丁清龍 蘇妙貞 周露

（廣東省食品檢驗所 廣東廣州 510435）

1 前言

雙歧桿菌是細(xì)菌分類學(xué)層面上屬的名稱，是一類厭氧的、革蘭氏陽性菌，被認(rèn)為是人體健康的重要標(biāo)志之一，可以在人體腸道內(nèi)定殖，阻止人體內(nèi)有害致病微生物的繁殖，調(diào)節(jié)人體腸道菌群的微生態(tài)平衡[1]，還具有防癌、降低膽固醇、抗衰老等多種對機體健康有益的作用[2-3]。根據(jù)2002年FAO/WHO對益生菌的定義，雙歧桿菌屬于益生菌的范疇。相關(guān)研究表明，攝入一定量的雙歧桿菌對維持和改善機體健康具有重要作用[4]。因此，雙歧桿菌常作為一種營養(yǎng)因子被添加至酸奶、保健食品、嬰幼兒配方食品、特殊醫(yī)學(xué)用途食品中。

在食品中加入的雙歧桿菌主要有6種：長雙歧桿菌（Bifidobacterium longum）、短雙歧桿菌（Bifidobacterium breve）、兩歧雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidum）、青春雙歧桿菌（Bifidobacterium adolescentis）、動物雙歧桿菌（Bifidobacterium animalis）和嬰兒雙歧桿菌（Bifidobacterium longum subsp.infantis）。不同種類的雙歧桿菌，具有不同的生理作用。以嬰幼兒食品為例，我國衛(wèi)生部發(fā)布的《關(guān)于公布可用于嬰幼兒食品的菌種名單的公告》中，規(guī)定了允許添加的雙歧桿菌的菌種類別[5]。對于標(biāo)識含雙歧桿菌的食品，其添加的雙歧桿菌種類不僅要符合食品經(jīng)濟價值和營養(yǎng)價值的要求，也必須符合監(jiān)管部門的規(guī)定。因此，食品中雙歧桿菌種類的鑒定具有重要意義。

目前，用于細(xì)菌鑒定的方法均可用于鑒定雙歧桿菌，主要包括生化鑒定法、質(zhì)譜鑒定法和分子生物學(xué)法。生化鑒定法較為傳統(tǒng)，現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.34-2016中的雙歧桿菌檢驗即采用該方法[6-7]。質(zhì)譜鑒定法主要是基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜法（MALDI-TOF MS），利用該技術(shù)，能夠使菌體蛋白電離構(gòu)建的“指紋圖譜”實現(xiàn)多種益生菌的鑒定[8]。分子生物學(xué)方法包括DNA印記技術(shù)、脈沖場電泳技術(shù)、基于PCR擴增的16SrDNA和16S-23SrDNA間序列分析和全基因組測序[9-10]。

本文應(yīng)用生化鑒定法、MALDI-TOF質(zhì)譜法和全基因測序法這3種方法對目前食品中可能添加的多種雙歧桿菌進行鑒定，并對這3種方法的鑒定結(jié)果進行綜合比較與分析，以期為雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法的改進和添加雙歧桿菌食品的日常監(jiān)管提供技術(shù)參考。

2 材料與方法

2.1 主要儀器與試劑

生化培養(yǎng)箱（LRH-250，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；生物安全柜（AC2-4S1，新加坡Esco）；全自動細(xì)菌鑒定儀（VITEK 2 Compact，法國生物梅里埃股份有限公司）；MALDI-TOF質(zhì)譜儀（VITEK MS，法國梅里埃股份有限公司）；離心機（5430，德國Eppendorf）。

全基因組測序委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行，二代測序儀為Illumina公司生產(chǎn)的novaseq。

MRS培養(yǎng)基（北京路橋技術(shù)股份有限公司）；厭氧菌及棒狀桿菌鑒定卡片（生物梅里埃美國股份有限公司）；質(zhì)譜樣品處理基質(zhì)溶液（生物梅里埃法國股份有限公司）；全自動微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)-VITEK MS-DS靶板（生物梅里埃法國股份有限公司）；細(xì)菌基因組提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）。

