姜丁文，劉暢

(錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，遼寧 錦州 121000)

衰老是一種生物學過程，會導致細胞、組織或器官的生理結(jié)構(gòu)和功能的逐漸惡化。研究發(fā)現(xiàn)心血管疾病在衰老人群發(fā)病率較高[1]，衰老會導致心臟功能障礙、心肌收縮力下降、心肌組織纖維化、涉及炎癥反應、氧化應激等諸多病理表現(xiàn)[2]。線粒體是細胞的動力，是在融合和分裂狀態(tài)之間循環(huán)的動態(tài)細胞器。有研究認為線粒體功能障礙是衰老理論的核心，衰老與線粒體功能下降和線粒體ATP合成減少有關[3]。AMPK是真核細胞中的一種能量受體，可提高適應內(nèi)外環(huán)境變化的能力，從而維持細胞和全身的穩(wěn)定性[4]。衰老會影響心肌組織的AMPK的表達，而AMPK信號通路的激活可顯著減輕老年心臟的心肌損傷[5]。運動能夠激活AMPK的表達，延緩與年齡相關的線粒體生物功能的下降[6]。但是由于體能的下降，許多老年人無法進行主動的體育運動，而且不適當?shù)捏w力活動，會增加易感人群心源性猝死和急性心肌梗死的風險[7]。全身振動運動是利用機械引起肌肉振動的新興鍛煉方法，可產(chǎn)生類似力量鍛煉的效果,特別適合老年人使用[8]。振動運動能否改善衰老心肌組織的線粒體功能，目前尚未見報道。因此本研究選取H9C2心肌細胞系，通過D-半乳糖誘導衰老模型，探討振動運動對衰老心肌細胞線粒體功能的影響及其作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

H9C2細胞購自欣潤生物，D-半乳糖購自Sigma 公司，AMPK抗體和p-AMPK 抗體購自Cell Signaling Technology，CPT1B抗體和GAPDH 抗體購自Protentech，PGC1-α抗體購自Affinity公司，熒光二抗購自Abcam，Marker蛋白購自sigma公司，細胞油紅O染色、β-半乳糖苷酶試劑盒和線粒體膜電位試劑盒購自碧云天生物技術公司，細胞振動儀為團隊自行研發(fā)，已獲國家專利(專利號：ZL.2016 1 0945337.9)

1.2 方法

1.2.1 細胞凍存

加入EDTA消化，放入37 ℃孵箱 2 min，加入同等體積的含胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，終止EDTA消化，將液體移入15 mL的離心管；1000 r/min離心5 min，棄去上清液；加入凍存液(胎牛血清∶DMSO=9∶1)重懸細胞，分裝入凍存管，凍存管口用酒精泡過的封口膜封口，并標記凍存細胞的名稱和凍存的時間；緩慢梯度凍存：將要凍存的細胞在4 ℃冰箱放置30 min，在-20 ℃冰箱放置30 min，最后放置于-80 ℃冰箱中保存。

1.2.2 細胞傳代

加入EDTA消化，放入37 ℃孵箱 2 min，加入同等體積的含胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，終止EDTA消化，將液體移入15 mL的離心管；1000 r/min離心5 min，棄去上清液；加入增殖培養(yǎng)基(高糖DMEM+10%胎牛血清+1%雙抗)重懸沉淀的細胞，置于培養(yǎng)皿或孔板中，搖勻后放于37 ℃孵箱。

1.2.3 細胞復蘇

將凍存的H9C2細胞從-80 ℃冰箱拿出來，置于37 ℃水浴，溶化后立刻移出水??；用移液槍將H9C2細胞移入培養(yǎng)皿，然后加入5 mL增殖培養(yǎng)基，“十”字搖勻，顯微鏡下觀察細胞后，放于37 ℃孵箱；24 h后更換增殖培養(yǎng)基，顯微鏡下觀察細胞的狀態(tài)。

1.2.4 分組

將細胞以1×105個/毫升的密度接種于培養(yǎng)皿，分為4組，分別為對照組(CO)、衰老組(AG，加入20 g/L的D-半乳糖，處理48 h)、衰老+振動組(AV，加入20 g/L的D-半乳糖，處理48 h，振動頻率8 Hz，振動時間20 min)、衰老+振動+AMPK抑制劑組(AV+C，Compound C 10 μM 預處理1 h)

