李玉潔 張瑜 吳誠潔 陸琳 王燕麗 李楊欣

(蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院心血管病研究所 蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院心臟大血管外科，江蘇 蘇州 215123)

目前，心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)的死亡人數(shù)約占全球總死亡人數(shù)的1/3，難以預(yù)防且難以治愈，因此，CVD正成為威脅全球人民健康的第一大殺手[1]。CVD是發(fā)生于心臟和循環(huán)系統(tǒng)的疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。已有報道稱，不同類型的細(xì)胞、慢性炎癥反應(yīng)、多種細(xì)胞因子和黏附分子都是CVD發(fā)病的潛在原因[2]。近期研究表明，核糖體泛素化也參與了CVD的發(fā)生發(fā)展?，F(xiàn)就核糖體泛素化在CVD中的研究進(jìn)展做一綜述，旨在為CVD的治療提供新思路。

1 核糖體

細(xì)胞是生命最小的代謝功能單位，能感知外界信號并作出反應(yīng)，這一過程受到蛋白質(zhì)合成的嚴(yán)格控制[3]。核糖體，也稱核蛋白體，是細(xì)胞中負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)合成的細(xì)胞器，由核糖體RNA(ribosomal RNA，rRNA)和核糖體蛋白(ribosomal proteins，RPs)構(gòu)成，幾乎存在于所有細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器，即使是體積最小的支原體細(xì)胞內(nèi)也含有上百個核糖體[4]。半個世紀(jì)以前，人們通過對哺乳動物細(xì)胞中的RNA進(jìn)行放射性脈沖標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)真核生物核仁中的核糖體由一個巨大前體rRNA組成，即45S rRNA前體，之后被加工成5.8S、18S和28S rRNA[5]。其后，對脈沖標(biāo)記的RNA進(jìn)行蔗糖梯度離心，發(fā)現(xiàn)了各種rRNA中間體的前核糖體顆粒(稱為43S、66S和90S)[5]。值得注意的是，66S和90S前核糖體顆粒比成熟亞基具有更高的蛋白質(zhì)/RNA比，據(jù)此推測核糖體可能包含其他蛋白質(zhì)[5]。

多年的研究[6]證明，真核生物核糖體由4種rRNA和80種RPs組成。在從核仁到細(xì)胞質(zhì)的運(yùn)輸過程中，這些前核糖體與它們的大部分非核糖體因子分離，然后成為成熟的40S和60S亞基，用于蛋白質(zhì)翻譯[7]。核糖體60S大亞基，包含5S rRNA、5.8S rRNA、28S rRNA和47種RPs，而40S小亞基包含18S rRNA和33種RPs[6]。組成大、小亞基的RPs分別稱之為大亞基核糖體蛋白(ribosomal protein large subunit，RPL)和小亞基核糖體蛋白(ribosomal protein small subunit，RPS)[8]。RPs除了參與蛋白質(zhì)的合成之外，還能調(diào)控細(xì)胞生長、增殖、分化、凋亡和DNA修復(fù)，被稱為核糖體外功能[9](表1)。另外，RPs的功能障礙與CVD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[9-10]。

表1 部分RPs的核糖體外功能

2 泛素化

泛素化是指泛素蛋白(ubiquitin，Ub)以共價鍵附著在底物蛋白上調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的降解，是一種動態(tài)的多層面翻譯后修飾，并參與幾乎所有的細(xì)胞過程，如細(xì)胞周期進(jìn)程、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等[20]。1977年，Goldknopf等[21]首次發(fā)現(xiàn)Ub可通過賴氨酸連接修飾組蛋白。在20世紀(jì)80年代，研究表明三磷酸腺苷底物的泛素化與26S蛋白酶體降解相關(guān)聯(lián)[22]。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，超過1 000種蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)人類細(xì)胞的泛素化，數(shù)千個蛋白質(zhì)上存在數(shù)萬個泛素化位點，大多數(shù)蛋白質(zhì)在細(xì)胞生命周期的某個時刻都會經(jīng)歷泛素化，泛素化反應(yīng)幾乎涉及真核生物的所有代謝過程[22]。

