吳彬，孫溶勵(lì)，楊心妮，趙明洲，李玉強(qiáng)

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床生物樣本中心，遼寧 錦州 121000)

在人類疾病的研究中，生物樣本在由臨床向基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化的過(guò)程中發(fā)揮著不可替代的作用。隨著現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷更新與發(fā)展，在全球范圍內(nèi)越來(lái)越多的研究加大了研究對(duì)象的規(guī)模以及通量，而這些研究對(duì)生物樣本的數(shù)量以及質(zhì)量提出了更高的要求[1-2]。研究表明使用優(yōu)質(zhì)的生物樣本才能得到精準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，才能為之后的研究提供有價(jià)值的信息，而使用低質(zhì)量生物樣本的研究可能由于數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確，不能更好地反饋臨床疾病的治療，因此高質(zhì)量的生物樣本才是臨床疾病與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中的重要保障[3-4]。

隨著樣本存儲(chǔ)方式的多元化，傳統(tǒng)的石蠟包埋樣本在實(shí)驗(yàn)研究中的優(yōu)勢(shì)漸弱，其很難滿足日益增長(zhǎng)的高質(zhì)量腫瘤標(biāo)本的需求[5]。以往眾多研究采用的腫瘤標(biāo)本僅依據(jù)課題需要臨時(shí)收集，導(dǎo)致研究結(jié)果對(duì)比性差、時(shí)間跨度小、連貫性差，也造成許多有價(jià)值的腫瘤標(biāo)本及其相關(guān)數(shù)據(jù)的流失。生物樣本庫(kù)中存儲(chǔ)的腫瘤組織能彌補(bǔ)這方面的不足，開(kāi)始成為腫瘤基礎(chǔ)研究和臨床研究的重要標(biāo)本來(lái)源[6]。而長(zhǎng)時(shí)間低溫凍存腫瘤組織標(biāo)本是否影響其生物大分子活性與完整性，學(xué)術(shù)界一直存在爭(zhēng)議[7]。目前認(rèn)為低溫保存下組織樣本的生物大分子基本不會(huì)發(fā)生降解，可用于不同的實(shí)驗(yàn)研究，然而長(zhǎng)時(shí)間的低溫凍存可能會(huì)影響其穩(wěn)定性，帶來(lái)一定程度的降解。為闡明這一問(wèn)題，本研究選擇我院外科胃腸道腫瘤組織標(biāo)本庫(kù)內(nèi)凍存時(shí)間長(zhǎng)短不一的胃癌及結(jié)直腸癌標(biāo)本作為研究對(duì)象，對(duì)存儲(chǔ)組織樣本的DNA、RNA及蛋白質(zhì)的純度和完整性進(jìn)行分析，旨在了解長(zhǎng)期凍存對(duì)胃腸道腫瘤組織生物大分子的影響。

1 材料與方法

1.1 組織樣本

隨機(jī)選取2014年1月至2021年1月間錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床生物樣本中心采集、凍存的結(jié)直腸癌樣本及胃癌樣本的癌組織、癌旁組織及正常組織共96份。所有組織樣本的切取均由資深臨床外科醫(yī)生操作，組織樣本在離體后30 min內(nèi)完成采集，分裝到裝有RNA保存液的凍存管中，快速轉(zhuǎn)入液氮內(nèi)，然后放入-80 ℃冰箱中凍存。采集順序按正常組織(距腫瘤邊緣>5 cm)、癌旁組織(距腫瘤邊緣≤3 cm)、腫瘤組織分別進(jìn)行切取，癌旁組織、正常組織取相同部位的“黏膜組織”樣本，每份樣本大小約為0.5 cm3。所選取樣本的患者在術(shù)前均未接受過(guò)放化療。樣本編號(hào)與腫瘤部位、凍存時(shí)間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，見(jiàn)表1，其中用T代表腫瘤組織，P代表癌旁組織，N代表正常組織，S代表胃部，C代表結(jié)直腸。

表1 樣本編號(hào)與腫瘤部位、凍存時(shí)間的對(duì)應(yīng)關(guān)系

1.2 癌組織樣本腫瘤含量評(píng)估

本中心每一例患者的組織均會(huì)分裝成體積相等的3～5管進(jìn)行凍存，取出1管癌組織經(jīng)固定、水洗、浸蠟以及包埋后進(jìn)行組織切片，由資深的病理醫(yī)師閱片，評(píng)估該組織中腫瘤細(xì)胞含量。本研究所有癌組織中腫瘤細(xì)胞的含量均大于60%。

