張軼博，鐘悅，曾瑞霞

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)教研室，遼寧 錦州 121000；2.營口經(jīng)濟(jì)開發(fā)區(qū)中心醫(yī)院眼科，遼寧 營口115007；3.錦州醫(yī)科大學(xué)人體解剖學(xué)教研室，遼寧 錦州 121000)

腫瘤細(xì)胞致死性人α-乳清蛋白(HAmLET)是在人乳汁酪蛋白成份防止肺炎鏈球菌附著于呼吸道上皮細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)某些成份可以殺傷A549腫瘤細(xì)胞，繼而被證實為一種人α-乳清蛋白與油酸結(jié)合形成的脂蛋白復(fù)合物。在對不同細(xì)胞系的研究中發(fā)現(xiàn)HAmLET具有選擇性誘殺傷腫瘤細(xì)胞和癌變前細(xì)胞，而對成熟的分化細(xì)胞沒有顯著的毒性作用[1]。但是，HAmLET殺瘤的機(jī)制卻極其復(fù)雜，有多條途徑參與，如線粒體通透性增加、與細(xì)胞核內(nèi)的組蛋白和染色質(zhì)結(jié)合、抑制蛋白酶體活性、激活細(xì)胞自噬凋亡途徑等，但其選擇性作用腫瘤而對成熟細(xì)胞無毒性的分子機(jī)制仍不清楚[2-3]。上述研究均基于HAmLET對于腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制，HAmLET同樣可以引起未分化細(xì)胞的死亡，因此，針對未分化細(xì)胞或胚胎細(xì)胞的研究，可能揭示HAmLET選擇性殺傷細(xì)胞的機(jī)制。

小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(小鼠前脂肪細(xì)胞)3T3-L1細(xì)胞是一種未分化細(xì)胞，該細(xì)胞在快速分裂時呈前脂肪細(xì)胞狀態(tài)，在匯合和接觸性抑制后則進(jìn)入脂肪樣細(xì)胞，如果給予合適的條件可以分化為脂肪細(xì)胞。影響3T3-L1細(xì)胞分化的因素很多，CAAT/增強子結(jié)合蛋白α(CCAAT-enhancer-binding protein α，C/EBPα)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ)、脂肪酸結(jié)合蛋白4(fatty acid binding protein4，F(xiàn)ABP4)、葡萄糖、胰島素、生長激素、胰島素樣生長因子-I(insulin- llke growth factor-I，IGF-I)、脂肪酸等因子參與脂肪分化的調(diào)節(jié)[4]。目前，最經(jīng)典的脂肪誘導(dǎo)分化的方法是“三聯(lián)誘導(dǎo)法”，即胰島素、地塞米松和IBMX聯(lián)合應(yīng)用。但是，也有報道顯示油酸等脂肪酸可與胰島素聯(lián)用誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞的分化[5-6]。油酸是HAmLET的主要成份，那么HAmLET單獨作用前脂肪細(xì)胞時可能會引起細(xì)胞的成脂分化。因此，在研究HAmLET對未分化細(xì)胞的作用時，除了關(guān)注細(xì)胞的死亡情況，還要注意細(xì)胞的分化情況。

HAmLET對于腫瘤細(xì)胞有殺傷作用，而不影響正常細(xì)胞的功能。但是，HAmLET對于未分化細(xì)胞如胚胎細(xì)胞、淋巴細(xì)胞都有一定的殺傷作用。為了探討HAmLET對未分化細(xì)胞的作用，我們選擇了小鼠前脂肪細(xì)胞3T3-L1作為研究對象，觀察HAmLET短期和長期作用3T3-L1細(xì)胞的細(xì)胞死亡和分化情況，為HAmLET的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

3T3-L1細(xì)胞和U87MG細(xì)胞購于上海細(xì)胞庫；HAmLET由本實驗室保藏，制備方法見文獻(xiàn)[7]。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

用3T3-L1細(xì)胞的完全培養(yǎng)基(低糖DMEM培養(yǎng)基，10%新生牛血清，100 U/mL青/鏈霉素)或U87MG細(xì)胞的完全培養(yǎng)基(低糖DMEM培養(yǎng)基，10%胎牛血清，100 U/mL青/鏈霉素)進(jìn)行3T3-L1細(xì)胞和U87MG細(xì)胞的傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞活性實驗