研究表明，泛素化途徑是在泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin proteasome system，UPS)的催化下，泛素分子結(jié)合底物分子的過程[23]。該過程是由E1泛素活化酶、E2泛素綴合酶和E3泛素-蛋白質(zhì)連接酶的作用介導(dǎo)[20，24]，首先由E1激活泛素，然后E2將泛素轉(zhuǎn)移到E3，最后E3催化泛素與靶蛋白的共價結(jié)合。相反，去泛素化酶(deubiquitinase，DUB)催化可介導(dǎo)催化底物蛋白中泛素分子的去除[24]。其中，E3決定泛素和底物連接的特異性和精確性，人類基因組里有超過800個E3，因此泛素化比其他蛋白質(zhì)修飾更加復(fù)雜，功能更加多樣[23]。

此外，泛素分子本身能以不同的結(jié)構(gòu)形式結(jié)合效應(yīng)蛋白，不同的效應(yīng)蛋白可能具有不同的泛素結(jié)合域，效應(yīng)蛋白以不同結(jié)合域特異性結(jié)合泛素，從而導(dǎo)致不同的功能，包括降解、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和亞細(xì)胞定位的改變等。例如，K48(第48號賴氨酸)和K11鏈?zhǔn)堑鞍酌阁w降解的關(guān)鍵信號，而K6、K27、K33和K63支鏈泛素鏈通常是不可降解的[24]。最近的研究[24-25]進(jìn)一步揭示了支鏈泛素鏈在亞細(xì)胞定位或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用。

既往研究多聚焦于泛素化參與細(xì)胞凋亡、自噬等生理病理過程[26](圖1)，而近期研究表明，泛素化在CVD的發(fā)生發(fā)展中也具有調(diào)控作用?，F(xiàn)就其作用進(jìn)行總結(jié)和分析。

圖1 泛素化與細(xì)胞損傷

2.1 核仁素泛素化與CVD

核仁素 (nucleolin，Ncl) 是核仁中最豐富的蛋白之一，主要分布于核仁區(qū)，也存在于核質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中，在核糖體新生中發(fā)揮重要作用[27]。自1973年Orrick等首次對其進(jìn)行描述以來一直是眾多研究的重點[27]。

Ncl主要由三個結(jié)構(gòu)域組成：N端結(jié)構(gòu)域、中心結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域。這三個結(jié)構(gòu)域允許Ncl與不同的蛋白質(zhì)和RNA序列相互作用，在核糖體新生的不同階段發(fā)揮不同的作用[27]。在前核糖體RNA (pre-ribosomal RNA，pre-rRNA) 轉(zhuǎn)錄過程中，Ncl作為伴侶幫助pre-rRNA正確折疊、RNA包裝、前信使RNA (pre-messenger RNA，pre-mRNA) 剪接和mRNA穩(wěn)定[27]。Ncl還被證明參與細(xì)胞質(zhì)分裂、細(xì)胞增殖、凋亡調(diào)節(jié)和應(yīng)激反應(yīng)等多個生理病理過程，從而參與血管生成、腫瘤發(fā)生、病毒感染等多個病理過程[27]。