1.3 核酸提取及質(zhì)量控制

DNA采用Tissue DNA Kit(OMEGA，美國(guó))進(jìn)行提取。DNA純度A260/A280比值的測(cè)定采用分光光度計(jì)(Thermo，NanoDrop 2000，美國(guó))。DNA完整性通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳評(píng)估，組織樣本的上樣量為5 μL，電泳時(shí)間30 min，電泳條帶利用垂直電泳系統(tǒng)(ChemiDoc XRS，BIO-RAD，美國(guó))和凝膠成像系統(tǒng)觀察。RNA采用Tissue RNA Kit(OMEGA，美國(guó))進(jìn)行提取。RNA純度A260/A280比值的測(cè)定采用分光光度計(jì)(Thermo，NanoDrop 2000，美國(guó))。RNA完整性通過(guò)生物分析儀(Agilent 2100，美國(guó))測(cè)定RNA分子完整數(shù)(RNA integrity number，RIN)。

1.4 蛋白質(zhì)提取及質(zhì)量控制

采用M-PER哺乳動(dòng)物總蛋白提取試劑盒(Pierce，美國(guó))抽提組織中蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)濃度通過(guò)BCA法(碧云天)進(jìn)行測(cè)定?？捡R斯亮藍(lán)(SIGMA 公司，美國(guó))法測(cè)定蛋白質(zhì)分子完整性[8]。蛋白質(zhì)樣本經(jīng)聚丙烯凝膠電泳2 h后，將整塊凝膠置于固定液中固定1 h，再染色30 min，最后用脫色液反復(fù)多次對(duì)凝膠進(jìn)行脫色，直至肉眼可見(jiàn)清晰條帶。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0軟件對(duì)所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用單因素方差分析DNA的A260/A280比值、RNA 的A260/A280比值、RIN值以及蛋白質(zhì)濃度。采用卡方檢驗(yàn)分析DNA和蛋白質(zhì)的完整性。設(shè)定P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 DNA分子的純度及完整性

組織樣本DNA的完整性采用1%瓊脂糖凝膠電泳圖進(jìn)行分析，依據(jù)電泳條帶的清晰程度及拖尾情況對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量分級(jí)。A級(jí)：電泳條帶無(wú)拖尾情況，且清晰明亮；B級(jí)：條帶有一定的拖尾，清晰；C級(jí)：電泳無(wú)清晰條帶，泳道呈彌散帶狀，見(jiàn)圖1。選取的胃腸道腫瘤組織樣本提取DNA進(jìn)行的純度測(cè)定(A260/A280)及質(zhì)量分級(jí)結(jié)果見(jiàn)表2?？梢?jiàn)，A、B、C這3個(gè)質(zhì)量分級(jí)中癌組織、癌旁組織及正常組織的樣本數(shù)目比分別為(23∶7∶2)、(22∶10∶0)和(12∶17∶3)，正常組織與癌組織有顯著性差異(P=0.020)，正常組織與癌旁組織有顯著性差異(P=0.021)，癌組織與癌旁組織無(wú)顯著性差異(P=0.279)。胃癌與結(jié)直腸癌樣本中A、B、C級(jí)別的數(shù)量比為(30∶15∶3)vs(25∶21∶2)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，未見(jiàn)顯著性差異(P=0.437)。將存儲(chǔ)年限分為≤2年、3～5年和≥6年3個(gè)組，A260/A280值無(wú)顯著性差異(P>0.05)，且A、B、C質(zhì)量級(jí)別的數(shù)量比分別為(22∶13∶1)、(19∶15∶2)和(15∶7∶2)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均無(wú)顯著性差異(P>0.05)，見(jiàn)圖2。

表2 樣本DNA純度值及完整性分級(jí)

