劉靜，朱葉梅，董勝強，楊盼盼，廖予琦，楊飚，張建，李瑞

(云南同創(chuàng)檢測技術(shù)股份有限公司，昆明 650106)

中藥材是中國傳統(tǒng)醫(yī)藥產(chǎn)品，部分中藥材既可以作為藥物，也可以作為食物、保健品，能夠加工成具有食療功能的膳食。大部分中藥材以干燥塊莖流通，具有藥用、保健價值，有些為中國名貴中藥材[1]。中藥材的炮制過程主要為直接干燥、微波真空干燥、微波后水蒸、真空冷凍或干燥等[2]。若中藥材中水分含量過高，在儲藏過程中，中藥材會滋生霉菌、真菌等。由真菌、細菌、病毒等引起的中藥材中微生物群落變化，會給中藥材帶來病害[3]；同時，中藥材內(nèi)也會產(chǎn)生真菌的次生代謝物真菌毒素[4-5]。真菌毒素主要存在于植物產(chǎn)品及植物性中藥材中[6-7]，另外，真菌毒素還可通過動物攝入，從而污染動物源性中藥材[6-9]。真菌毒素不僅會破壞中藥材的品質(zhì)，降低中藥材的功效，甚至會危害人體的健康。目前已確定的真菌毒素約300 多種[10]，依據(jù)毒性程度劃分，毒性較大的有黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏馬菌素、嘔吐毒素、T-2 等[11-14]。

儀器分析法靈敏度高，可對毒素進行精確定量，是目前真菌毒素檢測的主要手段[15]，其中常用的檢測方法有高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等[16-18]。目前測定中藥材中真菌毒素的相關(guān)研究主要集中在黃曲霉毒素(B 族、M 族、G 族)、赭曲霉毒素，而T-2 毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和伏馬毒素的測定未見報道。筆者采用不同極性的2 種提取溶劑對4 種類別的11種真菌毒素進行提取，用三重四級桿質(zhì)譜儀正離子和多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式測定，建立了中藥材中11 種真菌毒素的檢測方法，以期為評價中藥材的安全性提供技術(shù)參考。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜-串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜儀：Agilent 1290-6460 型，美國安捷倫科技有限公司。

分析天平：AB204-S 型，感量為0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多集團。

液氮：純度不小于99.9% (體積分數(shù))，昆明倉輝經(jīng)貿(mào)有限公司。

中藥材樣品：天麻、三七、石斛、紅花、茯苓，市售新鮮樣品。

11 種真菌毒素標準樣品：伏馬毒素B1、伏馬毒素B2、T-2 毒素、赭曲霉毒素A、黃曲霉毒素G2、黃曲霉毒素M2、黃曲霉毒素M1、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素B1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，純度均不小于95% (質(zhì)量分數(shù))，壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司。

13C34伏馬毒素B1、13C17黃曲霉毒素B1 同位素標記物標準樣品：質(zhì)量濃度均為25 μg/mL，壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司。

甲醇、甲酸：色譜純，北京迪科馬科技有限公司。氨水：分析純，西隴化工股份有限公司。

多功能固相凈化柱：M1000 型，青島普瑞邦生物工程有限公司。

PriboFast?固相凈化柱：MFC100 型，青島普瑞邦生物工程有限公司。

PriboFast?真菌毒素六合一免疫親和柱：IAC-400-6 型，柱容量為6 mL，青島普瑞邦生物工程有限公司。

實驗用水為去離子水。

1.2 溶液配制

提取溶劑A：乙腈和水按80∶20 的體積比混合均勻，加入質(zhì)量分數(shù)為0.1%的甲酸。

提取溶劑B：乙腈和水按20∶80 的體積比混合均勻，加入質(zhì)量分數(shù)為0.1%的甲酸。

11 種霉菌毒素混合標準儲備液：11 種霉菌毒素的質(zhì)量濃度均為1.0 μg/mL，分別稱取伏馬毒素B1、伏馬毒素B2、T-2 毒素、赭曲霉毒素A、黃曲霉毒素G2、黃曲霉毒素M2、黃曲霉毒素M1、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素B1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇各1.0 mg 于10 mL 容量瓶中，均用甲醇溶解并定容至標線，配制成11 種單標儲備液。分別移取上述11 種單標儲備液各0.5 mL 于同一只50 mL 容量瓶中，用甲醇定容至標線，混勻。

混合內(nèi)標溶液：13C34伏馬毒素B1、13C17黃曲霉毒素B1 質(zhì)量濃度均為1.0 μg/mL，分別移取13C34伏馬毒素B1 和13C17黃曲霉毒素B1 標準樣品各1.0 mL 于同一只25 mL 容量瓶中，用甲醇定容至標線，混勻。

