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        3種食品中雙歧桿菌鑒定方法的比較分析

        2022-11-13 03:05:22丁清龍蘇妙貞周露
        關(guān)鍵詞:盲樣質(zhì)譜法雙歧

        丁清龍 蘇妙貞 周露

        (廣東省食品檢驗(yàn)所 廣東廣州 510435)

        1 前言

        雙歧桿菌是細(xì)菌分類學(xué)層面上屬的名稱,是一類厭氧的、革蘭氏陽(yáng)性菌,被認(rèn)為是人體健康的重要標(biāo)志之一,可以在人體腸道內(nèi)定殖,阻止人體內(nèi)有害致病微生物的繁殖,調(diào)節(jié)人體腸道菌群的微生態(tài)平衡[1],還具有防癌、降低膽固醇、抗衰老等多種對(duì)機(jī)體健康有益的作用[2-3]。根據(jù)2002年FAO/WHO對(duì)益生菌的定義,雙歧桿菌屬于益生菌的范疇。相關(guān)研究表明,攝入一定量的雙歧桿菌對(duì)維持和改善機(jī)體健康具有重要作用[4]。因此,雙歧桿菌常作為一種營(yíng)養(yǎng)因子被添加至酸奶、保健食品、嬰幼兒配方食品、特殊醫(yī)學(xué)用途食品中。

        在食品中加入的雙歧桿菌主要有6種:長(zhǎng)雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)、短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)、兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)、青春雙歧桿菌(Bifidobacterium adolescentis)、動(dòng)物雙歧桿菌(Bifidobacterium animalis)和嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacterium longum subsp.infantis)。不同種類的雙歧桿菌,具有不同的生理作用。以嬰幼兒食品為例,我國(guó)衛(wèi)生部發(fā)布的《關(guān)于公布可用于嬰幼兒食品的菌種名單的公告》中,規(guī)定了允許添加的雙歧桿菌的菌種類別[5]。對(duì)于標(biāo)識(shí)含雙歧桿菌的食品,其添加的雙歧桿菌種類不僅要符合食品經(jīng)濟(jì)價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的要求,也必須符合監(jiān)管部門的規(guī)定。因此,食品中雙歧桿菌種類的鑒定具有重要意義。

        目前,用于細(xì)菌鑒定的方法均可用于鑒定雙歧桿菌,主要包括生化鑒定法、質(zhì)譜鑒定法和分子生物學(xué)法。生化鑒定法較為傳統(tǒng),現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.34-2016中的雙歧桿菌檢驗(yàn)即采用該方法[6-7]。質(zhì)譜鑒定法主要是基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法(MALDI-TOF MS),利用該技術(shù),能夠使菌體蛋白電離構(gòu)建的“指紋圖譜”實(shí)現(xiàn)多種益生菌的鑒定[8]。分子生物學(xué)方法包括DNA印記技術(shù)、脈沖場(chǎng)電泳技術(shù)、基于PCR擴(kuò)增的16SrDNA和16S-23SrDNA間序列分析和全基因組測(cè)序[9-10]。

        本文應(yīng)用生化鑒定法、MALDI-TOF質(zhì)譜法和全基因測(cè)序法這3種方法對(duì)目前食品中可能添加的多種雙歧桿菌進(jìn)行鑒定,并對(duì)這3種方法的鑒定結(jié)果進(jìn)行綜合比較與分析,以期為雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法的改進(jìn)和添加雙歧桿菌食品的日常監(jiān)管提供技術(shù)參考。

        2 材料與方法

        2.1 主要儀器與試劑

        生化培養(yǎng)箱(LRH-250,上海一恒科學(xué)儀器有限公司);生物安全柜(AC2-4S1,新加坡Esco);全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀(VITEK 2 Compact,法國(guó)生物梅里埃股份有限公司);MALDI-TOF質(zhì)譜儀(VITEK MS,法國(guó)梅里埃股份有限公司);離心機(jī)(5430,德國(guó)Eppendorf)。

        全基因組測(cè)序委托生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行,二代測(cè)序儀為Illumina公司生產(chǎn)的novaseq。

        MRS培養(yǎng)基(北京路橋技術(shù)股份有限公司);厭氧菌及棒狀桿菌鑒定卡片(生物梅里埃美國(guó)股份有限公司);質(zhì)譜樣品處理基質(zhì)溶液(生物梅里埃法國(guó)股份有限公司);全自動(dòng)微生物質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)-VITEK MS-DS靶板(生物梅里埃法國(guó)股份有限公司);細(xì)菌基因組提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)。

