李健華，黃錦波

[1.廣東省江門生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)站，廣東江門 529000； 2.吉姆斯(廣州)實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司，廣州 510000]

蒲公英具有清熱、祛火、解毒和利尿等功效[1]，可用作蔬菜、藥材、飼料與保健品[2]，蒲公英提取物應(yīng)用范圍更廣[3]。蒲公英在全國(guó)各地均有種植，如安徽，東北三省，廣東信宜等。不同產(chǎn)區(qū)的蒲公英提取物中的活性物質(zhì)有一定的區(qū)別[4]。建立蒲公英提取物中活性物質(zhì)含量分析方法，既可區(qū)別不同產(chǎn)區(qū)的蒲公英提取物，也可初步判斷哪些地區(qū)的土壤或者氣候條件更適合種植蒲公英，同時(shí)也能給相關(guān)的種植農(nóng)戶提供一定的技術(shù)參考[5-7]。

目前，測(cè)定蒲公英提取物中活性物質(zhì)的方法主要有液相色譜法[8]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[9]。楊麗群[10]采用高效液相色譜法測(cè)定蒲公英提取物中的咖啡酸、綠原酸、原兒茶酸；冀新花[11]用高效液相色譜法測(cè)定蒲公英提取物中綠原酸；李盛建等[12]利用高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器法同時(shí)測(cè)定蒲公英提取物配方顆粒中綠原酸、咖啡酸等6 種成分的含量；原琦等[13]利用高效液相色譜-質(zhì)譜法分析蒲公英中4 種有效成分。但筆者參考文獻(xiàn)[14]，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蒲公英提取物中10 種活性物質(zhì)時(shí)發(fā)現(xiàn)，兒茶素需要的霧化溫度高，氮?dú)庀牧看螅焕诳刂茩z測(cè)成本，而綠原酸、α-紅沒藥醇、去甲二氫愈創(chuàng)木酸在正負(fù)模式下無明顯響應(yīng)。目前采用液相色譜法同時(shí)測(cè)定蒲公英提取物中兒茶素、紅景天苷、綠原酸、阿魏酸、α-紅沒藥醇、去甲二氫愈創(chuàng)木酸、甘草酸銨、甘草次酸、槲皮素、山奈酚10 種活性物質(zhì)的研究還未見報(bào)道。筆者建立了高效液相色譜法測(cè)定蒲公英提取物中上述10 種活性物質(zhì)的含量，該方法分析效率高，成本低，為進(jìn)一步研究蒲公英的活性成分提供了一種可行的檢測(cè)方法，也可以初步判斷哪些地區(qū)的土壤或者氣候條件更適合種植蒲公英，為相關(guān)的種植農(nóng)戶提供一定的技術(shù)參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：LC-1260 型，配有二極管陣列檢測(cè)器(DAD)和自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)，美國(guó)安捷倫科技有限公司。

電子分析天平：BSA224S-CW 型，感量為0.1 mg，德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。

兒茶素、紅景天苷、甘草酸銨對(duì)照品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為98.1%、99.7%、94.4%，批號(hào)分別為110877-202005、110818-202009、10731-202122，中國(guó)食品藥品檢定研究院。

α-紅沒藥醇、去甲二氫愈創(chuàng)木酸對(duì)照品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為99%、98.0%，批號(hào)分別為CDCTGS09010039IP、CDCT-C15644200，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

綠原酸、阿魏酸、甘草次酸、槲皮素、山奈酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為99.4%、99.8%、99.9%、99.3%、99.5%，編號(hào)分別為GBW(E) 09528、GBW(E)09518、GBW(E) 09530、GBW(E) 09526、GBW(E)09525，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所。

蒲公英提取物樣品：市售。

實(shí)驗(yàn)用水為去離子水，由賽多利斯Sartorius arium?comfort Ⅱ型純水儀制備。

1.2 溶液配制

10 種活性物質(zhì)混合對(duì)照品儲(chǔ)備液：分別稱取兒茶素、紅景天苷、綠原酸、阿魏酸、α-紅沒藥醇、去甲二氫愈創(chuàng)木酸、甘草酸銨、甘草次酸、槲皮素、山奈酚對(duì)照品適量，用甲醇溶解并稀釋至各組分質(zhì)量濃度均約為1 000 μg/mL 的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

10 種活性物質(zhì)系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：精密移取10 種活性物質(zhì)混合對(duì)照品儲(chǔ)備液0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mL ，分別置于7 只10 mL 棕色容量瓶中，用甲醇稀釋至標(biāo)線，配制成各組分質(zhì)量濃度均分別為1、5、10、20、40、80、100 μg/mL 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 色譜條件

色 譜 柱：SCION-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美國(guó)瓦里安儀器有限公司)；柱溫箱溫度：35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：兒茶素、去甲二氫愈創(chuàng)木酸、α-紅沒藥醇為200 nm，甘草酸銨、甘草次酸為272 nm，紅景天苷、綠原酸、阿魏酸為316 nm，槲皮素、山柰酚為366 nm；進(jìn)樣體積：10 μL；流動(dòng)相：A 為甲醇，B 為0.2%甲酸水溶液；洗脫方式：梯度洗脫，洗脫程序見表1。

表1 梯度淋洗程序

1.4 樣品處理

稱取樣品約1 g(精確到0.1 mg)于10 mL 棕色容量瓶中，加入2 mL 水，混勻，超聲15 min，再加入5 mL 甲醇，繼續(xù)超聲15 min，用甲醇稀釋至標(biāo)線，過濾，即得樣品溶液。

