陳明明, 蘇畢航, 黃建立, 付鳳富, 董永強(qiáng)*

(1. 福州大學(xué)化學(xué)學(xué)院, 食品安全與生物分析教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福建省食品安全分析與檢測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 福州 350108; 2. 福建省糧油質(zhì)量監(jiān)測(cè)所, 福建 福州 350108)

真菌毒素是真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物。糧食在生產(chǎn)和儲(chǔ)藏過(guò)程中都極易受到不同種類真菌的污染,從而產(chǎn)生真菌毒素。真菌毒素既可引起急性中毒,也可由于長(zhǎng)期低劑量攝入引起慢性中毒。有些真菌毒素甚至還具有致突變性、致癌性、致畸性以及對(duì)特定系統(tǒng)與器官的毒性,如神經(jīng)系統(tǒng)毒性、生殖系統(tǒng)毒性、腎毒性、出血性毒性、肝毒性和免疫抑制毒性[1,2]。而且大部分真菌毒素具有很強(qiáng)的熱穩(wěn)定性,即使在食物煮熟后,其中所含有的真菌毒素仍穩(wěn)定存在。因此,真菌毒素已經(jīng)成為國(guó)際關(guān)注的食品安全熱點(diǎn)問(wèn)題之一。

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON)是一種單端孢霉烯族毒素,主要由禾谷鐮刀菌和粉紅鐮刀菌產(chǎn)生。在全世界范圍內(nèi),DON是最常見(jiàn)的一種污染糧食、飼料和食品的霉菌毒素之一。在中國(guó),每年超過(guò)700萬(wàn)公頃的小麥?zhǔn)茜牭毒^枯病影響,從而導(dǎo)致大量小麥?zhǔn)艿紻ON毒素的污染。食用被DON污染的小麥籽粒及其制品的動(dòng)物和人類會(huì)出現(xiàn)急性中毒癥狀,如厭食、嘔吐、腹瀉、發(fā)燒和造血系統(tǒng)受損,甚至死亡[3]。因此世界各國(guó)對(duì)糧食和飼料中的DON都有非常嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)。我國(guó)規(guī)定大麥、小麥、燕麥、青稞、玉米原糧谷物中DON限量為2 000 μg/kg。目前關(guān)于糧食中DON的檢測(cè)方法以儀器分析法為主,包括液相色譜法(LC)、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)和液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)等[4,5]。除儀器分析方法外,酶聯(lián)免疫分析法、生物傳感器等也可用于真菌毒素的分析[6-8]。這些方法往往都具有很好的靈敏度,可完美地實(shí)現(xiàn)對(duì)真菌毒素的定量檢測(cè)。然而,這些方法又都存在著一定的局限性,比如儀器分析方法存在設(shè)備昂貴、對(duì)操作者的技術(shù)要求高,且容易受到雜質(zhì)干擾等缺點(diǎn);免疫法容易出現(xiàn)假陰性和假陽(yáng)性問(wèn)題,而且穩(wěn)定性也通常較差;生物傳感技術(shù)經(jīng)常出現(xiàn)交叉反應(yīng)、重現(xiàn)性低等問(wèn)題。另外,這些方法普遍存在著耗時(shí)、過(guò)程復(fù)雜等操作層面上的問(wèn)題。探索一種更為簡(jiǎn)單、迅速、靈敏的用于DON檢測(cè)的傳感技術(shù)對(duì)于農(nóng)業(yè)與食品業(yè)發(fā)展而言具有非常重要的意義。