        實(shí)驗(yàn)中所使用的雙歧桿菌盲樣,均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供,樣品信息見(jiàn)表1。

        表1 雙歧桿菌盲樣

        2.2 實(shí)驗(yàn)方法

        2.2.1 菌種分離

        將含有盲樣的西林瓶在室溫條件下平衡5 min;向其中加入1 mL無(wú)菌生理鹽水,使盲樣溶解并混合均勻;使用無(wú)菌生理鹽水將溶解的樣品稀釋1 000倍;吸取100 μL稀釋后的樣品液于MRS平板涂布,厭氧條件下36℃培養(yǎng)48 h;待生菌后,挑取單菌落劃線于MRS平板;厭氧條件下36℃培養(yǎng)48 h,得到雙歧桿菌可疑菌。

        2.2.2 VITEK生化鑒定

        用無(wú)菌接種環(huán)挑取部分雙歧桿菌可疑菌菌苔,置于0.45%無(wú)菌生理鹽水中,制備菌懸液;使菌懸液的麥?zhǔn)蠞岫瓤刂圃?.7~3.3之間;取出厭氧菌及棒狀桿菌鑒定卡片插入菌懸液中,在VITEK 2 Compact上進(jìn)行檢測(cè)。

        2.2.3 MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定

        用接種環(huán)挑取1環(huán)待測(cè)樣品,置于裝有300 μL超純水的Eppendorf管中,渦旋混合1 min;向其中加入900 μL無(wú)水乙醇,渦旋混合1 min;將Eppendorf管13000r/min離心2min,去除上清液,重復(fù)離心1次;用移液器去除殘留的乙醇溶液;向其中加入50 μL 70%的甲酸水溶液,用移液器反復(fù)吹打混合均勻,室溫放置5 min;再向其中加入等體積的乙腈,用移液器反復(fù)吹打混合均勻;將其13 000r/min離心2 min,取2 μL上清液,置于質(zhì)譜靶板上;室溫自然晾干后,再覆蓋1 μL的基質(zhì)液;再晾干后,置于VITEK MS上進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,使用大腸桿菌ATCC8739作為質(zhì)控。

        2.2.4 全基因組測(cè)序

        用接種環(huán)挑取一定量待測(cè)菌菌苔置于無(wú)菌生理鹽水中,12 000 r/min離心1min;去除上清液,收集待測(cè)菌菌體;使用商業(yè)化細(xì)菌DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取,提取步驟見(jiàn)其說(shuō)明書;將提取的DNA低溫寄送至生工生物工程(上海)股份有限公司,進(jìn)行全基因組測(cè)序。

        全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)質(zhì)控后,使用SPAdes軟件進(jìn)行拼接;使用GAPFiller對(duì)拼接結(jié)果補(bǔ)GAP,得到最終的contig文件;將contig文件上傳至Center for Genomic Epidemiology網(wǎng) 站 (網(wǎng)址:http://www.genomicepidemiology.org)的KmerFinder 3.1中進(jìn)行比對(duì),得到鑒定結(jié)果。

        3 結(jié)果與分析

        3.1 生化鑒定法結(jié)果

        依據(jù)不同生化反應(yīng)的差異進(jìn)行微生物鑒定,是一種傳統(tǒng)方法。采用梅里埃VITEK 2 Compact生化鑒定系統(tǒng),對(duì)9個(gè)盲樣分離純化的雙歧桿菌可疑菌進(jìn)行鑒定,鑒定結(jié)果見(jiàn)表2。9個(gè)樣品VITEK生化鑒定的結(jié)果均為雙歧桿菌屬(Bifidobacterium spp),平均置信度為93.6%(89%~97%)。同時(shí),4、9和12號(hào)樣品的雙歧桿菌可疑菌株經(jīng)過(guò)3次菌種純化鑒定,才得到“雙歧桿菌屬”的結(jié)果,其余樣品均為僅通過(guò)1次鑒定即得出雙歧桿菌的結(jié)果。結(jié)果表明,采用VITEK生化鑒定法可以鑒定到雙歧桿菌屬,但是無(wú)法鑒定至種水平。

