǎng)因子被添加至酸奶、保健食品、嬰幼兒配方食品、特殊醫(yī)學(xué)用途食品中。

在食品中加入的雙歧桿菌主要有6種：長(zhǎng)雙歧桿菌（Bifidobacterium longum）、短雙歧桿菌（Bifidobacterium breve）、兩歧雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidum）、青春雙歧桿菌（Bifidobacterium adolescentis）、動(dòng)物雙歧桿菌（Bifidobacterium animalis）和嬰兒雙歧桿菌（Bifidobacterium longum subsp.infantis）。不同種類的雙歧桿菌，具有不同的生理作用。以嬰幼兒食品為例，我國(guó)衛(wèi)生部發(fā)布的《關(guān)于公布可用于嬰幼兒食品的菌種名單的公告》中，規(guī)定了允許添加的雙歧桿菌的菌種類別[5]。對(duì)于標(biāo)識(shí)含雙歧桿菌的食品，其添加的雙歧桿菌種類不僅要符合食品經(jīng)濟(jì)價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的要求，也必須符合監(jiān)管部門的規(guī)定。因此，食品中雙歧桿菌種類的鑒定具有重要意義。

目前，用于細(xì)菌鑒定的方法均可用于鑒定雙歧桿菌，主要包括生化鑒定法、質(zhì)譜鑒定法和分子生物學(xué)法。生化鑒定法較為傳統(tǒng)，現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.34-2016中的雙歧桿菌檢驗(yàn)即采用該方法[6-7]。質(zhì)譜鑒定法主要是基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法（MALDI-TOF MS），利用該技術(shù)，能夠使菌體蛋白電離構(gòu)建的“指紋圖譜”實(shí)現(xiàn)多種益生菌的鑒定[8]。分子生物學(xué)方法包括DNA印記技術(shù)、脈沖場(chǎng)電泳技術(shù)、基于PCR擴(kuò)增的16SrDNA和16S-23SrDNA間序列分析和全基因組測(cè)序[9-10]。

本文應(yīng)用生化鑒定法、MALDI-TOF質(zhì)譜法和全基因測(cè)序法這3種方法對(duì)目前食品中可能添加的多種雙歧桿菌進(jìn)行鑒定，并對(duì)這3種方法的鑒定結(jié)果進(jìn)行綜合比較與分析，以期為雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法的改進(jìn)和添加雙歧桿菌食品的日常監(jiān)管提供技術(shù)參考。

2 材料與方法

2.1 主要儀器與試劑

生化培養(yǎng)箱（LRH-250，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；生物安全柜（AC2-4S1，新加坡Esco）；全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀（VITEK 2 Compact，法國(guó)生物梅里埃股份有限公司）；MALDI-TOF質(zhì)譜儀（VITEK MS，法國(guó)梅里埃股份有限公司）；離心機(jī)（5430，德國(guó)Eppendorf）。

全基因組測(cè)序委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行，二代測(cè)序儀為Illumina公司生產(chǎn)的novaseq。

MRS培養(yǎng)基（北京路橋技術(shù)股份有限公司）；厭氧菌及棒狀桿菌鑒定卡片（生物梅里埃美國(guó)股份有限公司）；質(zhì)譜樣品處理基質(zhì)溶液（生物梅里埃法國(guó)股份有限公司）；全自動(dòng)微生物質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)-VITEK MS-DS靶板（生物梅里埃法國(guó)股份有限公司）；細(xì)菌基因組提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）。

實(shí)驗(yàn)中所使用的雙歧桿菌盲樣，均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，樣品信息見(jiàn)表1。

表1 雙歧桿菌盲樣

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 菌種分離

將含有盲樣的西林瓶在室溫條件下平衡5 min；向其中加入1 mL無(wú)菌生理鹽水，使盲樣溶解并混合均勻；使用無(wú)菌生理鹽水將溶解的樣品稀釋1 000倍；吸取100 μL稀釋后的樣品液于MRS平板涂布，厭氧條件下36℃培養(yǎng)48 h；待生菌后，挑取單菌落劃線于MRS平板；厭氧條件下36℃培養(yǎng)48 h，得到雙歧桿菌可疑菌。