取3T3-L1細(xì)胞或U87MG細(xì)胞2～5代細(xì)胞以1×105個/孔的濃度接種于96孔培養(yǎng)板中。培養(yǎng)第2天，更換完全培養(yǎng)基并加入不同濃度(0、50、100、200、500 μg/mL)的HAmLET，24 h后或作用1、2、3、5、7 d不同天數(shù)后進(jìn)行細(xì)胞活性檢測。直接在培養(yǎng)基中加入CCK-8檢測液(碧云天生物技術(shù)公司)，繼續(xù)培養(yǎng)1 h。1 h后取出培養(yǎng)板，在酶標(biāo)儀450 nm處測吸光度OD值。

1.2.3 3T3-L1細(xì)胞的誘導(dǎo)分化

(1)3T3-L1細(xì)胞用低糖DMEM培養(yǎng)基(含10%新生牛血清)培養(yǎng)于6孔板，每隔2 d換新鮮培養(yǎng)液1次，至細(xì)胞密度生長達(dá)98%以上；(2)棄細(xì)胞培養(yǎng)液，換成DEX(含10 μmoL)、IBMX(含0.5 mmoL)和insulin(含10 μg/mL)以及高糖DMEM培養(yǎng)基(含5%胎牛血清)開始誘導(dǎo)分化；(3)誘導(dǎo)培養(yǎng)2 d后，棄去誘導(dǎo)分化液，換成insulin(含10 μg/mL)及高糖DMEM培養(yǎng)基(含5%胎牛血清)或HAmLET；(4)繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)2 d后，棄去誘導(dǎo)分化液，換成不含任何誘導(dǎo)劑，僅含5%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每隔2 d換新鮮培養(yǎng)液1次；(5)12 d后細(xì)胞分化成為成熟的脂肪細(xì)胞，或細(xì)胞密度生長達(dá)98%以上，每隔2 d后顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，出現(xiàn)大量脂滴判斷細(xì)胞分化成熟，棄去培養(yǎng)基，用PBS液輕輕沖洗2遍。

在每孔加入1 mL 4%的多聚甲醛，在室溫下固定細(xì)胞20 min。將多聚甲醛用吸管吸凈，再次用PBS液沖洗2遍，每孔加入1 mL油紅O染色液，室溫下染色30 min。用吸管吸去多余的油紅O染色液，并用三蒸水仔細(xì)沖洗2遍，在顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4 3T3-L1細(xì)胞脂質(zhì)定量

油紅O染色染色后吸凈培養(yǎng)孔中的三蒸水，每孔加入2 mL異丙醇萃取脂肪細(xì)胞內(nèi)的油紅O染液，用吸管吹打至細(xì)胞內(nèi)的油紅O染料全部溶解于異丙醇中。室溫靜置30 min。每孔吸出200 μL異丙醇萃取液轉(zhuǎn)入96孔板中，在酶標(biāo)儀490 nm處測吸光度OD值。

1.2.5 Western Blot

將6孔板實驗后的細(xì)胞用胰酶消化后移入1.5 mL離心管中，以1000 rpm轉(zhuǎn)速離心5 min，棄上清液，置于冰上30 min，加入預(yù)冷的RIPA裂解液，在振蕩器上震蕩2 min，于冰上靜置10 min，上述實驗操作共3次。待細(xì)胞完全裂解后，在4 ℃條件下，以12 000 rpm轉(zhuǎn)速離心30 min，收集上清液，BCA法測定蛋白濃度。每個樣品取20 μg上樣至10%SDS-PAGE膠，電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。BSA置于室溫下封閉1 h，TBST漂洗3次，每次5 min。分別加入相應(yīng)的一抗溶液(PPARγ抗體1∶1000、β-actin抗體1∶1000)，置于4 ℃下恒溫孵育12 h。TBST漂洗5 min，漂洗3次。加入山羊抗兔二抗(1∶2000)溶液，置于4 ℃下恒溫孵育1 h，TBST 漂洗5 min，漂洗3次。ECL顯影曝光。采用Image J軟件進(jìn)行圖像處理，蛋白條帶分析以β-actin作為內(nèi)參對照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組數(shù)據(jù)間的比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HAmLET對3T3-L1細(xì)胞的殺傷作用