表面增強(qiáng)拉曼散射(surface-enhanced Raman scattering, SERS)是近年來(lái)迅速發(fā)展起來(lái)的一種光譜分析技術(shù)[9],具有高靈敏度、高通量、響應(yīng)快速等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。因此在表面科學(xué)[10,11]、材料科學(xué)[12]、生物醫(yī)學(xué)[13,14]、藥物分析[15-17]、食品安全[18-20]、環(huán)境檢測(cè)[21]等領(lǐng)域顯示出巨大的應(yīng)用潛力。目前已經(jīng)有人嘗試?yán)肧ERS技術(shù)對(duì)食品中的DON進(jìn)行快速檢測(cè),但從其結(jié)果來(lái)看,仍然存在靈敏度差、重現(xiàn)性不好、抗干擾能力弱等問(wèn)題,因此不能廣泛應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)[22-24]。這主要是由其SERS基底自身問(wèn)題所決定的。眾所周知,SERS測(cè)試需要將被測(cè)分子吸附在一些特殊材料(即所謂的基底材料)的表面。在電磁增強(qiáng)(EM)和/或化學(xué)增強(qiáng)(CM)的作用下,被測(cè)分子的拉曼信號(hào)大大增強(qiáng)。因此,SERS測(cè)試的結(jié)果在很大程度上取決于基底的性質(zhì)。然而,目前報(bào)道的SERS基底中很少能同時(shí)兼顧高靈敏度、良好的均勻性和良好的穩(wěn)定性。近年來(lái),有人提出將SERS活性材料與水凝膠結(jié)合,有望獲得具有良好均勻性和穩(wěn)定性的SERS基底[25]。受此啟發(fā),我們制備了具有高SERS活性的聚集態(tài)碳點(diǎn)包裹銀納米顆粒(a-AgNPs/CDs)和聚集態(tài)金納米顆粒,并將其嵌入水凝膠中,制備水凝膠SERS芯片[26]。所獲得的SERS芯片具有靈敏度高、穩(wěn)定期長(zhǎng)、均勻性好、抗干擾性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。這一結(jié)果將大大促進(jìn)SERS技術(shù)在定量分析中的應(yīng)用。本工作利用本實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)的a-AgNPs/CDs-水凝膠SERS芯片,構(gòu)建糧食中DON快速檢測(cè)的SERS傳感方法,并應(yīng)用于實(shí)際樣品。該方法具有靈敏度高、線性范圍寬、重復(fù)性和回收率好、抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

高分辨透射電子顯微鏡(HRTEM, 2100, JEOL,日本);場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡(FE-SEM, 6700F, JSE,日本);紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-Vis, Lambda 750, PerkinElmer,美國(guó));便攜式拉曼光譜儀(i-Raman, BWS465-532H, BW&TEK,美國(guó))。

硝酸銀(AgNO3,純度99.0%)、聚乙烯醇(PVA, [C2H4O]n,聚合度1 799,純度98.0%～99.0%)購(gòu)于上海阿拉丁生化科技有限公司;葡萄糖(C6H12O6,分析純)和結(jié)晶紫(crystal violet, CV,分析純)購(gòu)于上海麥克林公司;氫氧化鈉(NaOH,純度96.0%)購(gòu)于宜昌西隆化工有限公司;去離子水由Milli-Q純水系統(tǒng)獲得,并用于制備所有儲(chǔ)備液和工作溶液。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1a-AgNPs/CDs的合成

具有高SERS活性的a-AgNPs/CDs是以單層碳基點(diǎn)(carbon-based dots, CDs)為包裹劑[27],采用一鍋?zhàn)越M裝方法合成的[28]。將1.2 mL CD溶液(5 mg/mL)和0.6 mL AgNO3溶液(1 mol/L)分散到50 mL去離子水中,隨后用NaOH(0.1 mol/L)溶液調(diào)節(jié)其pH到9。在120 ℃油浴鍋中回流15 min后加入0.6 mL的葡萄糖溶液(90 mg/mL),反應(yīng)20 min之后停止加熱,在攪拌下將溶液自然冷卻到室溫。隨后,將冷卻后的混合物用去離子水離心洗滌3次(12 000 r/min,每次10 min)。最后,將得到的沉淀物(a-AgNPs/CDs)重新分散在10 mL去離子水中,并儲(chǔ)存在4 ℃以備進(jìn)一步使用。

1.2.2水凝膠SERS芯片的合成

水凝膠SERS芯片的制備方法按照本實(shí)驗(yàn)室最近發(fā)表的一項(xiàng)研究工作[26]進(jìn)行。將1.4 g PVA和9.6 mL去離子水混合并在90 ℃下攪拌1.5 h,直到PVA完全溶解。將PVA溶液冷卻到室溫后加入1 mL a-AgNPs/CDs溶液(3 mg/mL),接著攪拌30 min。最后,將混合物轉(zhuǎn)移到一個(gè)厚度為1 mm的玻璃模具中,通過(guò)在-24 ℃和室溫下循環(huán)冷凍-解凍5次得到水凝膠SERS芯片。

1.2.3標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備和SERS測(cè)量

用水-乙醇(1∶1, v/v)作為溶劑配制一系列的DON標(biāo)準(zhǔn)溶液(10 000、1 000、100、50、10、5和1 μg/kg)。SERS檢測(cè)前將0.5 mm×0.5 mm的水凝膠SERS芯片浸泡于50 μL的DON標(biāo)準(zhǔn)溶液中一段時(shí)間,然后取出,并在每個(gè)芯片上隨機(jī)選取10個(gè)點(diǎn)進(jìn)行測(cè)量。

