舒開繼，黃選忠

(湖北興山縣疾病預防控制中心，湖北興山 443700)

抗壞血酸(維生素C)是維持機體正常生理功能的重要維生素之一，它廣泛參與機體內(nèi)多種氧化還原等復雜的代謝過程，具有重要的生理功能，包括促進膠原蛋白合成、加速傷口愈合、促進鐵的吸收和葉酸的利用，增加造血功能等，在臨床上主要用于治療壞血病、特發(fā)性高鐵血紅蛋白血癥、肝硬化、急性肝炎和化學中毒所至的肝損傷等，也可用于肝炎、腦炎等病毒性傳染病及紫癜的輔助治療，因此準確測定藥品中抗壞血酸的含量對保障患者治療效果具有重要意義。

目前測定抗壞血酸的主要方法有碘量法[1]、分光光度法[2-3]、電化學法[4]、高效液相色譜法[5-7]、離子色譜法[8-10]等，其中，碘量法、分光光度法選擇性差，電化學法、高效液相色譜法需要專用儀器，離子色譜-直流安培檢測法[8]和離子色譜-間接熒光檢測法[9]雖然有較高的檢測靈敏度，但均需要專用檢測器，不便推廣應用。離子色譜-電導檢測法[10]線性范圍為50～500 mg/L，不適用于抗壞血酸含量在50 mg/L 以下樣品的檢測。

筆者以SH-AC-3 型陰離子交換柱為分離柱，以12.0 mmol/L NaHCO3溶液為淋洗液，流量為1.0 mL/min，采用等度洗脫的方式可使抗壞血酸與氟化物、乙酸鹽、氯化物、亞硝酸鹽、溴化物、硝酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽等常見陰離子及苯甲酸、草酸等完全分離，采用CIC-100 型色譜儀測定藥品中抗壞血酸含量，線性范圍為3.0～500.0 mg/L，比文獻[10]的線性范圍(50～500 mg/L)更寬，可測定質(zhì)量濃度低至3 mg/L 的抗壞血酸。該方法滿足維生素C 針劑和片劑中抗壞血酸含量的測定。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

離子色譜儀：CIC-100 型，附SHY-2 型自再生抑制器，青島盛瀚色譜技術有限公司。

定量環(huán)體積：25 μL，青島盛瀚色譜技術有限公司。

自動進樣器：SHA-15 型，青島盛瀚色譜技術有限公司。

電子天平：BT214D 型，感量為0.1 mg，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

電子天平：JA2003 型，感量為1 mg，上海菁海儀器有限公司。

濾膜過濾器：孔徑為0.45 μm ，直徑為13 mm，青島盛瀚色譜技術有限公司。抗壞血酸：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。草酸(H2C2O4·2H2O)：優(yōu)級純，國藥集團化學試劑有限公司。

磷酸二氫鉀、溴化鉀、乙酸鈉(CH3COONa·3H2O)：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

水中硝酸鹽氮溶液標準物質(zhì)、水中氟化物成分分析標準物質(zhì)、水中氯根成分分析標準物質(zhì)、水中硫酸根成分分析標準物質(zhì)、食品防腐劑苯甲酸溶液標準物質(zhì)：質(zhì)量濃度均為1 000 mg/L，編號分別為NIM-RM 3058、GBW(E) 080549、GBW(E) 080268、GBW(E) 080266、GBW(E) 100006，中國計量科學研究院。

水中亞硝酸鹽氮成分分析標準物質(zhì)：質(zhì)量濃度為100 mg/L，編號為GBW(E) 080223，中國計量科學研究院。

碳酸氫鈉：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

維生素C針劑：0.5 g/(2 mL)，湖北天藥藥業(yè)股份有限公司。

維生素C片劑：0.1 g/片，華中藥業(yè)股份有限公司。

實驗所用其它試劑均為分析純。

實驗用水為高純水，電阻率為18.2ΜΩ·cm。

1.2 儀器工作條件

色譜分離柱：SH-AC-3 型陰離子交換柱(250 mm×4.0 mm，青島盛瀚色譜技術有限公司)；保護柱：SH-AC-3 型柱(50 mm×4.0 mm，青島盛瀚色譜技術有限公司)；淋洗液：12.0 mmol/L NaHCO3溶液，流量為1.0 mL/min；柱箱溫度：30 ℃；電流強度：75 mA；檢測器：電導檢測器；自動進樣器：全定量環(huán)取樣，取樣后清洗(每針之間)，置換量為70 μL；進樣體積：25 μL；進樣深度：4 mm。