1.5 定量方法

取10 種活性物質(zhì)系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣品溶液，按1.3 色譜條件進(jìn)樣分析，以待測(cè)組分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、對(duì)應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo)(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，采用外標(biāo)法進(jìn)行定量。樣品中活性物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)w按照式(1)計(jì)算：

式中：w——樣品中活性物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，μg/g；

ρ——樣品溶液中活性物質(zhì)的質(zhì)量濃度，μg/mL；

V——樣品溶液定容體積，mL；

m——樣品質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器工作條件優(yōu)化

2.1.1 分析波長(zhǎng)

采用二極管陣列檢測(cè)器在190～400 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)樣品溶液進(jìn)行掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兒茶素、α-紅沒藥醇、去二甲愈木酸在200 nm 處響應(yīng)最強(qiáng)，甘草酸銨、甘草次酸在272 nm 處有較強(qiáng)的吸收，紅景天苷、綠原酸、阿魏酸在316 nm 處有較強(qiáng)的吸收，而槲皮素、山奈酚在366 nm 處的吸收最強(qiáng)，因此選擇兒茶素、α-紅沒藥醇、去二甲愈木酸的分析波長(zhǎng)為200 nm，甘草酸銨、甘草次酸的分析波長(zhǎng)為272 nm，紅景天苷、綠原酸、阿魏酸的分析波長(zhǎng)為316 nm，槲皮素、山奈酚的分析波長(zhǎng)為366 nm。

2.1.2 色譜柱

分別選用SCION-C18型反相色譜柱、ZORBAX Rx-SIL 型正相色譜柱和APS-2 Hypercil 型正反兩用色譜柱進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用ZORBAX Rx-SIL 型色譜柱時(shí)不出峰，使用APS-2 Hypercil 型色譜柱時(shí)僅出現(xiàn)1 個(gè)色譜峰，而選用SCION-C18型色譜柱時(shí)10 種活性物質(zhì)出峰良好，分離度與響應(yīng)值均比較理想，因此選用SCION-C18型色譜柱作為分析柱。

2.1.3 流動(dòng)相配比與流量

參考文獻(xiàn)[15]，選擇甲醇-0.2%甲酸水溶液為流動(dòng)相。由于10 種活性物質(zhì)的極性不同，需選擇梯度淋洗方式進(jìn)行分離。紅景天苷、兒茶素、綠原酸極性相對(duì)較大，出峰時(shí)間較早，為了延長(zhǎng)其出峰時(shí)間，在0～10 min 時(shí)，水相體積分?jǐn)?shù)保持80%；阿魏酸、槲皮素與山奈酚的極性相對(duì)偏中性，出峰時(shí)間較兒茶素、綠原酸晚，故在10～30 min 時(shí)，水相體積分?jǐn)?shù)由80%逐漸減小到50%；而甘草酸銨、甘草次酸、紅沒藥醇的極性相對(duì)較弱，在30～50 min 時(shí)，水相體積分?jǐn)?shù)由50%逐漸減小到10%，在50～60 min 時(shí)，水相體積分?jǐn)?shù)再?gòu)?0%調(diào)回80%。

一般而言，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱(簡(jiǎn)稱C18柱)作為分析柱時(shí)，流動(dòng)相的流量越大，目標(biāo)色譜峰保留時(shí)間越小[16]。當(dāng)流動(dòng)相流量為1 mL/min 時(shí)，紅景天苷色譜峰與兒茶素色譜峰發(fā)生重疊，分離度小于0.5。為了提高色譜峰分離度，在0～10 min 時(shí)，流動(dòng)相流量為0.3 mL/min，在10～30 min 時(shí)流量為0.5 mL/min。由于30 min 后目標(biāo)峰僅余2 個(gè)，因此在30～50 min 流動(dòng)相流量改為1 mL/min，以縮短分析時(shí)間，在50～60 min 時(shí)，流量則改回0.3 mL/min。

在優(yōu)化的儀器工作條件下，10 種活性物質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和加標(biāo)樣品溶液的色譜圖分別如圖1 和圖2 所示。

圖1 10 種活性物質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

圖2 加標(biāo)樣品溶液的色譜圖

2.2 線性方程與檢出限

在1.3 色譜條件下，分別測(cè)定10 種活性物質(zhì)系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以各組分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、色譜峰面積為縱坐標(biāo)(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計(jì)算線性方程和相關(guān)系數(shù)。

取10 種活性物質(zhì)的質(zhì)量濃度均為20 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇逐級(jí)稀釋，在1.3 色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜峰面積，以3 倍信噪比對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度作為待測(cè)物質(zhì)的檢出限。

10 種活性物質(zhì)的質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限見表2。

表2 10 種活性物質(zhì)的質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

2.3 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)

取蒲公英提取物樣品，測(cè)定其中10 種活性物質(zhì)的含量。分別向樣品中添加0.16、0.32、0.8 mL的10 種活性物質(zhì)混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，按1.4 方法每種加標(biāo)濃度水平平行處理6 份樣品溶液，在1.3 色譜條件下分別進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算各待測(cè)物質(zhì)的加標(biāo)回收率和測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表3。由表3 可知，10 種活性物質(zhì)的加標(biāo)回收率為86.2%～104.3%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.2%～4.8%。表明該方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度，可用于檢測(cè)蒲公英提取物中的10 種活性物質(zhì)。

表3 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)語

建立了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定蒲公英提取物中10 種活性物質(zhì)的含量，采取梯度淋洗方式進(jìn)行分離，利用二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)，提高了分析效率，降低了分析成本，方法精密度、準(zhǔn)確度高。