1.2.4樣品前處理

稱取2 g加標(biāo)的小麥粉樣品于離心管中,加入10 mL水-乙醇(1∶1, v/v),渦旋混勻。于室溫下超聲提取10 min后以12 000 r/min離心10 min,收集上清液并轉(zhuǎn)移到另一個(gè)干凈的離心管中,向殘?jiān)性偌尤?0 mL乙醇-水(1∶1, v/v)重復(fù)提取一次,合并上清液,得到小麥標(biāo)準(zhǔn)提取液。

1.2.5拉曼條件

便攜式拉曼光譜儀拉曼激光為532 nm(BWS465-532H);激光功率為5 mW;單次積分時(shí)間為30 s;浸泡后的水凝膠SERS芯片表面無(wú)需沖洗,直接用于室溫下的拉曼檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 材料的表征

通過(guò)TEM和FE-SEM表征a-AgNPs/CDs的形貌(見(jiàn)圖1a和b)。所制備的AgNPs/CDs納米顆粒粒徑分布均勻,直徑約為20 nm。a-AgNPs/CDs主要是由幾十個(gè)AgNPs/CDs在二維方向上組成的聚集體。每個(gè)聚集體中相鄰粒子之間的間隙在2 nm以下,因此,a-AgNPs/CDs具有豐富的電磁場(chǎng)“熱點(diǎn)”。通過(guò)UV-Vis表征(見(jiàn)圖1c)發(fā)現(xiàn)a-AgNPs/CDs呈現(xiàn)出兩個(gè)特征的局域表面等離子體共振(localized surface plasmon resonance, LSPR)吸收峰,一個(gè)在395 nm,另一個(gè)在605 nm。

圖 1 a-AgNPs/CDs的(a)透射電鏡圖、(b)掃描電鏡圖以及(c)紫外-可見(jiàn)吸收光譜Fig. 1 (a) TEM, (b) SEM images and (c) UV-visible absorption spectrum of a-AgNPs/CDsa-AgNPs/CDs

2.2 水凝膠SERS芯片基底的全面評(píng)估

圖2a展示了實(shí)驗(yàn)所得的水凝膠SERS芯片。實(shí)驗(yàn)中以CV作為探針?lè)肿訉?duì)所得水凝膠SERS芯片的性能進(jìn)行評(píng)估。如圖2b所示,CV的SERS強(qiáng)度隨其濃度的增加而逐漸增加,并且在10-12～10-16mol/L的范圍內(nèi),濃度的對(duì)數(shù)與其特征信號(hào)強(qiáng)度(1 623 cm-1)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,其線性方程為Y=11 077 logCCV+181 041,相關(guān)系數(shù)(R2)為0.998 6。另外,所得水凝膠SERS芯片還具有非常良好的均一性。在芯片上40×40 μm2的范圍內(nèi)隨機(jī)采集100個(gè)位點(diǎn)上的SERS光譜,可以清楚地發(fā)現(xiàn)所得的100條SERS光譜沒(méi)有明顯的差異(圖2c)。光譜中1 623 cm-1處峰強(qiáng)度構(gòu)建的成像很均勻,沒(méi)有明顯的波動(dòng)(圖2d),據(jù)此計(jì)算得到的RSD為1.5%,遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于大多數(shù)已報(bào)道的SERS基底。這些結(jié)果表明,所得水凝膠SERS芯片具有出色的靈敏度、均一性,因此可用于后續(xù)SERS檢測(cè)。

圖 2 (a)水凝膠SERS芯片在可見(jiàn)光下的照片, (b)水凝膠SERS芯片對(duì)不同濃度CV的SERS響應(yīng), (c)從水凝膠SERS芯片上采集100個(gè)CV(10-13mol/L)的SERS光譜, (d)100條收集到的SERS光譜中CV在1623 cm-1處的SERS信號(hào)的拉曼映射圖Fig. 2 (a) Photograph of the hydrogel SERS chip, (b) SERS response of the hydrogel chip toward different concentrations of crystal violet (CV), (c) SERS spectra of 1×10-13mol/L CV collected from 100 points on the hydrogel chip, (d) Raman mapping image targeting the CV SERS signal at 1623 cm-1 from the 100 collected SERS spectra points The inset in (b) shows the linear relationship between the peak intensity at 1623 cm-1 and the logarithmic concentration of CV.