1.3 實驗方法

1.3.1 溶液配制

草酸標準溶液：1 000 mg/L，稱取0.140 1 g 草酸，用高純水溶解并定容至100 mL。

H2PO4-標準溶液：1 000 mg/L，稱取磷酸二氫鉀(于105 ℃烘烤2 h) 0.140 2 g，用高純水溶解并定容至100 mL。

Br-標準溶液：1 000 mg/L，準確稱取溴化鉀(于105 ℃烘烤2 h) 0.148 9 g，用高純水溶解并定容至100 mL。

乙酸鹽標準溶液：1 000 mg/L，稱取乙酸鈉(CH3COONa·3H2O) 0.230 5 g，用高純水溶解并定容至100 mL。

抗壞血酸標準溶液：1 000 mg/L，稱取0.100 0 g抗壞血酸，溶解于高純水并定容至100 mL。

抗壞血酸標準使用液：100.0 mg/L，將抗壞血酸標準溶液用高純水稀釋制得，臨用現(xiàn)配。

抗壞血酸系列標準工作溶液：分別取抗壞血酸標準使用液0.30、0.50、1.00 mL 及抗壞血酸標準溶液0.30、0.50、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 于10 只10 mL容量瓶中，加入高純水定容至標線，混勻，配制成抗壞血酸質(zhì)量濃 度分別為3.0、5.0、10.0、30.0、50.0、100.0、200.0、300.0、400.0、500.0 mg/L 的系列標準工作溶液。

1.3.2 標準工作曲線繪制

分別取抗壞血酸系列標準工作溶液各1.5 mL于樣品瓶中，啟動自動進樣器進樣，在1.2 儀器工作條件下分別測定，以抗壞血酸質(zhì)量濃度(x)為橫坐標、對應的色譜峰面積(y)為縱坐標，繪制標準工作曲線。

1.3.3 樣品處理

取維生素C 片劑10 片，用高純水溶解，充分攪拌后，定容至1 000 mL，濾去不溶物，取濾液經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾，待測。

吸取維生素C 針劑1.00 mL，用高純水定容至100 mL，溶液用0.45 μm 濾膜過濾，待測。

1.3.4 樣品測定

取1.3.3 中的樣品溶液，經(jīng)適當稀釋后加入樣品瓶中，啟動自動進樣器進樣，測定并計算抗壞血酸的色譜峰面積，以標準曲線法定量。同時進行加標回收試驗。

2 結果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

2.1.1 淋洗液

在堿性條件下，抗壞血酸易發(fā)生降解反應生成草酸，影響抗壞血酸的準確測定，文獻[11]曾報道在15.0 mmol/L NaHCO3溶液(pH 約為8.3)中抗壞血酸在80 min 內(nèi)未降解為草酸。為盡量減少抗壞血酸的降解反應，選擇NaHCO3溶液為淋洗液，并對NaHCO3溶液濃度進行試驗考察，結果見表1。

表1 不同淋洗液濃度時待測組分保留時間(t)與分離度(R)

由表1 可知，NaHCO3溶液濃度分別為10.0、12.0、15.0 mmol/L 時，抗壞血酸均能與氟化物、氯化物完全分離，3 種NaHCO3溶液濃度下，氟化物色譜峰分離度分別為3.96、3.72 和3.28，抗壞血酸色譜峰分離度分別為3.34、3.17 和2.88，滿足相鄰組分完全分離(R≥1.5)的要求[12]，故選擇12.0 mmol/L NaHCO3溶液為淋洗液。在此淋洗條件下抗壞血酸、氟化物、氯化物混合標準溶液色譜圖如圖1 所示。

圖1 抗壞血酸、氟化物、氯化物混合標準溶液色譜圖

2.1.2 淋洗液流量

考察淋洗液流量分別為0.8、1.0、1.2 mL/min 時各組分的分離情況，結果見表2。由表2 可知，隨著淋洗液流量的增加，各組分的保留時間(t)逐漸縮短，且氟化物、抗壞血酸的色譜峰分離度(R)均在1.5以上，表明各組分能完全分離。在保證抗壞血酸與其它離子良好分離的前提下，為保證組分有較短的保留時間和較高的色譜峰分離度、系統(tǒng)有較低的壓力，選擇淋洗液流量為1.0 mL/min。

