李 琴, 代書宇, 楊 媛, 馮玉敏, 練鴻振, 張書勝, 張文芬,4*

(1. 鄭州市食品藥品檢驗所, 河南 鄭州 450006; 2. 鄭州大學(xué)化學(xué)學(xué)院, 河南 鄭州 450001;3. 南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 江蘇 南京 210023; 4. 中國煙草總公司鄭州煙草研究院, 河南 鄭州 450001)

青霉素類抗生素是β-內(nèi)酰胺類中一大類抗生素的總稱,青霉素因高效低毒、成本低,常作為治療牛乳腺炎和其他細菌感染性疾病的首選藥物[1,2]。在我國養(yǎng)殖行業(yè)濫用青霉素的現(xiàn)象比較嚴重,甚至為了防止牛奶變壞,一些不法分子會將青霉素添加在鮮奶中以增加保質(zhì)期,這就給食品安全帶來了很大隱患,同時對人們的身體健康也構(gòu)成了潛在的危害[3]。國家市場監(jiān)督管理總局將乳制品中芐青霉素(gpenicillin)、鄰氯青霉素(cloxacillin)、氨芐青霉素(ampicillin)等列入高風(fēng)險監(jiān)測項目。因而研究一種準確、快速檢測牛奶中青霉素殘留量的方法具有重大現(xiàn)實意義。

目前動物源性食品中青霉素殘留量的測定方法有很多種,如膠體金免疫層析技術(shù)[4]、酶聯(lián)免疫法[5,6]、微生物法[7,8]、流動注射化學(xué)發(fā)光法[9]、電化學(xué)法[10]、液相色譜法[11-14]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[15-27]等多種方法,其中液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法因靈敏度高、適用范圍較寬、易確證而被越來越多地應(yīng)用于殘留分析中。

本實驗基于自制的共價三嗪骨架材料(CTFs)固相萃取小柱[28]來代替商品化固相萃取小柱,通過CTFs與目標物之間的π-π、氫鍵等相互作用力考察該材料富集和檢測牛奶中青霉素的可行性。選擇芐青霉素、鄰氯青霉素、氨芐青霉素3種青霉素化合物作為目標化合物,研究建立一種測定牛奶中青霉素的固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(SPE-UPLC-MS/MS)新方法。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Waters Xevo TQ-S超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Waters公司); TG16-WS臺式高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司); Rocket快速溶劑蒸發(fā)儀(英國GeneVac公司); PPM48半自動正壓固相萃取儀(美國J2 Scientific公司); Multi Reax全能型振蕩器、Heidolph Multi Reax振蕩器(德國Heidolph公司); BF2000氮氣吹干儀(北京八方世紀科技有限公司); MS204S精密電子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)。

芐青霉素、鄰氯青霉素、氨芐青霉素標準樣品(德國Dr. Ehrenstorfer公司,純度>99.9%);乙腈、甲醇均為色譜級(德國默克公司),娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈有限公司),甲酸(分析純,山東鑫博化工有限公司)。

自制共價三嗪骨架材料固相萃取小柱;牛奶樣品購自不同超市。

1.2 標準溶液的配制

分別精確稱取芐青霉素、鄰氯青霉素、氨芐青霉素標準品,用乙腈-水(30∶70, v/v)溶解并定容至100 mL,配成質(zhì)量濃度為100 μg/mL的標準儲備溶液。

分別取芐青霉素、鄰氯青霉素上述標準儲備溶液1 mL和氨芐青霉素標準儲備液2 mL于100 mL容量瓶中,用0.1%甲酸水溶液定容，配制成混合標準中間儲備液。

再分別取0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、2.0、5.0 mL混合標準中間液于10 mL容量瓶中,用0.1%甲酸水溶液定容，配制成系列混合標準工作溶液。

1.3 樣品前處理

準確稱取10 g牛奶樣品于50 mL離心管中,加入20 mL乙腈-水(15∶2, v/v)振蕩混勻3 min, 以6 000 r/min離心5 min后,將上清液轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)瓶內(nèi);再向離心管中加入10 mL乙腈-水(15∶2, v/v),將沉淀搗碎，振蕩1 min, 以6 000 r/min離心5 min后,合并兩次上清液,置于快速溶劑蒸發(fā)儀于45 ℃蒸發(fā)除去乙腈,之后立即用乙酸鹽緩沖液(pH 4.5)溶解,待凈化。

將裝有60 mg CTFs吸附劑的固相萃取小柱依次用3 mL甲醇、1 mL水進行活化后,將上述待凈化液以3 mL/min速率上樣,先用1 mL超純水淋洗,再用6 mL乙腈洗脫,將洗脫液于37 ℃氮氣吹干,用0.1%甲酸水溶液定容至1 mL,過0.45 μm有機濾膜后,立即用UPLC-MS/MS進行測定。