圖 3 (a)不同溶劑和(b)不同水-乙醇體積比對(duì)水凝膠SERS芯片所得DON(10000 μg/kg)拉曼光譜的影響Fig. 3 Effects of (a) different solvents and (b) different water-ethanol volume ratios on the Raman spectra of the resulting deoxynivalenol (DON) (10000 μg/kg) obtained by hydrogel SERS chip The SERS chip was soaked in the respective solvents at 40 ℃ for 4 min.

2.3 溶劑對(duì)水凝膠SERS芯片檢測(cè)DON的影響

DON是一種無(wú)色針狀固體,可溶于水和極性溶劑,如含水甲醇、含水乙醇或含水乙酸乙酯。本文比較了3種不同極性的溶劑水-甲醇(1∶1, v/v)、水-乙醇(1∶1, v/v)、水-乙酸乙酯(1∶1, v/v)對(duì)水凝膠SERS芯片檢測(cè)DON的影響。如圖3a所示,結(jié)果顯示當(dāng)溶劑為水-乙醇(1∶1, v/v)時(shí),DON的SERS信號(hào)最強(qiáng)。隨后比較了不同體積比(3∶1、1∶1和1∶3)的水-乙醇對(duì)水凝膠SERS芯片檢測(cè)DON的影響。實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化如圖3b所示,當(dāng)溶劑水-乙醇體積比為1∶1時(shí),水凝膠SERS芯片檢測(cè)DON得到了最大的增強(qiáng)。所以,以水-乙醇(1∶1, v/v)為最終實(shí)驗(yàn)條件用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。

2.4 浸泡溫度及浸泡時(shí)間對(duì)水凝膠SERS芯片檢測(cè)DON的影響

眾所周知,通過(guò)SERS技術(shù)檢測(cè)實(shí)際樣品中的小分子時(shí),樣品基質(zhì)中各種大分子(如多肽、蛋白質(zhì)、多糖、寡核苷酸等)和油脂都具有很強(qiáng)的干擾作用。水凝膠具有有限大小的多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),允許流體動(dòng)力學(xué)直徑小于孔隙大小的分子進(jìn)入[25]。因此,水凝膠SERS芯片可具有出色的抗干擾能力。然而,待測(cè)小分子進(jìn)入水凝膠的核心需要一段時(shí)間,這取決于分子擴(kuò)散的速度。因此,在利用水凝膠SERS芯片對(duì)DON進(jìn)行檢測(cè)前需對(duì)浸泡溫度和浸泡時(shí)間做相應(yīng)的考察優(yōu)化。

圖 4 (a)水凝膠SERS芯片在DON溶液(10000 μg/kg)中浸泡溫度對(duì)所得拉曼光譜的影響及(b)浸泡溫度對(duì)DON在1380 cm-1處峰強(qiáng)度的影響(n=5) Fig. 4 Effects of (a) hydrogel SERS chip soaking temperature in the DON solution (10000 μg/kg) on the resulting SERS spectra, and (b) soaking temperature on the peak intensity of DON at 1380 cm-1 (n=5) Soaking time: 4 min.

圖 5 (a)不同浸泡時(shí)間下DON(10000 μg/kg)在水凝膠SERS芯片上的SERS光譜圖和(b)浸泡時(shí)間對(duì)DON在1380 cm-1處峰強(qiáng)度的影響(n=5) Fig. 5 (a) SERS spectra for DON (10000 μg/kg) on the hydrogel SERS chip under different soaking time, and (b) effect of soaking time on the peak intensity of DON at 1380 cm-1 (n=5)

如圖4a所示,不同浸泡溫度下,DON的SERS光譜幾乎沒(méi)有區(qū)別,但是信號(hào)強(qiáng)度上卻有明顯的變化。如圖4b所示,在較低溫度下(40 ℃以下),小分子的擴(kuò)散速度隨著溫度升高而變快,在40 ℃時(shí)DON的SERS信號(hào)達(dá)到最大值。在較高溫度時(shí)(40 ℃以上),雖然小分子的擴(kuò)散速度也會(huì)進(jìn)一步加快,但是高溫一定程度上破壞了水凝膠的三維結(jié)構(gòu),DON的SERS信號(hào)反而隨著溫度的升高而有所下降。因此,選擇最佳浸泡溫度為40 ℃。如圖5a所示,在其他實(shí)驗(yàn)條件保持不變的情況下,延長(zhǎng)水凝膠SERS芯片在DON溶液中的浸泡時(shí)間也可以明顯地提高其SERS信號(hào)。從圖5b可以看出,DON在1 380 cm-1處的特征信號(hào)強(qiáng)度在3 min之內(nèi)隨浸泡時(shí)間增加而迅速增加,隨后增加速度逐漸變緩。當(dāng)浸泡時(shí)間超過(guò)5 min時(shí),其信號(hào)強(qiáng)度逐漸趨于穩(wěn)定。因此,選擇最佳浸泡時(shí)間為5 min。