圖1 DNA完整性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)示圖

圖2 不同存儲(chǔ)年限組織樣本DNA A260/A280比較

2.2 RNA分子的純度及完整性

不同存儲(chǔ)年限的胃癌和結(jié)直腸癌樣本提取的RNA檢測(cè)A260/A280及RIN值見(jiàn)表3?？梢?jiàn)，胃腸道腫瘤在≤2年、3～5年和≥6年不同存儲(chǔ)時(shí)間的組織樣本RNA純度(A260/A280)均無(wú)顯著性差異(P>0.05)，見(jiàn)圖3。Agilent 2100生物分析儀采用1～10的編號(hào)系統(tǒng)，其中1表示RNA降解最為嚴(yán)重，10表示RNA最完整。通過(guò)對(duì)比樣本RIN值的差異，發(fā)現(xiàn)胃癌與結(jié)直腸癌組織樣本RNA完整性無(wú)顯著性差異(P>0.05)，見(jiàn)圖4。而存儲(chǔ)≥6年的樣本RNA完整性較存儲(chǔ)3～5年及≤2年均有顯著下降(P<0.05)，見(jiàn)圖5。提示組織樣本在冷凍保存6年以上時(shí)間后，RNA發(fā)生嚴(yán)重降解。

表3 樣本RNA A260/A280及RIN值

圖3 不同存儲(chǔ)年限組織樣本RNA A260/A280比較

圖4 胃癌與結(jié)直腸癌RIN值比較

圖5 不同存儲(chǔ)年限組織樣本RIN值比較

2.3 蛋白質(zhì)的濃度及完整性

檢測(cè)并記錄每個(gè)組織樣本蛋白質(zhì)的濃度(μg/μL)，發(fā)現(xiàn)不同存儲(chǔ)時(shí)間(≤2年、3～5年、≥6年)蛋白質(zhì)濃度無(wú)顯著性差異(P>0.05)，見(jiàn)圖6。采用考馬斯亮藍(lán)染色來(lái)檢測(cè)胃腸道腫瘤各組織樣本在低溫凍存不同時(shí)間后蛋白質(zhì)的完整性，見(jiàn)圖7。圖中可以看出，組織樣本存儲(chǔ)時(shí)間≤2年的蛋白質(zhì)條帶清晰且數(shù)目較多，存儲(chǔ)時(shí)間在3～5年的蛋白質(zhì)條帶數(shù)目相較于≤2年有所減少，而存儲(chǔ)時(shí)間≥6年的組織中提取的蛋白質(zhì)條帶模糊且肉眼可見(jiàn)少于3條。因此，根據(jù)電泳條帶的狀態(tài)將蛋白質(zhì)完整性進(jìn)行質(zhì)量分級(jí)：(1)A級(jí)，低分子量到高分子量的蛋白質(zhì)條帶均清晰可見(jiàn)；(2)B級(jí)，清晰條帶數(shù)目在5條以上；(3)C級(jí)，條帶模糊，條帶數(shù)目在5條以下。蛋白質(zhì)濃度及完整性分級(jí)見(jiàn)表4。胃癌與結(jié)直腸癌樣本中蛋白質(zhì)完整性A、B、C分級(jí)之比為(17∶27∶4)和(19∶23∶6)，兩者在蛋白質(zhì)完整性無(wú)顯著性差異(P>0.05)。癌組織、癌旁組織及正常組織的樣本數(shù)目比分別為(14∶15∶3)、(11∶17∶4)和(11∶18∶3)，三者無(wú)顯著性差異(P>0.05)。組織樣本存儲(chǔ)時(shí)間≤2年、3～5年和≥6年的蛋白質(zhì)完整性分級(jí)A、B、C級(jí)數(shù)目之比分別為(22∶14∶0)、(14∶20∶2)和(0∶16∶8)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組織樣本存儲(chǔ)時(shí)間≤2年與3～5年的蛋白質(zhì)完整性無(wú)顯著性差異(P>0.05)，而存儲(chǔ)時(shí)間≥6年與≤2年與3～5年有顯著性差異(P<0.05)，提示蛋白質(zhì)在低溫凍存超過(guò)6年時(shí)間后發(fā)生降解。

圖6 不同存儲(chǔ)年限蛋白質(zhì)濃度

圖7 不同存儲(chǔ)年限蛋白染色圖

表4 樣本蛋白質(zhì)濃度值及完整性分級(jí)