1.2.5 β半乳糖苷酶染色

給予 20 g/L的D-半乳糖誘導48 h 后，然后加入β-半乳糖苷酶染色固定液15 min，配制并加入染色工作液，放 37 ℃恒溫箱中過夜，最后在顯微鏡下觀察拍照。

1.2.6 油紅O染色

將處理好的細胞拿出細胞間，移液槍吸掉培養(yǎng)基，固定20 min，加入60%異丙醇5 min，避光環(huán)境下油紅O染色液染色20 min，蘇木素染核1 min，再加入油紅O緩沖液1 min，吸掉緩沖液，加入三蒸水，顯微鏡下拍照。

1.2.7 免疫熒光染色

將處理結(jié)束后的H9C2細胞用4% PFA固定30 min，0.3% Triton，打孔破膜15 min，羊血清室溫封閉2 h，加一抗CPT1B(1∶500)，4 ℃過夜，加入熒光二抗(1∶1000)，室溫放置2 h，加入DAPI 15 min，熒光顯微鏡下拍照。

1.2.8 Western Blot

將培養(yǎng)皿置于冰上，吸掉培養(yǎng)液，加入1 mL PBS快速刮取培養(yǎng)皿底細胞，轉(zhuǎn)移至1.5 mL的EP管中，以2000 r/min的速度在4 ℃離心3 min，棄掉上清液。加入60～80 μL裂解液(RIPA∶PMSF=99∶1)吹打細胞，冰上靜置20 min，每隔10 min吹打細胞，離心(4 ℃，12 000 r/min)25 min，取上清，測定BCA，制成濃度為5 μg/μL的樣品，制膠后進行電泳、轉(zhuǎn)膜，5%的封閉液室溫封閉2 h，按照maker標記，進行裁膜。將裁好的膜分別加入AMPK、p-AMPK、CPT1B、PGC1-α和GAPDH(1∶1000)，4 ℃過夜；第二天把PVDF膜放入二抗(1∶10 000)中，室溫放置2 h后用顯影液顯影，用Image J軟件進行圖像分析蛋白條帶。

1.2.9 線粒體膜電位測定

按照說明書配制 JC-1 染色工作液，細胞培養(yǎng)液與JC-1染色工作液以1∶1的比例加入到細胞中，在細胞培養(yǎng)箱中孵育20 min，在此期間按照說明書配制JC-1染色緩沖液，孵育結(jié)束后，吸掉細胞培養(yǎng)液與染色工作液，用緩沖液洗滌細胞2次，然后加入細胞培養(yǎng)液，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié) 果

2.1 β-半乳糖苷酶染色

β-半乳糖苷酶染色結(jié)果顯示：加入D-半乳糖48 h后，顯微鏡下衰老細胞呈深藍色，衰老細胞數(shù)明顯增加，見圖1。

CO：對照組；AG：衰老組

2.2 振動運動減少衰老心肌細胞的脂質(zhì)沉積

2.2.1 振動運動后各組心肌細胞油紅O染色結(jié)果

細胞經(jīng)油紅O染色后，脂質(zhì)沉積部位呈現(xiàn)橘紅色，與CO組相比，AG組脂質(zhì)沉積明顯增加；與AG組相比，AV組脂質(zhì)沉積明顯減少，見圖2。

CO：對照組；AG：衰老組；AV：衰老+振動運動組

2.2.2 振動運動后各組心肌細胞CPT1B的Western Blot表達

Western Blot結(jié)果：與CO組相比，AG組H9C2細胞CPT1B表達降低(P<0.01)；與AG組相比，AV組H9C2細胞CPT1B表達增加(P<0.01)，見圖3。

CO：對照組；AG：衰老組；AV：衰老+振動運動組，*P<0.05，**P<0.01

2.2.3 振動運動后各組心肌細胞CPT1B的免疫熒光表達

免疫熒光染色結(jié)果：AG組CPT1B表達減少，給予振動刺激后，AV組CPT1B表達增加。表明振動運動減少衰老H9C2細胞的脂質(zhì)沉積，見圖4。2.3 振動運動改善衰老H9C2細胞的線粒體膜電位

CO：對照組；AG：衰老組；AV：衰老+振動運動組

免疫熒光結(jié)果顯示：與CO組相比，AG組紅色熒光強度變?nèi)?，綠色熒光強度增強，表明線粒體膜電位降低；與AG組相比，AV組紅色熒光強度增強，綠色熒光強度增加，表明線粒體膜電位增加，見圖5。