不同濃度的HAmLET分別作用3T3-L1細(xì)胞和U87MG腫瘤細(xì)胞24 h，細(xì)胞活性實驗結(jié)果顯示3T3-L1細(xì)胞的細(xì)胞活性在50、100、200、500 μg/mL HAmLET作用下都顯著高于U87MG細(xì)胞，而其細(xì)胞活性在100和200 μg/mL之間明顯降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖1。結(jié)果表明對于HAmLET的殺傷作用，未分化細(xì)胞3T3-L1細(xì)胞比腫瘤細(xì)胞U87MG細(xì)胞有較大的抵抗力，同時3T3-L1細(xì)胞活性在低濃度的HAmLET(100 μg/mL)和高濃度(200 μg/mL)之間顯著變化。

2.2 3T3-L1細(xì)胞HAmLET長期作用

分別用濃度100 μg/mL和200 μg/mL的HAmLET作用3T3-L1細(xì)胞7 d，在不同天數(shù)檢查其細(xì)胞活性結(jié)果顯示200 μg/mL組的細(xì)胞存活率在58.2%～66.9%之間，無顯著變化。100 μg/mL組的細(xì)胞活性從95.3%(1 d)～74.8%(3 d)～91.0%(7 d)，呈現(xiàn)“V”型現(xiàn)象，見圖2。

圖2 HAmLET作用3T3-L1細(xì)胞后的細(xì)胞活性

受到HAmLET的長期作用(7 d)后，在光鏡下可以觀察到少數(shù)3T3-L1細(xì)胞體積增大，變圓，胞質(zhì)內(nèi)可見脂滴，見圖3。結(jié)果表明在使用殺傷腫瘤細(xì)胞濃度的HAmLET長期作用3T3-L1細(xì)胞時，細(xì)胞會出現(xiàn)抵抗作用，甚至出現(xiàn)耐受。同時，細(xì)胞出現(xiàn)了脂滴的聚集，HAmLET可能引起了細(xì)胞的分化。

箭頭所指為細(xì)胞內(nèi)脂滴，標(biāo)尺為100 μm

2.3 HAmLET誘導(dǎo)3T3-L1細(xì)胞分化成脂

分別通過經(jīng)典三聯(lián)法和100 μg/mL HAmLET誘導(dǎo)3T3-L1細(xì)胞分化12 d后對3T3-L1細(xì)胞進(jìn)行油紅O染色，見圖4。與未誘導(dǎo)組相比，三聯(lián)法和HAmLET都能誘導(dǎo)細(xì)胞分化為成熟的脂肪細(xì)胞。異丙醇萃取染色后3組細(xì)胞內(nèi)的油紅O染液，結(jié)果顯示三聯(lián)法誘導(dǎo)組和HAmLET組相對脂質(zhì)含量都較未誘導(dǎo)組顯著增加，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，而兩者之間的脂質(zhì)含量比較差異較小，無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖5。

100 μg/mL HAmLET和三聯(lián)誘導(dǎo)試劑作用3T3-L1細(xì)胞12 d；DMEM為未誘導(dǎo)組，IBMX為三聯(lián)誘導(dǎo)組，100 μg/mL HAM為 HAmLET組

DMEM為未誘導(dǎo)組，IBMX為三聯(lián)誘導(dǎo)組，HAM為100 μg/mL HAmLET組，與未誘導(dǎo)組相比，**P<0.01

設(shè)置IBMX組OD值為100%。Western Blot檢測結(jié)果顯示與未誘導(dǎo)組相比，三聯(lián)法誘導(dǎo)組和HAmLET組細(xì)胞PPAR γ蛋白表達(dá)顯著增加，此差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。而三聯(lián)法誘導(dǎo)組和HAmLET組之間PPAR γ蛋白表達(dá)水平并無顯著差異，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖6。上述結(jié)果表明100 μg/mL HAmLET能夠誘導(dǎo)3T3-L1細(xì)胞分化成脂，而且其作用與經(jīng)典的三聯(lián)誘導(dǎo)試劑效果相當(dāng)。

誘導(dǎo)分化12 d后Western Blot檢測3組細(xì)胞PPARγ蛋白表達(dá)情況；DMEM為未誘導(dǎo)組，IBMX為三聯(lián)誘導(dǎo)組，HAM為100 μg/mL HAmLET組，與未誘導(dǎo)組相比，**P<0.01