近期研究表明，核仁素的泛素化可導(dǎo)致疾病的發(fā)生。2018年，Wang等[28]發(fā)現(xiàn)Ncl的泛素化會抑制Ncl蛋白表達(dá)，影響Ncl蛋白的穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致糖尿病腎病。糖尿病腎病是糖尿病常見的臨床并發(fā)癥，與CVD密切相關(guān)，是導(dǎo)致終末期腎臟疾病的主要原因。CYP4B1-PS1-001是長鏈非編碼RNA，調(diào)節(jié)糖尿病腎病的纖維化[28]。Wang等[28]的研究發(fā)現(xiàn)在環(huán)己亞胺處理的系膜細(xì)胞中，CYP4B1-PS1-001的過表達(dá)導(dǎo)致Ncl泛素化，抑制Ncl蛋白表達(dá)，但不影響mRNA表達(dá)，這表明CYP4B1-PS1-001是通過泛素化修飾降解Ncl蛋白質(zhì)，導(dǎo)致腎病[28]。另外，三重基序蛋白2 (tripartite motif-containing protein 2，TRIM2) 是Ncl泛素化中主要的E3泛素-蛋白質(zhì)連接酶，敲除TRIM2基因會提高Ncl的蛋白水平，證明TRIM2作為E3泛素-蛋白質(zhì)連接酶在Ncl降解中的作用。綜上，研究提示核仁素的泛素化有望成為糖尿病腎病與CVD的治療靶點。

此外，Ko等[29]發(fā)現(xiàn)多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤發(fā)生時，膠質(zhì)瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞(glioma stem-like cells，GSC)的富集會上調(diào)鼠雙微基因2(murine double minute 2，MDM2)介導(dǎo)的Ncl泛素化，從而降低Ncl水平。但抑制Ncl的去乙?；瘯柚筃cl泛素化的發(fā)生，STAT3和JNK信號通路也會阻止Ncl降解，從而阻止GSC的富集[29]。該發(fā)現(xiàn)表明Ncl有望成為多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療的潛在靶點[29]。

2.2 核糖體泛素化與心肌重構(gòu)

心肌肥厚和纖維化都會導(dǎo)致心肌重構(gòu)，且都是心力衰竭發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ)[30]。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly(ADP-ribose)-polymerase，PARP]1是PARP家族中的一員。PARP家族酶是CVD的重要損傷因子，尤其是在心臟瓣膜病中PARP起到重要作用。PARP主要負(fù)責(zé)將腺苷二磷酸核糖基團(tuán)轉(zhuǎn)移到靶蛋白質(zhì)上，從而影響各種細(xì)胞過程[30-33]。PARP1激活后會識別受損的DNA片段，使片段發(fā)生多聚ADP核糖基化反應(yīng)。 PARP1活性增強(qiáng)后，會與WW域E3泛素-蛋白質(zhì)連接酶2(WW domain-containing E3 ubiquitin protein ligase 2，WWP2)作用并通過泛素化途徑使得心肌細(xì)胞極度消耗能量，從而引發(fā)心肌細(xì)胞損傷，介導(dǎo)心肌重構(gòu)[32]。這些研究表明PARP1泛素化程度影響心肌重構(gòu)。

WWP2是與E6-AP羧基末端同源(homologous to the E6-AP carboxyl terminus，HECT)結(jié)構(gòu)域家族類的E3泛素連接酶，在心臟中高表達(dá)，且參與異丙腎上腺素(isoproterenol，ISO) 誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)[30，34]。2020年，Zhang等[30]在小鼠心肌中特異性敲除WWP2，發(fā)現(xiàn)PARP1的表達(dá)增加但泛素化水平降低，多聚核糖基化水平升高，小鼠ISO誘導(dǎo)的心肌肥厚、纖維化和心力衰竭加重。當(dāng)重新誘導(dǎo)WWP2的再表達(dá)會顯著增加PARP1的泛素化，降低PARP1和多聚核糖基化水平，初步表明WWP2是一個調(diào)節(jié)ISO誘導(dǎo)心肌重構(gòu)的保護(hù)因子[30]。Zhang等[30]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在生理狀態(tài)下，WWP2特異性結(jié)合到PARP1的乳腺癌易感基因羧基端結(jié)構(gòu)域(the carboxyl-terminal domain of the breast cancer gene 1，BRCT)，通過泛素化修飾PARP1的K249和K418位點促進(jìn)PARP1降解，保護(hù)小鼠免受ISO誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)。研究表明WWP2在ISO誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)中起到重要作用，這為治療與心臟重構(gòu)相關(guān)的心臟病提供了新靶點[30]。