2.2.2 VITEK生化鑒定

用無(wú)菌接種環(huán)挑取部分雙歧桿菌可疑菌菌苔，置于0.45%無(wú)菌生理鹽水中，制備菌懸液；使菌懸液的麥?zhǔn)蠞岫瓤刂圃?.7～3.3之間；取出厭氧菌及棒狀桿菌鑒定卡片插入菌懸液中，在VITEK 2 Compact上進(jìn)行檢測(cè)。

2.2.3 MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定

用接種環(huán)挑取1環(huán)待測(cè)樣品，置于裝有300 μL超純水的Eppendorf管中，渦旋混合1 min；向其中加入900 μL無(wú)水乙醇，渦旋混合1 min；將Eppendorf管13000r/min離心2min，去除上清液，重復(fù)離心1次；用移液器去除殘留的乙醇溶液；向其中加入50 μL 70%的甲酸水溶液，用移液器反復(fù)吹打混合均勻，室溫放置5 min；再向其中加入等體積的乙腈，用移液器反復(fù)吹打混合均勻；將其13 000r/min離心2 min，取2 μL上清液，置于質(zhì)譜靶板上；室溫自然晾干后，再覆蓋1 μL的基質(zhì)液；再晾干后，置于VITEK MS上進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，使用大腸桿菌ATCC8739作為質(zhì)控。

2.2.4 全基因組測(cè)序

用接種環(huán)挑取一定量待測(cè)菌菌苔置于無(wú)菌生理鹽水中，12 000 r/min離心1min；去除上清液，收集待測(cè)菌菌體；使用商業(yè)化細(xì)菌DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取，提取步驟見(jiàn)其說(shuō)明書；將提取的DNA低溫寄送至生工生物工程（上海）股份有限公司，進(jìn)行全基因組測(cè)序。

全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)質(zhì)控后，使用SPAdes軟件進(jìn)行拼接；使用GAPFiller對(duì)拼接結(jié)果補(bǔ)GAP，得到最終的contig文件；將contig文件上傳至Center for Genomic Epidemiology網(wǎng) 站 （網(wǎng)址：http://www.genomicepidemiology.org）的KmerFinder 3.1中進(jìn)行比對(duì)，得到鑒定結(jié)果。

3 結(jié)果與分析

3.1 生化鑒定法結(jié)果

依據(jù)不同生化反應(yīng)的差異進(jìn)行微生物鑒定，是一種傳統(tǒng)方法。采用梅里埃VITEK 2 Compact生化鑒定系統(tǒng)，對(duì)9個(gè)盲樣分離純化的雙歧桿菌可疑菌進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果見(jiàn)表2。9個(gè)樣品VITEK生化鑒定的結(jié)果均為雙歧桿菌屬（Bifidobacterium spp），平均置信度為93.6%（89%～97%）。同時(shí)，4、9和12號(hào)樣品的雙歧桿菌可疑菌株經(jīng)過(guò)3次菌種純化鑒定，才得到“雙歧桿菌屬”的結(jié)果，其余樣品均為僅通過(guò)1次鑒定即得出雙歧桿菌的結(jié)果。結(jié)果表明，采用VITEK生化鑒定法可以鑒定到雙歧桿菌屬，但是無(wú)法鑒定至種水平。