表2 不同淋洗液流量時待測組分保留時間(t)與分離度(R)

2.1.3 柱箱溫度

考察柱箱溫度分別為25、30、35、40 ℃時各組分的分離效果，結果顯示，隨著柱溫的升高，抗壞血酸的保留時間稍微延長，色譜峰面積及色譜峰分離度均逐漸減小，與鄰苯二甲酸根[13]、草酸[14]、對氨基苯磺酸[15]和巴比妥酸[16]的試驗結果正好相反，可能與溫度較高時抗壞血酸穩(wěn)定性降低從而加速降解有關。考慮到較高溫度時抗壞血酸更容易發(fā)生降解反應，同時便于柱溫的控制，選擇柱箱溫度為30 ℃。

2.1.4 色譜柱

以12.0 mmol/L 的NaHCO3溶液為淋洗液、流量1.0 mL/min，等度洗脫，分別考察SH-AC-1 型和SH-AC-3 型陰離子交換柱對抗壞血酸與其它常見陰離子的分離效果。結果表明，SH-AC-1 型陰離子交換柱雖然能將抗壞血酸與氟化物、氯化物等常見陰離子完全分離，但抗壞血酸的檢測靈敏度明顯偏低，故選擇SH-AC-3 型陰離子交換柱為分離柱。

2.2 共存物質(zhì)影響

配制含抗壞血酸100 mg/L，硝酸鹽、亞硝酸鹽各10 mg/L，氯化物5 mg/L，溴化物、苯甲酸、草酸各20 mg/L，硫酸鹽、乙酸鹽、H2PO4-各40 mg/L，氟化物2 mg/L 的混合標準溶液，取1.5 mL 上述混合標準溶液于樣品瓶中，啟動自動進樣器進樣測定，考察抗壞血酸與上述8 種常見陰離子和2 種有機酸的分離效果，結果表明，在試驗條件下，抗壞血酸與上述8 種常見陰離子和2 種有機酸可以完全分離，但H2PO4-、硫酸鹽和草酸的保留時間分別長達55、110、152 min，其余7 種組分的色譜圖如圖2 所示。由圖2 可以看出，氟化物和乙酸鹽的出峰順序均在抗壞血酸之前，其余5 種組分的出峰順序均在抗壞血酸之后，其中苯甲酸與硝酸鹽完全不能分離，二者合并為一個峰，由此可見所考察的10 種物質(zhì)均不影響抗壞血酸的測定。

圖2 抗壞血酸與常見陰離子混合標準溶液色譜圖

2.3 線性方程與檢出限

按照1.3.2 方法繪制標準曲線，計算線性方程和相關系數(shù)。測定儀器工作30 min 的基線平均噪聲[17]，以3 倍基線噪聲除以標準曲線的斜率作為抗壞血酸的檢出限。結果表明，抗壞血酸的線性范圍為3.0～500.0 mg/L，線性方程為y=11 820x-52 060，相關系數(shù)為0.999 3，檢出限為2.7 mg/L。50.0 mg/L抗壞血酸標準溶液的色譜圖如圖3 所示。

圖3 50.0 mg/L 抗壞血酸標準溶液色譜圖

2.4 加標回收與精密度試驗

按1.3.3 和1.3.4 操作步驟，對維生素C 針劑和片劑中抗壞血酸含量各平行測定5 次，計算測定結果的相對標準偏差(RSD)。在樣品中分別添加25.0、50.0、100.0 mg/L 的抗壞血酸，測定并計算加標回收率。加標回收與精密度試驗結果見表3。由表3 可知，樣品加標回收率為95.1%～101.6%，測定結果的相對標準偏差為1.55%～2.79%，表明該方法的準確度較高、重現(xiàn)性良好。維生素C 針劑、片劑加標樣品色譜圖如圖4 所示。

表3 加標回收與精密度試驗結果

圖4 維生素C 針劑、片劑加標樣品色譜圖

3 結語

以SH-AC-3 型陰離子交換柱為分離柱，以12.0 mmol/L NaHCO3溶液為淋洗液，流量為1.0 mL/min等度洗脫，建立了離子色譜-抑制電導檢測法測定藥品中抗壞血酸。該方法應用于維生素C 針劑和片劑中抗壞血酸含量測定，回收率高，重現(xiàn)性好，操作簡便、快速，有推廣價值。