1.4 分析條件

1.4.1色譜條件

色譜柱:Waters ACQUITY UPLC BEH C18(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm),流動相A為0.1%甲酸水溶液(乙酸銨溶液調(diào)節(jié)pH 4.5), B為乙腈,梯度洗脫,洗脫程序見表1,流速0.3 mL/min,柱溫30 ℃,進樣量10 μL,采集時間5 min。

表 1 梯度洗脫程序

1.4.2質(zhì)譜條件

電噴霧正離子(ESI+)掃描,多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式,毛細管電壓0.89 kV,錐孔電壓85 V,脫溶劑溫度500 ℃,錐孔氣流速150 L/h,霧化器流速990 L/h,碰撞氣流速0.12 mL/min,駐留時間0.3 s。3種青霉素的定性離子對、定量離子對見表2。

表 2 3種青霉素的定性和定量離子對

2 結(jié)果與討論

2.1 作用機理討論

在我們前期[28]的研究中發(fā)現(xiàn),本文所制備的三嗪基共價有機骨架材料具有苯環(huán)、含氮原子三嗪環(huán)等活性位點,可以與核苷分子之間形成包結(jié)作用、π-π相互作用和OH…N、NH…O氫鍵作用、LP…π相互作用和靜電作用等多重相互作用力。本文所選取的青霉素靶標具有羧基、氨基、亞氨基、硫雜原子、苯環(huán)等多個活性位點。因此我們推測,與核苷分析類似,自制的共價三嗪骨架材料主體化合物可與目標物青霉素發(fā)生上述相同的多重作用力,使其可作為吸附劑成功用于牛奶中青霉素的富集和凈化。

2.2 樣品提取和凈化條件的選擇優(yōu)化

考慮到3種青霉素的性質(zhì)以及自制固相萃取小柱的特殊性,且為了獲得較高的回收率,本實驗對樣品的提取和凈化條件進行了選擇優(yōu)化。考慮到基質(zhì)的影響,樣品提取和凈化條件的優(yōu)化均在空白樣品基質(zhì)中進行,即在2.0 μg/mL添加水平下進行考察。

2.2.1樣品提取條件優(yōu)化

由于青霉素易溶于水,因此本實驗考察了乙酸鹽緩沖液(pH 4.5)、超純水、乙腈-水(15∶2, v/v)等提取溶液對青霉素的提取效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)上述提取溶液對3種青霉素的提取效果均差別不大。因乙腈可以沉淀乳制品中的蛋白質(zhì)和脂肪,為下一步的凈化做好準備,參照GB/T 21315-2007方法,最終選取乙腈-水(15∶2, v/v)作為提取溶液。

2.2.2凈化條件優(yōu)化

將提取溶液旋轉(zhuǎn)蒸干后,本實驗分別考察了用乙酸鹽緩沖液(pH 4.5)、0.1%甲酸水溶液、超純水等溶液溶解殘渣，以期獲得最佳凈化條件。結(jié)果表明,乙酸鹽緩沖液(pH 4.5)不僅能完全溶解殘渣,且對3種青霉素的回收率最高。

2.3 固相萃取條件優(yōu)化

為了獲得較高的回收率,本實驗考察了吸附劑填充量、洗脫劑種類和用量、上樣速率等因素對固相萃取效率的影響,以期最大限度地對目標物進行富集凈化?？紤]到基質(zhì)的影響,固相萃取的條件優(yōu)化均在空白樣品基質(zhì)中進行,即在0.5 μg/mL添加水平下進行考察。

2.3.1CTFs吸附劑填充量

吸附劑的用量是影響固相萃取效果的關(guān)鍵因素之一,用量太多會造成材料的浪費,用量太少則不能完全吸附目標分析物。本實驗考察了吸附劑填充量為20、40、60、80、100 mg時,CTFs對目標物的吸附效果。結(jié)果如圖1a所示,隨著吸附劑填充量的增加,目標分析物的回收率均逐漸增加,當吸附劑的填充量達到60 mg以后,回收率基本保持不變。因而本實驗選擇60 mg作為最佳吸附劑填充量。

2.3.2洗脫劑種類

不同的洗脫劑對目標分析物的洗脫能力有差別,為了獲得最佳的洗脫效果,本實驗對乙腈、丙酮和甲醇3種洗脫劑進行了考察,結(jié)果如圖1b所示。從圖中可以看出，乙腈作為洗脫劑時,3種青霉素的回收率最高,說明乙腈對目標物的洗脫能力最強,因而本實驗選用乙腈作為最佳洗脫劑。