實驗中所使用的雙歧桿菌盲樣，均由中國食品藥品檢定研究院提供，樣品信息見表1。

表1 雙歧桿菌盲樣

2.2 實驗方法

2.2.1 菌種分離

將含有盲樣的西林瓶在室溫條件下平衡5 min；向其中加入1 mL無菌生理鹽水，使盲樣溶解并混合均勻；使用無菌生理鹽水將溶解的樣品稀釋1 000倍；吸取100 μL稀釋后的樣品液于MRS平板涂布，厭氧條件下36℃培養(yǎng)48 h；待生菌后，挑取單菌落劃線于MRS平板；厭氧條件下36℃培養(yǎng)48 h，得到雙歧桿菌可疑菌。

2.2.2 VITEK生化鑒定

用無菌接種環(huán)挑取部分雙歧桿菌可疑菌菌苔，置于0.45%無菌生理鹽水中，制備菌懸液；使菌懸液的麥?zhǔn)蠞岫瓤刂圃?.7～3.3之間；取出厭氧菌及棒狀桿菌鑒定卡片插入菌懸液中，在VITEK 2 Compact上進行檢測。

2.2.3 MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定

用接種環(huán)挑取1環(huán)待測樣品，置于裝有300 μL超純水的Eppendorf管中，渦旋混合1 min；向其中加入900 μL無水乙醇，渦旋混合1 min；將Eppendorf管13000r/min離心2min，去除上清液，重復(fù)離心1次；用移液器去除殘留的乙醇溶液；向其中加入50 μL 70%的甲酸水溶液，用移液器反復(fù)吹打混合均勻，室溫放置5 min；再向其中加入等體積的乙腈，用移液器反復(fù)吹打混合均勻；將其13 000r/min離心2 min，取2 μL上清液，置于質(zhì)譜靶板上；室溫自然晾干后，再覆蓋1 μL的基質(zhì)液；再晾干后，置于VITEK MS上進行檢測。實驗過程中，使用大腸桿菌ATCC8739作為質(zhì)控。

2.2.4 全基因組測序

用接種環(huán)挑取一定量待測菌菌苔置于無菌生理鹽水中，12 000 r/min離心1min；去除上清液，收集待測菌菌體；使用商業(yè)化細(xì)菌DNA提取試劑盒進行DNA提取，提取步驟見其說明書；將提取的DNA低溫寄送至生工生物工程（上海）股份有限公司，進行全基因組測序。

全基因組測序數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)控后，使用SPAdes軟件進行拼接；使用GAPFiller對拼接結(jié)果補GAP，得到最終的contig文件；將contig文件上傳至Center for Genomic Epidemiology網(wǎng) 站 （網(wǎng)址：http://www.genomicepidemiology.org）的KmerFinder 3.1中進行比對，得到鑒定結(jié)果。

3 結(jié)果與分析

3.1 生化鑒定法結(jié)果

依據(jù)不同生化反應(yīng)的差異進行微生物鑒定，是一種傳統(tǒng)方法。采用梅里埃VITEK 2 Compact生化鑒定系統(tǒng)，對9個盲樣分離純化的雙歧桿菌可疑菌進行鑒定，鑒定結(jié)果見表2。9個樣品VITEK生化鑒定的結(jié)果均為雙歧桿菌屬（Bifidobacterium spp），平均置信度為93.6%（89%～97%）。同時，4、9和12號樣品的雙歧桿菌可疑菌株經(jīng)過3次菌種純化鑒定，才得到“雙歧桿菌屬”的結(jié)果，其余樣品均為僅通過1次鑒定即得出雙歧桿菌的結(jié)果。結(jié)果表明，采用VITEK生化鑒定法可以鑒定到雙歧桿菌屬，但是無法鑒定至種水平。