2.5 線性范圍、檢出限以及定量限

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,利用所得水凝膠SERS芯片在最優(yōu)條件下對(duì)不同含量的DON進(jìn)行SERS檢測(cè)。圖6a展示了不同含量DON在所用水凝膠SERS基底上的SERS光譜。從圖中可以看出即使DON的含量低至1 μg/kg,其SERS光譜中的主要特征峰仍可清楚分辨。當(dāng)DON的含量從1 μg/kg逐漸增加到10 000 μg/kg,其SERS光譜的形狀沒(méi)有發(fā)生明顯的變化,主要特征峰的拉曼位移也沒(méi)有發(fā)生變化。然而,所有特征峰的強(qiáng)度都隨著DON含量的提高而明顯增強(qiáng)。如圖6b所示,DON在1 380 cm-1處的SERS強(qiáng)度(Y)與DON的含量(C, μg/kg)的對(duì)數(shù)成正比,其線性方程為Y=5 789 logC+1 043,R2為0.996 7。

圖 6 (a)不同含量DON在水凝膠SERS芯片上的SERS光譜圖和(b)DON在1380 cm-1處的特征峰強(qiáng)度與其含量對(duì)數(shù)的關(guān)系曲線 Fig. 6 (a)SERS spectra for different contents of DON on the hydrogel SERS chip, and (b) corresponding SERS intensity at 1380 cm-1 as a function of the logarithmic DON content

根據(jù)SERS光譜的特征峰計(jì)算檢出限(LOD)和定量限(LOQ),見(jiàn)公式(1)和(2)。

(1)

(2)

其中Sk為空白樣本光譜強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)差,K為擬合關(guān)系曲線的斜率。得到的結(jié)果分別為L(zhǎng)OD 0.14 μg/kg和LOQ 0.47 μg/kg。將該方法與已有報(bào)道的DON的SERS檢測(cè)方法進(jìn)行比較(見(jiàn)表1),該方法具有更寬的線性范圍和更低的檢出限,說(shuō)明該方法具有一定的優(yōu)越性。

表 1 本研究方法與其他已報(bào)道SERS方法的比較

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

為了進(jìn)一步考察所構(gòu)建的SERS檢測(cè)方法的實(shí)用性,我們將其應(yīng)用于小麥粉中DON的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,小麥粉提取液中未檢測(cè)到DON的SERS信號(hào),說(shuō)明小麥粉樣品中DON的含量低于該方法的檢出限。因此,實(shí)驗(yàn)采用空白樣品加標(biāo)的方式對(duì)小麥粉中DON的回收率進(jìn)行考察。分別于小麥粉中加入低、中、高3個(gè)水平的DON,再按照1.2.4節(jié)中所述的方法將其提取出來(lái)。用所得的水凝膠SERS芯片對(duì)提取液平行測(cè)定3次,并根據(jù)建立的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線計(jì)算平均回收率。由于水凝膠SERS芯片具有特殊的孔徑結(jié)構(gòu),在復(fù)雜樣品基質(zhì)檢測(cè)中可以隔絕大分子(糖、色素、油脂、蛋白質(zhì)等),加之SERS是一種可以檢測(cè)和鑒別分子、可反映結(jié)構(gòu)信息的光譜技術(shù),因此水凝膠SERS芯片可以在高靈敏度下仍然保持高選擇性。結(jié)果見(jiàn)表2, DON在小麥粉中的平均回收率為97.3%～103%,符合方法驗(yàn)證規(guī)范要求的85%～115%。RSD為4.2%～5.0%,同樣符合方法驗(yàn)證規(guī)范≤10%的要求。

表 2 小麥粉中DON的加標(biāo)回收率(n=3)

3 結(jié)論

本文利用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的水凝膠SERS芯片以及便攜式拉曼光譜儀建立了一種快速篩查和檢測(cè)DON的SERS方法。該方法具有響應(yīng)范圍寬、靈敏度高、重復(fù)性好、響應(yīng)迅速、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),在糧食中生物毒素的快速篩查與檢測(cè)方面具有良好的應(yīng)用潛力。