3 討 論

HAmLET及其類似物抗腫瘤作用已得到廣泛認(rèn)識[8]，HAmLET具有腫瘤細(xì)胞毒性[9]，包括對化療藥物有抗性的癌細(xì)胞。而除血細(xì)胞、胚胎細(xì)胞和永生化非癌細(xì)胞對HAmLET的細(xì)胞毒作用是敏感的以外，大多數(shù)原代培養(yǎng)細(xì)胞顯示出對HAmLET樣化合物毒性的耐受。本研究顯示HAmLET對人腫瘤細(xì)胞U87G有明顯的殺傷作用，但是在同一濃度，小鼠前脂肪細(xì)胞3T3-L1有明顯的抵抗作用，而長時間作用更是產(chǎn)生了耐受。針對不同種類細(xì)胞，HAmLET所展現(xiàn)出細(xì)胞毒作用的不同可能與其對細(xì)胞上的作用靶點有關(guān)。HAmLET廣譜抗癌活性的另一個解釋是HAmLET的油酸對膜脂質(zhì)、膜蛋白脂質(zhì)堆積和信號傳導(dǎo)具有潛在作用，癌細(xì)胞的快速增殖需要細(xì)胞膜脂質(zhì)成分的參與，油酸的毒性作用促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的死亡。因此，HAmLET廣譜抗腫瘤作用即使其可以用于多種腫瘤的治療，但是由于對胚胎細(xì)胞、紅細(xì)胞等細(xì)胞的增殖作用也使其應(yīng)用受到了限制。

3T3-L1細(xì)胞是常用的脂肪細(xì)胞分化研究模型。在本研究中，我們使用的HAmLET可以誘導(dǎo)3T3-L1細(xì)胞形成成熟的脂肪細(xì)胞，而且誘導(dǎo)分化的水平與經(jīng)典的三聯(lián)法沒有顯著差異。引起脂肪分化的原因，可能是HAmLET的成份油酸發(fā)揮主要作用。我們的前期研究報道了油酸可以引起脂肪細(xì)胞的分化[10]。本研究中，HAmLET應(yīng)用可使3T3-L1細(xì)胞的脂肪分化，油酸在促進(jìn)分化作用中是必不可少的。同時，OA是HAmLET殺傷腫瘤的重要部分，甚至有人認(rèn)為HAmLET的細(xì)胞毒性作用來自于OA。惡性腫瘤細(xì)胞作為一種未分化的細(xì)胞，可能在脂肪細(xì)胞分化誘導(dǎo)條件下也可以去分化成為脂肪細(xì)胞。因此，HAmLET誘導(dǎo)3T3-L1細(xì)胞分化的機(jī)制可能也存在于腫瘤細(xì)胞中，這為研究HAmLET殺傷腫瘤的機(jī)制提供了一個新思路。

脂肪細(xì)胞的分化受多種因子調(diào)控，如抑制FABP4對油酸誘導(dǎo)的牛前體脂肪細(xì)胞分化有顯著影響[11]。PPARγ是脂肪細(xì)胞分化過程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，可激活一系列脂肪細(xì)胞表型基因的表達(dá)，從而調(diào)控前脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化的整個過程[12-13]。由于PPARγ在調(diào)控細(xì)胞分化和生長中發(fā)揮作用[14]，在腫瘤的研究中PPARγ是重要的抗腫瘤分子[15]，PPARγ的激動劑可以用于腫瘤的治療[16]。本研究中，HAmLET可以同時激活3T3-L1細(xì)胞中PPARγ的表達(dá)，并且比OA有更強的促進(jìn)作用，表明HAmLET誘導(dǎo)脂肪分化是通過激活關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PPARγ來實現(xiàn)的，對于其具體的活化機(jī)制需進(jìn)一步研究。由于PPARγ在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中有重要作用，因此它們的表達(dá)變化可對HAmLET的抗腫瘤作用起到提示作用。研究結(jié)果顯示HAmLET可促進(jìn)抗腫瘤作用的PPARγ表達(dá)升高，這種情況可能與其細(xì)胞所在分化時段有關(guān)，需要在今后的研究中關(guān)注。

本研究使用殺傷腫瘤細(xì)胞U87MG細(xì)胞濃度的HAmLET短期(24 h，7 d)和長期(12 d)作用3T3-L1前脂肪細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)3T3-L1細(xì)胞對HAmLET有一定的耐受作用，長期作用可以通過激活3T3-L1細(xì)胞中的PPARγ誘導(dǎo)細(xì)胞分化，但具體的誘導(dǎo)分化機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。通過建立HAmLET作用前脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化模型，可以為我們探究HAmLET對各種細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)及機(jī)制提供一種細(xì)胞模型，為HAmLET在臨床上的應(yīng)用提供實驗數(shù)據(jù)。