表2 VITEK生化鑒定結(jié)果

3.2 MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定結(jié)果

利用MALDI-TOF質(zhì)譜轟擊菌體蛋白產(chǎn)生的“指紋圖譜”進行微生物鑒定，具有方便、快速的優(yōu)點。采用梅里埃VITEK-MS（MALDI-TOF質(zhì)譜），對9個盲樣分離純化的雙歧桿菌可疑菌進行鑒定，鑒定結(jié)果見表3。9個樣品的質(zhì)譜鑒定結(jié)果評分均為99.9分（滿分100分），說明其鑒定的準(zhǔn)確性非常高；12、15和18號樣品的質(zhì)譜鑒定結(jié)果為動物雙歧桿菌（Bifidobacterium animalis），與制備這3個盲樣所用的雙歧桿菌菌種一致；其余6個樣品的鑒定結(jié)果為雙歧桿菌屬。結(jié)果表明，采用MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定法對動物雙歧桿菌進行鑒定，可以準(zhǔn)確鑒定至種水平，但對其它5種雙歧桿菌只能鑒定至屬水平。若想采用MALDI-TOF質(zhì)譜法實現(xiàn)對這5種雙歧桿菌種水平的鑒定，可能還需要依賴其自建庫的功能，構(gòu)建這5種菌的特異性MALDI-TOF質(zhì)譜“指紋圖譜”。

表3 MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果

3.3 全基因組測序鑒定結(jié)果

隨著技術(shù)的不斷進步，利用高通量測序儀對微生物的全部基因組進行測序的方法已經(jīng)非常成熟。使用二代測序儀對9個盲樣分離純化的雙歧桿菌可疑菌進行測序，將測序結(jié)果進行比對后，得到9株菌的鑒定結(jié)果，見表4。4號樣品的鑒定結(jié)果為兩歧雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidum）；9號樣品的鑒定結(jié)果為嬰兒雙歧桿菌（Bifidobacterium longum subsp.Infantis strain）；12、15和18號樣品的鑒定結(jié)果為動物雙歧桿菌（Bifidobacterium animalis）；27、30和35號樣品的鑒定結(jié)果為短雙歧桿菌（Bifidobacterium breve）；42號樣品的鑒定結(jié)果為長雙歧桿菌（Bifidobacterium longum）。鑒定結(jié)果與制備盲樣時所用的雙歧桿菌菌種一致。結(jié)果表明，采用全基因測序的方法可以使雙歧桿菌鑒定至屬水平。

表4 全基因組測序鑒定結(jié)果

3.4 3種鑒定方法的比較分析

從3種方法的鑒定結(jié)果來看，VITEK生化鑒定法無法實現(xiàn)對雙歧桿菌種水平的鑒定，MALDI-TOF質(zhì)譜法對個別菌株可以鑒定至種水平，全基因組測序法可以很好地實現(xiàn)種水平的鑒定；在實驗的穩(wěn)定性（重現(xiàn)性）方面，VITEK鑒定法一次實驗的成功率低于MALDI-TOF質(zhì)譜法和全基因組測序法；在檢測時間方面（從對樣品進行前處理至獲得鑒定結(jié)果），MALDI-TOF質(zhì)譜法所需的時間少于VITEK鑒定法和全基因組測序法；在實驗成本方面，VITEK鑒定法和MALDI-TOF質(zhì)譜法基本持平，而全基因組測序的成本高于前2種方法，見表5。

表5 3種雙歧桿菌鑒定方法的比較

4 結(jié)論

本文通過對3種方法進行雙歧桿菌鑒定的結(jié)果進行比較分析發(fā)現(xiàn)，VITEK生化鑒定法無法鑒定至種水平，且實驗結(jié)果穩(wěn)定性較差；MALDI-TOF質(zhì)譜法鑒定雙歧桿菌所需的時間最短，但僅能對部分菌種鑒定至種水平；全基因組測序法可以實現(xiàn)雙歧桿菌種水平的鑒定，但其實驗成本高于前2種方法。

綜上所述，MALDI-TOF質(zhì)譜法和全基因組測序法是雙歧桿菌屬水平和種水平鑒定必要的補充方法，建議將其增加為雙歧桿菌鑒定的標(biāo)準(zhǔn)方法。本文的研究成果能夠為雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法的改進和添加雙歧桿菌食品的日常監(jiān)管，提供一定的技術(shù)參考。