表2 VITEK生化鑒定結(jié)果

3.2 MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定結(jié)果

利用MALDI-TOF質(zhì)譜轟擊菌體蛋白產(chǎn)生的“指紋圖譜”進(jìn)行微生物鑒定，具有方便、快速的優(yōu)點(diǎn)。采用梅里埃VITEK-MS（MALDI-TOF質(zhì)譜），對(duì)9個(gè)盲樣分離純化的雙歧桿菌可疑菌進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果見(jiàn)表3。9個(gè)樣品的質(zhì)譜鑒定結(jié)果評(píng)分均為99.9分（滿分100分），說(shuō)明其鑒定的準(zhǔn)確性非常高；12、15和18號(hào)樣品的質(zhì)譜鑒定結(jié)果為動(dòng)物雙歧桿菌（Bifidobacterium animalis），與制備這3個(gè)盲樣所用的雙歧桿菌菌種一致；其余6個(gè)樣品的鑒定結(jié)果為雙歧桿菌屬。結(jié)果表明，采用MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定法對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌進(jìn)行鑒定，可以準(zhǔn)確鑒定至種水平，但對(duì)其它5種雙歧桿菌只能鑒定至屬水平。若想采用MALDI-TOF質(zhì)譜法實(shí)現(xiàn)對(duì)這5種雙歧桿菌種水平的鑒定，可能還需要依賴其自建庫(kù)的功能，構(gòu)建這5種菌的特異性MALDI-TOF質(zhì)譜“指紋圖譜”。

表3 MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果

3.3 全基因組測(cè)序鑒定結(jié)果

隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，利用高通量測(cè)序儀對(duì)微生物的全部基因組進(jìn)行測(cè)序的方法已經(jīng)非常成熟。使用二代測(cè)序儀對(duì)9個(gè)盲樣分離純化的雙歧桿菌可疑菌進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)后，得到9株菌的鑒定結(jié)果，見(jiàn)表4。4號(hào)樣品的鑒定結(jié)果為兩歧雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidum）；9號(hào)樣品的鑒定結(jié)果為嬰兒雙歧桿菌（Bifidobacterium longum subsp.Infantis strain）；12、15和18號(hào)樣品的鑒定結(jié)果為動(dòng)物雙歧桿菌（Bifidobacterium animalis）；27、30和35號(hào)樣品的鑒定結(jié)果為短雙歧桿菌（Bifidobacterium breve）；42號(hào)樣品的鑒定結(jié)果為長(zhǎng)雙歧桿菌（Bifidobacterium longum）。鑒定結(jié)果與制備盲樣時(shí)所用的雙歧桿菌菌種一致。結(jié)果表明，采用全基因測(cè)序的方法可以使雙歧桿菌鑒定至屬水平。

表4 全基因組測(cè)序鑒定結(jié)果

3.4 3種鑒定方法的比較分析

從3種方法的鑒定結(jié)果來(lái)看，VITEK生化鑒定法無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)雙歧桿菌種水平的鑒定，MALDI-TOF質(zhì)譜法對(duì)個(gè)別菌株可以鑒定至種水平，全基因組測(cè)序法可以很好地實(shí)現(xiàn)種水平的鑒定；在實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性（重現(xiàn)性）方面，VITEK鑒定法一次實(shí)驗(yàn)的成功率低于MALDI-TOF質(zhì)譜法和全基因組測(cè)序法；在檢測(cè)時(shí)間方面（從對(duì)樣品進(jìn)行前處理至獲得鑒定結(jié)果），MALDI-TOF質(zhì)譜法所需的時(shí)間少于VITEK鑒定法和全基因組測(cè)序法；在實(shí)驗(yàn)成本方面，VITEK鑒定法和MALDI-TOF質(zhì)譜法基本持平，而全基因組測(cè)序的成本高于前2種方法，見(jiàn)表5。

表5 3種雙歧桿菌鑒定方法的比較

4 結(jié)論

本文通過(guò)對(duì)3種方法進(jìn)行雙歧桿菌鑒定的結(jié)果進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)，VITEK生化鑒定法無(wú)法鑒定至種水平，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定性較差；MALDI-TOF質(zhì)譜法鑒定雙歧桿菌所需的時(shí)間最短，但僅能對(duì)部分菌種鑒定至種水平；全基因組測(cè)序法可以實(shí)現(xiàn)雙歧桿菌種水平的鑒定，但其實(shí)驗(yàn)成本高于前2種方法。

綜上所述，MALDI-TOF質(zhì)譜法和全基因組測(cè)序法是雙歧桿菌屬水平和種水平鑒定必要的補(bǔ)充方法，建議將其增加為雙歧桿菌鑒定的標(biāo)準(zhǔn)方法。本文的研究成果能夠?yàn)殡p歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法的改進(jìn)和添加雙歧桿菌食品的日常監(jiān)管，提供一定的技術(shù)參考。