11 種霉菌毒素系列混合標準工作溶液：分別取適量的11 種真菌毒素混合標準儲備液于10 mL容量瓶中，加入1.0 mL 混合內(nèi)標溶液，用質(zhì)量分數(shù)為0.1%的甲酸溶液定容至標線，配置成11 種真菌毒素的質(zhì)量濃度均分別為0.1、1.0、5.0、20、50、100 ng/mL 的系列混合標準工作液；分別移取上述系列混合標準工作溶液各1.0 mL，加入已吹至近干的空白樣品基質(zhì)中，用0.22 μm 濾膜過濾，得到相同質(zhì)量濃度的基質(zhì)匹配系列混合校正工作溶液。

1.3 儀器工作條件

1.3.1 液相色譜

色譜柱：Waters Acquity BEH C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國沃特世公司)；柱溫：(25±5)℃；流動相：A 為質(zhì)量分數(shù)為0.1%的甲酸溶液，B為含有質(zhì)量分數(shù)為0.1%甲酸的甲醇溶液，流量為0.3 mL/min；進樣體積：5 μL；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.3.2 質(zhì)譜

離子源：正離子電噴霧電離源(ESI+)；檢測方式：多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式；干燥氣：氮氣，流量為6 L/min，溫度為325 ℃；鞘氣：氮氣，流量為10 L/min，溫度為350 ℃；毛細管電壓：3 500 V；11 種真菌毒素質(zhì)譜采集參數(shù)見表2。

表2 11 種真菌毒素和2 種內(nèi)標的質(zhì)譜采集參數(shù)

1.4 實驗步驟

1.4.1 樣品處理

將采購的新鮮中藥材樣品，在自然條件下陰干，使最終水分控制在5%～10% (質(zhì)量分數(shù))之間。然后磨碎過0.425 mm 篩。稱取2 g 磨碎后的樣品，置于50 mL 離心管中，加入15 mL 提取溶劑A，渦旋1 min，振蕩提取60 min,以5 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一只50 mL 離心管中，向剩余樣品中再次加入15 mL 提取溶劑B，渦旋1 min，繼續(xù)振蕩提取30 min，然后以5 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，合并第一次提取液。再次以5 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清液，于40 ℃氮吹濃縮至10 mL，取980 μL 最終提取液于樣品瓶中，加入20 μL 混合內(nèi)標溶液，充分混勻，經(jīng)0.22 μm 過濾膜后得到樣品溶液。

1.4.2 定量方法

在1.3 儀器工作條件下，先測定1.2 中不同濃度的11 種真菌毒素基質(zhì)匹配系列混合校正溶液，然后測定1.4.1 處理后的樣品溶液，樣品溶液中檢出的色譜峰保留時間需與標準溶液中某組分色譜峰保留時間一致，且所選擇的兩對子離子的質(zhì)荷比一致。以待測真菌毒素質(zhì)量濃度與內(nèi)標物質(zhì)量濃度的比值為橫坐標、待測真菌毒素色譜峰面積與內(nèi)標物色譜峰面積的比值為縱坐標繪制校正曲線，采用內(nèi)標法定量，得到待測真菌毒素的質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

參考文獻[11]，采用常用的C18色譜柱分離，并對流動相進行優(yōu)化。分離真菌毒素最常用的流動相為甲醇、乙腈水溶液(加入一定量的甲酸、乙酸銨)。分別考察了甲醇-甲酸水溶液、甲醇-乙酸銨水溶液、乙腈-甲酸水溶液和乙腈-乙酸銨水溶液4 種流動相體系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以甲醇作為有機相可使真菌毒素得到較好的分離，加入甲酸可提高分離度，通過提高離子化效率而提高11 種真菌毒素的靈敏度。綜合考慮，選擇0.1%的甲酸溶液和0.1%甲酸-甲醇溶液為流動相體系。質(zhì)量濃度為10.0 ng/mL 的11 種真菌毒素基質(zhì)匹配混合校正溶液的多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)色譜圖如圖1 所示。

圖1 11 種真菌毒素基質(zhì)匹配混合校正溶液MRM 色譜圖

2.2 提取方式選擇

要實現(xiàn)同時檢測不同理化性質(zhì)的真菌毒素，需要合適的提取溶劑。常用的提取溶劑一般為不同體積比的甲醇、乙腈等有機相與水的混合溶液。Sulyok等[19]曾對體積比為20∶80至90∶10的乙腈-水體系進行考察，結(jié)果表明，當以乙腈體積分數(shù)占比較高的乙腈-水體系為提取溶劑時，對多種真菌毒素的提取效果均較好，最常用的提取溶劑為乙腈-水(體積比為80∶20)[20]。待測的11 種真菌毒素極性差異較大，若使用同一種提取溶劑提取，會存在提取不完全的情況。選擇乙腈-水體系作為提取溶劑，按1.2 方法分別配制提取溶劑A、提取溶劑B。分別考察提取溶劑A、提取溶劑B 及兩種提取溶劑混合提取3 種提取方式對11 種真菌毒素的提取效果，不同提取溶劑對應(yīng)的真菌毒素的回收率見表3。