此外，在許多CVD中都觀察到PARP1表達(dá)升高，PARP1活性升高，即多聚核糖基化現(xiàn)象[30]。PARP1和多聚核糖基化是重要的損傷因子，參與心肌細(xì)胞損傷和心肌重構(gòu)的過程[30]。ISO誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)和心肌缺血再灌注損傷等條件下，心肌細(xì)胞產(chǎn)生活性氧和活性氮。這些活性物質(zhì)引起DNA氧化損傷，進(jìn)而激活PARP1產(chǎn)生多聚核糖基化反應(yīng)，使心肌煙酰胺腺嘌呤二核苷酸和三磷酸腺苷水平顯著下調(diào)，導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死[33]。綜上，泛素化在心肌重構(gòu)中起著舉足輕重的作用。

2.3 核糖體泛素化與心肌梗死、缺血再灌注損傷

研究顯示，在人類和各種心臟疾病的動物模型中(包括心肌梗死、缺血性心臟病和心力衰竭)，Ub和活化的UPS的數(shù)量都在增加，泛素化相關(guān)基因在左心室壞死過程中上調(diào)，會激活UPS，激活的UPS導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和心肌細(xì)胞收縮蛋白的丟失，導(dǎo)致左心室功能惡化[35]。

在壓力過載小鼠模型中，蛋白酶體抑制劑Epoxomicin完全阻止了心肌肥厚，同時阻斷了蛋白酶體激活，提示UPS可能參與心力衰竭的發(fā)生[35]。與核糖體60S亞基相關(guān)的E3泛素連接酶Listerin1(Ltn1)，被證明可促進(jìn)Nonstop降解和No-go降解途徑產(chǎn)生的核糖體新生肽的降解，且依賴Ltn1的新生蛋白泛素化又導(dǎo)致核糖體亞基分解[36]。Rqc2是Ltn1招募到60S核糖體進(jìn)行泛素化所必需的因子，與Cdc48和Npl4/Ufd1聯(lián)合作用，促進(jìn)核糖體進(jìn)行泛素化降解[37]。

此外，Meyer等[38]通過多聚核糖體圖譜發(fā)現(xiàn)，多聚體中存在G3BP1、G3BP2和USP10蛋白。通過對G3BP1和G3BP2雙基因敲除(KO)的細(xì)胞培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)蛋白翻譯會停滯，多聚核糖體減少為核糖體單體，并產(chǎn)生大量游離的核糖體60S亞基。對USP10-KO細(xì)胞進(jìn)行泛素殘留免疫親和分析，發(fā)現(xiàn)泛素化的RPS2、RPS3和RPS10豐度最高，且在USP10-KO和G3BP1/2-雙基因KO細(xì)胞中觀察到40S和60S亞基中RPs的特異性降低。該研究還通過誘導(dǎo)核糖體停滯，發(fā)現(xiàn)去泛素化酶ZNF598介導(dǎo)的核糖體碰撞感應(yīng)是導(dǎo)致培養(yǎng)細(xì)胞中RPS2、RPS3和RPS10單泛素化的主要原因，從而表明RPS2、RPS3和RPS10去泛素化作用于G3BP1-family-USP10復(fù)合物。USP10或G3BP1家族蛋白的敲除又增加了核糖體的降解和核糖體亞基的紊亂。

研究發(fā)現(xiàn)，泛素化酶MDM2，能使凋亡轉(zhuǎn)錄因子p53泛素化，且心肌細(xì)胞泛素化水平升高的同時，20S和26S活性降低[39]。在犬心肌缺血再灌注的模型中發(fā)現(xiàn)26S蛋白酶體活性和泛素化蛋白積累的下降[39]，但在小鼠慢性心肌梗死模型中觀察到蛋白酶體活性增加，包括UPS組分水平和蛋白酶體活性的增加，其在壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的小鼠心臟肥厚模型中也得到證實[35，39]。這些研究提示，泛素化在心肌梗死與心肌缺血再灌注損傷中的精準(zhǔn)機(jī)制需深入研究，核糖體泛素化在其中的作用及機(jī)制亟待闡明。