CO：對照組；AG：衰老組；AV：衰老+振動運動組

2.4 振動運動改善衰老H9C2細胞線粒體功能

Western Blot結(jié)果顯示：與CO組相比，AG組H9C2細胞PGC1-α表達降低(P<0.01)；與AG組相比，AV組H9C2細胞PGC1-α的表達增加(P<0.01)，見圖3。

2.5 振動運動通過AMPK途徑影響衰老H9C2細胞線粒體功能

2.5.1 振動運動后各組心肌細胞AMPK的Western Blot表達

Western Blot結(jié)果：與CO組相比，AG組H9C2細胞p-AMPK/AMPK降低(P<0.01)；與AG組相比，AV組H9C2細胞p-AMPK/AMPK升高(P<0.01)，見圖6。

CO：對照組；AG：衰老組；AV：衰老+振動運動組，*P<0.05，**P<0.01

2.5.2 給予AMPK抑制劑后各組心肌細胞CPT1B和PGC1-α的Western Blot表達

Western Blot結(jié)果：給予AMPK抑制劑Compound C后，衰老H9C2細胞CPT1B表達降低(P<0.01)、PGC1-α表達降低(P<0.05)，見圖7。

AG：衰老組；AV：衰老+振動運動組；AV+C：衰老+振動+AMPK抑制劑組，*P<0.05，**P<0.01

3 討 論

衰老被認為是導致心臟疾病發(fā)展的最重要的危險因素，隨著年齡的增長，心肌收縮功能顯著下降，老年人心臟疾病的發(fā)病率和死亡率逐漸增加[5]967-977。AMPK由3個亞基組成，包括催化α亞基、調(diào)節(jié)β亞基和γ亞基，AMPKα主要在心肌細胞中表達，運動觸發(fā)α1和α2亞型的激活，α1在高強度的劇烈運動中被激活，而α2在低強度運動中被激活[9]。研究發(fā)現(xiàn)衰老會抑制心肌組織AMPK的表達，主動運動可以激活AMPK[9]1825-1841，改善老年大鼠心臟功能[10]。本課題的研究發(fā)現(xiàn)通過D-半乳糖誘導的衰老H9C2心肌細胞AMPK的表達減少，而給予振動刺激后AMPK的表達增加，表明振動運動能夠激活心肌細胞AMPK的表達。

衰老心肌細胞脂質(zhì)沉積增加，本研究的油紅O染色結(jié)果顯示振動運動顯著減少脂質(zhì)沉積。肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1(carnitine palmitoy transferase 1，CPT1)作為脂肪酸氧化的關鍵限速酶，位于線粒體的外膜，代表脂肪酸β-氧化的起始和調(diào)節(jié)步驟[11]。磷酸化的AMPK會導致乙酰輔酶A羧化酶失活，從而降低后者對CPT1的抑制，提高CPT1的活性，從而增加心肌細胞脂肪酸的氧化，減少脂質(zhì)代謝產(chǎn)物的積累[12]。本實驗的結(jié)果顯示：衰老心肌細胞CPT1的表達減少，振動運動增加CPT1的表達，給予AMPK抑制劑后，CPT1表達減少。

線粒體膜中的多不飽和脂肪酸對維持線粒體膜的完整性以及線粒體的正常生物功能有著重要的作用。而當線粒體脂質(zhì)被氧化時，線粒體功能會發(fā)生障礙[13]。線粒體功能的關鍵介質(zhì)之一是PGC-1α，其表達和活性與多種年齡疾病有關。PGC-1α可以調(diào)節(jié)線粒體的合成和功能，調(diào)節(jié)脂肪組織的能量代謝[14]。文獻報道AMPK可直接激活PGC-1α并調(diào)節(jié)PGC-1α啟動子，PGC-1α通過協(xié)調(diào)負責線粒體脂肪氧化代謝的CPT1基因的活性，在調(diào)控線粒體生物發(fā)生中發(fā)揮重要作用[15]。我們發(fā)現(xiàn)振動運動后衰老心肌細胞PGC-1α表達增加，線粒體膜電位增加，給予AMPK抑制劑后PGC-1α表達減少，線粒體膜電位降低。

綜上所述，本研究利用D-半乳糖誘導H9C2細胞制備心肌細胞衰老模型，采用自行研究已經(jīng)獲得國家專利的細胞振動儀實施振動運動，從細胞水平證實了振動運動通過AMPK途徑改善衰老心肌細胞的線粒體功能，減少脂質(zhì)沉積，本研究為振動運動改善衰老心肌細胞線粒體功能提供了實驗依據(jù)。