續(xù)表

3 討 論

生物樣本在長(zhǎng)時(shí)間低溫存儲(chǔ)后，定期檢測(cè)其質(zhì)量，驗(yàn)證是否發(fā)生質(zhì)量的改變已成為生物樣本庫(kù)工作的重中之重，因?yàn)楦哔|(zhì)量的腫瘤樣本是保障實(shí)驗(yàn)研究有效進(jìn)行的首要條件[9]。長(zhǎng)期低溫凍存的組織樣本提取的生物大分子是否能滿足基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和臨床研究的需求，國(guó)內(nèi)外的報(bào)道尚不多見(jiàn)。目前國(guó)際上對(duì)于不同存儲(chǔ)方式提取的生物大分子并沒(méi)有固定的衡量標(biāo)準(zhǔn)，能否有效地應(yīng)用于科學(xué)研究完全取決于該研究對(duì)生物大分子純度和完整性的要求。RIN值≥7被認(rèn)為是高質(zhì)量的RNA，可用于基因芯片等[10]，Aye Yüzbaolu[11]指出全基因組表達(dá)分析也需要RNA保持較高的完整性。而RIN值≥5表示RNA具有良好的完整性，可用于一般的分子生物學(xué)研究，如RT-PCR分析[12]。對(duì)于降解較嚴(yán)重的RNA樣本，需要進(jìn)一步研究是哪些因素導(dǎo)致降解，方便后續(xù)樣本的存儲(chǔ)及利用。

低溫凍存溫度、凍存時(shí)間等因素都能導(dǎo)致生物大分子質(zhì)量發(fā)生改變。在低于生物樣本正常生理溫度的環(huán)境下，細(xì)胞都會(huì)受到寒冷刺激，而這種刺激將直接影響細(xì)胞正常的生理代謝，進(jìn)而對(duì)生物大分子的質(zhì)量或表達(dá)產(chǎn)生影響，只是由于存儲(chǔ)溫度高低和時(shí)間長(zhǎng)短的不同，造成影響大小的差異性[13]。研究表明[14]，長(zhǎng)時(shí)間凍存于-80 ℃環(huán)境中的組織樣本能獲得高質(zhì)量的DNA，本文結(jié)果與文獻(xiàn)一致。但是由于RNA與蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定性，長(zhǎng)時(shí)間保存可能帶來(lái)不同程度的降解。凍存時(shí)間對(duì)RNA與蛋白質(zhì)的影響研究主要集中在完整性，普遍認(rèn)為保存較長(zhǎng)時(shí)間后會(huì)發(fā)生降解，胃腸、胰腺等產(chǎn)生消化酶較多的組織樣本RNA與蛋白質(zhì)降解較快，而有些腫瘤如乳腺癌等則可保存更長(zhǎng)時(shí)間，這和保存對(duì)象的組織自身特征有關(guān)[15]。低溫對(duì)蛋白質(zhì)的影響不僅體現(xiàn)在完整性上，在酶功能、二級(jí)結(jié)構(gòu)及表達(dá)量等方面也有一定影響。Rouy等[16]研究發(fā)現(xiàn)將樣本儲(chǔ)存在-80 ℃環(huán)境中，隨著時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)會(huì)逐步發(fā)生降解。Mazur等[17]認(rèn)為，暴露于高濃度溶液中的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)在低溫冷凍時(shí)發(fā)生了不可逆的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變。在受到酸、堿、重金屬鹽等作用下，蛋白質(zhì)發(fā)生的不可逆改變將失去原有的生理作用。Hubel等[18]的研究結(jié)果表明肺癌和乳腺癌細(xì)胞表面蛋白在凍存后的表達(dá)量出現(xiàn)下調(diào)。有研究指出[19-21]，低溫保護(hù)劑的加入能一定程度上延長(zhǎng)生物大分子的降解時(shí)間。目前，低溫凍存依然是維持組織樣本蛋白質(zhì)活性與完整性的主要手段，國(guó)際國(guó)內(nèi)對(duì)此研究還不足夠深入，因此在今后的研究與實(shí)踐中還需不斷探索條件，積累經(jīng)驗(yàn)，建立最優(yōu)的低溫保存方法以便更長(zhǎng)時(shí)間地維持蛋白質(zhì)活性與穩(wěn)定性。

對(duì)低溫存儲(chǔ)組織樣本生物大分子的質(zhì)量研究可為研究胃腸道腫瘤的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制以及個(gè)體化治療和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)提供寶貴的臨床樣本資源，不僅可以縮短科研工作周期，加快醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化及研究進(jìn)程，還可確?？蒲泄ぷ鞯恼_性和科學(xué)性，對(duì)促進(jìn)胃腸道腫瘤的發(fā)展具有十分重要的醫(yī)學(xué)意義。