2.4 核糖體泛素化與血管形成及相關(guān)疾病

RPs與血管形成密切相關(guān)[9]。在核糖體新生過程中，RPL5和RPL11作為復(fù)合體組裝，被招募到60S核糖體亞基。游離核糖體的RPL5和RPL11與泛素化酶MDM2結(jié)合，抑制p53發(fā)生泛素化降解，導(dǎo)致p53轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)、p53依賴的血管細(xì)胞周期阻滯[9]。在血管形成的過程中，游離的RPL17作為血管平滑肌細(xì)胞生長抑制劑，在小鼠中限制頸動脈內(nèi)膜增厚。RPL17可抑制血管平滑肌細(xì)胞的生長，使其停留在G0/G1期。已知RPL23可通過抑制MDM2的功能來調(diào)控p53，以應(yīng)對核糖體新生障礙[40]。RPL23的下調(diào)會誘導(dǎo)核糖體新生障礙，導(dǎo)致p53的穩(wěn)定和激活，這表明RPL23在這一通路中既起效應(yīng)又起傳感作用[9]。因此，RPL17也可能是通過激活p53來調(diào)控細(xì)胞周期，盡管目前還沒有證據(jù)表明其在p53通路中的作用[9]。

希佩爾-林道(von Hippel-Lindau，VHL)綜合征是一種罕見的遺傳性多器官腫瘤疾病，通過VHL突變基因傳播，該疾病與嗜鉻細(xì)胞瘤有關(guān)[41]。嗜鉻細(xì)胞瘤是腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞的非惡性腫瘤，會合成和釋放大量兒茶酚胺并產(chǎn)生心血管病變。VHL綜合征腫瘤抑制蛋白相關(guān)復(fù)合體(VHL tumor suppressor protein，pVHL)是缺氧誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子(hypoxia inducible factor，HIF)-1α亞基的E3泛素-蛋白質(zhì)連接酶復(fù)合物的組成部分，能使HIF進(jìn)行泛素化降解[42]。VHL綜合征中pVHL功能的喪失導(dǎo)致HIF的異常積累，引起HIF下游基因的過表達(dá)，包括血管內(nèi)皮生長因子的累積，這反過來又促進(jìn)了血管性腫瘤的形成[42]。此外，核糖體中RNA聚合酶Ⅱ第七亞基(hsRPB7)是VHL泛素化的下游靶點，VHL可通過其β結(jié)構(gòu)域直接與hsRPB7結(jié)合，靶向hsRPB7泛素化降解并降低血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)來調(diào)控血管生成[41]。綜上，核糖體泛素化在血管形成及相關(guān)疾病中的作用不容忽視。

3 展望

綜上所述，RPs不僅是組成核糖體的重要部分，更是參與到各類生化反應(yīng)的重要成分，具有多種核糖體外功能，如RPs泛素化具有重要的生理病理作用。近年來關(guān)于RPs泛素化在疾病發(fā)生方面的研究主要聚焦腫瘤的發(fā)生，少有在CVD方面的研究，且具體作用機(jī)制尚未闡明。實驗大多局限于體外細(xì)胞模型，缺少動物實驗與臨床研究，在動物實驗基礎(chǔ)上推導(dǎo)的結(jié)論及假說也亟需驗證。本文概述核糖體泛素化在CVD中的作用，旨在引起研究者關(guān)注，并在此領(lǐng)域進(jìn)一步探索，為治療CVD提供新策略。

作者貢獻(xiàn)聲明李玉潔：綜述構(gòu)思及撰寫，圖表繪制；張瑜：綜述構(gòu)思及修訂；吳誠潔，陸琳，王燕麗：綜述修訂；李楊欣：綜述構(gòu)思，圖表設(shè)計及修訂；李玉潔，張瑜：并列第一作者

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突