2.3.3洗脫劑用量

洗脫劑的用量對目標物的洗脫程度有直接影響,因此本實驗對洗脫劑的用量進行了考察。分別考察了2、4、6、8和10 mL乙腈對3種青霉素的洗脫效果,結(jié)果如圖1c所示。隨著洗脫劑用量的增加,青霉素的回收率也隨之升高,當洗脫劑的用量增加至6 mL時,3種青霉素回收率達到最大;繼續(xù)增加洗脫劑的用量,回收率明顯降低,這可能是由于氮吹時間長引起較大損失所致。因此本實驗選用6 mL乙腈作為最佳洗脫劑用量。

2.3.4上樣速率

為了在相對較短的時間內(nèi)獲得較高的萃取效率,本實驗考察了上樣速率對3種青霉素萃取效率的影響,結(jié)果如圖1d所示。將樣品溶液分別以1、2、3、5和6 mL/min的上樣速率通過自制SPE小柱,在上樣速率為3 mL/min時,3種青霉素回收率達到最大;繼續(xù)增大上樣速率,青霉素與萃取填料的接觸時間變短,萃取效率有所下降。因此,本實驗選用3 mL/min的速率上樣。

2.3.5吸附材料的重復(fù)利用性

吸附劑能否重復(fù)多次利用是衡量吸附劑性能的一個重要因素。為了降低成本且保證實驗的準確性,期望吸附劑能夠重復(fù)多次利用。在本實驗中考察了吸附劑重復(fù)使用次數(shù)對回收率的影響,結(jié)果如圖1e所示。自制SPE小柱經(jīng)洗滌且重復(fù)使用5次后,發(fā)現(xiàn)其對目標物仍具有較高的回收率,說明該材料具有較好的重復(fù)利用性?？紤]到實驗樣品基質(zhì)的復(fù)雜性以及實驗的準確性,在實驗過程中每個小柱重復(fù)使用2次。

表 3 3種青霉素的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和檢出限

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1標準曲線及相關(guān)系數(shù)

取1.2節(jié)中的混合標準工作溶液進行二級質(zhì)譜掃描，獲得碎片離子信息,分別以3種青霉素的響應(yīng)值為縱坐標,標準溶液質(zhì)量濃度為橫坐標,繪制標準曲線,計算出3種青霉素的檢出限(LOD)為0.05～0.10 μg/kg(S/N=3),定量限(LOQ)為0.1～0.4 μg/kg(S/N=10)。從表3可以看出,3種青霉素在各自的線性范圍內(nèi)表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.999。

2.4.2回收率和精密度

取均質(zhì)后的空白牛奶試樣,分別加入低、中、高3個不同水平的3種青霉素標準溶液進行加標回收試驗,每個加標水平做5次平行試驗,得到平均回收率及相對標準偏差,結(jié)果見表4。3種目標物的平均加標回收率為84.9%～94.1%,相對標準偏差(RSD,n=5)為1.66%～3.27%。結(jié)果表明,本方法加標回收率較高,精密度良好,可以滿足牛奶樣品中青霉素殘留量的檢測需求。

表 4 牛奶中3種青霉素的加標回收率和相對標準偏差(n=5)

2.5 方法比對

為了考察本方法的有效性,將其與參考文獻和國標GB/T 21315-2007、GB/T 22975-2008進行了比較,結(jié)果見表5。通過對方法的前處理技術(shù)、檢測手段、檢出限和平均回收率比較顯示,本方法具有較低的檢出限和較好的回收率。

表 5 本方法與相關(guān)文獻中的方法比較

圖 2 3種青霉素在標準溶液和加標牛奶樣品的色譜圖Fig. 2 Chromatograms of the three penicillins in standard solution and spiked milk sample

2.6 牛奶樣品中3種青霉素的測定

利用本文所建方法對40批次牛奶樣品中的青霉素殘留量進行測定,均未檢出青霉素。但是從圖2中可以看出,對于加標樣品,該方法可以很好地實現(xiàn)青霉素的基線分離,且基本無干擾峰,分析時間較短,只需5 min即可完成一次分析。說明本方法在實際樣品檢測中可以得到較好的分離分析結(jié)果。

3 結(jié)論

本文基于自制的CTFs固相萃取吸附劑,對CTFs吸附劑萃取效果進行了考察優(yōu)化,并獲得了最佳條件,建立了同時檢測牛奶中3種青霉素類殘留量的SPE-UPLC-MS/MS檢測方法。所建方法精密度較高,重復(fù)性較好,分離度高,實現(xiàn)了對3種青霉素的高效富集,并成功用于牛奶中青霉素類殘留量的檢測。