        表2 VITEK生化鑒定結(jié)果

        3.2 MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定結(jié)果

        利用MALDI-TOF質(zhì)譜轟擊菌體蛋白產(chǎn)生的“指紋圖譜”進(jìn)行微生物鑒定,具有方便、快速的優(yōu)點(diǎn)。采用梅里埃VITEK-MS(MALDI-TOF質(zhì)譜),對(duì)9個(gè)盲樣分離純化的雙歧桿菌可疑菌進(jìn)行鑒定,鑒定結(jié)果見(jiàn)表3。9個(gè)樣品的質(zhì)譜鑒定結(jié)果評(píng)分均為99.9分(滿分100分),說(shuō)明其鑒定的準(zhǔn)確性非常高;12、15和18號(hào)樣品的質(zhì)譜鑒定結(jié)果為動(dòng)物雙歧桿菌(Bifidobacterium animalis),與制備這3個(gè)盲樣所用的雙歧桿菌菌種一致;其余6個(gè)樣品的鑒定結(jié)果為雙歧桿菌屬。結(jié)果表明,采用MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定法對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌進(jìn)行鑒定,可以準(zhǔn)確鑒定至種水平,但對(duì)其它5種雙歧桿菌只能鑒定至屬水平。若想采用MALDI-TOF質(zhì)譜法實(shí)現(xiàn)對(duì)這5種雙歧桿菌種水平的鑒定,可能還需要依賴其自建庫(kù)的功能,構(gòu)建這5種菌的特異性MALDI-TOF質(zhì)譜“指紋圖譜”。

        表3 MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果

        3.3 全基因組測(cè)序鑒定結(jié)果

        隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步,利用高通量測(cè)序儀對(duì)微生物的全部基因組進(jìn)行測(cè)序的方法已經(jīng)非常成熟。使用二代測(cè)序儀對(duì)9個(gè)盲樣分離純化的雙歧桿菌可疑菌進(jìn)行測(cè)序,將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)后,得到9株菌的鑒定結(jié)果,見(jiàn)表4。4號(hào)樣品的鑒定結(jié)果為兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum);9號(hào)樣品的鑒定結(jié)果為嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacterium longum subsp.Infantis strain);12、15和18號(hào)樣品的鑒定結(jié)果為動(dòng)物雙歧桿菌(Bifidobacterium animalis);27、30和35號(hào)樣品的鑒定結(jié)果為短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve);42號(hào)樣品的鑒定結(jié)果為長(zhǎng)雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)。鑒定結(jié)果與制備盲樣時(shí)所用的雙歧桿菌菌種一致。結(jié)果表明,采用全基因測(cè)序的方法可以使雙歧桿菌鑒定至屬水平。

        表4 全基因組測(cè)序鑒定結(jié)果

        3.4 3種鑒定方法的比較分析

        從3種方法的鑒定結(jié)果來(lái)看,VITEK生化鑒定法無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)雙歧桿菌種水平的鑒定,MALDI-TOF質(zhì)譜法對(duì)個(gè)別菌株可以鑒定至種水平,全基因組測(cè)序法可以很好地實(shí)現(xiàn)種水平的鑒定;在實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性(重現(xiàn)性)方面,VITEK鑒定法一次實(shí)驗(yàn)的成功率低于MALDI-TOF質(zhì)譜法和全基因組測(cè)序法;在檢測(cè)時(shí)間方面(從對(duì)樣品進(jìn)行前處理至獲得鑒定結(jié)果),MALDI-TOF質(zhì)譜法所需的時(shí)間少于VITEK鑒定法和全基因組測(cè)序法;在實(shí)驗(yàn)成本方面,VITEK鑒定法和MALDI-TOF質(zhì)譜法基本持平,而全基因組測(cè)序的成本高于前2種方法,見(jiàn)表5。

        表5 3種雙歧桿菌鑒定方法的比較

        4 結(jié)論

        本文通過(guò)對(duì)3種方法進(jìn)行雙歧桿菌鑒定的結(jié)果進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn),VITEK生化鑒定法無(wú)法鑒定至種水平,且實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定性較差;MALDI-TOF質(zhì)譜法鑒定雙歧桿菌所需的時(shí)間最短,但僅能對(duì)部分菌種鑒定至種水平;全基因組測(cè)序法可以實(shí)現(xiàn)雙歧桿菌種水平的鑒定,但其實(shí)驗(yàn)成本高于前2種方法。

        綜上所述,MALDI-TOF質(zhì)譜法和全基因組測(cè)序法是雙歧桿菌屬水平和種水平鑒定必要的補(bǔ)充方法,建議將其增加為雙歧桿菌鑒定的標(biāo)準(zhǔn)方法。本文的研究成果能夠?yàn)殡p歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法的改進(jìn)和添加雙歧桿菌食品的日常監(jiān)管,提供一定的技術(shù)參考。

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