表3 不同提取方式對應(yīng)的真菌毒素回收率 %

由表3 可知，提取溶劑A 對大部分真菌毒素提取效果較好，但對極性較大的伏馬毒素類提取效果較差；提取溶劑B 對大部分真菌毒素提取效果較差，但對極性較大的伏馬毒素類提取效果較好；采用混合提取，即先用提取溶劑A 對大部分真菌毒素進行提取，然后用提取溶劑B 對極性較大的伏馬毒素類進行提取，11 種真菌毒素的提取效果均較好，回收率均達到80%以上，故選擇提取溶劑A 和提取溶劑B 混合提取方式。

2.3 基質(zhì)干擾與消除

由于植物提取液基質(zhì)復(fù)雜，分別采用純?nèi)軇藴是€法和基質(zhì)匹配校正曲線法考察樣品基質(zhì)對測定結(jié)果的影響。分別配制乙腈-水(體積比為80∶20)純?nèi)軇┫盗袠藴使ぷ魅芤汉?1 種真菌毒素基質(zhì)匹配系列混合校正溶液，在1.3 儀器工作條件下分別測定，繪制純?nèi)軇藴是€和基質(zhì)匹配校正曲線，以兩種曲線斜率的相對偏差反映基質(zhì)效應(yīng)大小，結(jié)果見表4。由表4 可知，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測，兩種曲線斜率的相對偏差絕對值為9.9%～46.5%，表明采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測中藥材中11 種真菌毒素基質(zhì)效應(yīng)較大。

表4 11 種真菌毒素標準曲線和校正曲線的斜率

為了有效消除基質(zhì)效應(yīng)，選取3 種凈化方法進行對比試驗：(1)基于QuEChERS 原則的凈化法；(2)免疫親和-凈化柱法；(3)兩步溶劑萃取法。3 種凈化方法對應(yīng)的11 種真菌毒素的回收率見表5。由表5 可知，采用前兩種凈化方法11 種真菌毒素的回收率整體偏低，采用兩步溶劑萃取直接過濾進樣并結(jié)合內(nèi)標法測定，11 種真菌毒素的提取效果均較好，可以實現(xiàn)同時準確測定，故選擇以提取溶劑A和提取溶劑B 為溶劑的兩步溶劑萃取凈化方法消除基質(zhì)效應(yīng)。

表5 不同凈化法對應(yīng)的11 種真菌毒素回收率%

2.4 線性方程、檢出限和定量限

在1.3 儀器工作條件下，對11 種真菌毒素基質(zhì)匹配系列混合校正溶液進行測定，以待測真菌毒素的質(zhì)量濃度與內(nèi)標物質(zhì)量濃度的比值x為橫坐標、對應(yīng)的待測真菌毒素的色譜峰面積與內(nèi)標物色譜峰面積的比值y為縱坐標擬合校正曲線，計算線性方程和相關(guān)系數(shù)。取11 種真菌毒素基質(zhì)匹配混合校正溶液，用質(zhì)量分數(shù)為0.1%的甲酸溶液不斷稀釋后測定，分別以3 倍信噪比和10 倍信噪比對應(yīng)的待測真菌毒素的質(zhì)量濃度為該方法的檢出限和定量限。11 種真菌毒素的質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限見表6。由表6 可知，11種真菌毒素線性方程的相關(guān)系數(shù)均不小于0.996，檢出限和定量限均低于文獻值[14-15]。

表6 11 種真菌毒素的質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

2.5 加標回收與精密度試驗

選擇天麻樣品，按1.4 方法進行樣品處理，按1.3儀器工作條件測定，11 種真菌毒素均未檢出。在該天麻樣品中加入適量的11 種真菌毒素混合標準儲備液，按1.4 方法平行處理6 份樣品溶液，在1.3 儀器工作條件下分別進行測定，計算加標回收率和測定結(jié)果的相對標準偏差，結(jié)果見表7。天麻加標樣品溶液MRM 色譜圖如圖2 所示。由表7 可知，11種真菌毒素的加標回收率為76.1%～97.6%，測定結(jié)果的相對標準偏差為3.97%～8.58%，表明該方法準確度和精密度均較好，滿足天麻等中藥材復(fù)雜基質(zhì)的檢測要求。

表7 加標回收試驗測定結(jié)果

續(xù)表7

圖2 天麻加標樣品MRM 色譜圖

3 結(jié)語

建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定中藥材中11 種真菌毒素的分析方法。該方法在14 min 內(nèi)能夠準確地完成11 種真菌毒素的定性、定量分析，具有簡潔、靈敏、準確穩(wěn)定等特點，適合于中藥材中11種真菌毒素的快速測定，對評價中藥材內(nèi)在質(zhì)量與安全性具有重要意義。