吳彬，孫溶勵，楊心妮，趙明洲，李玉強

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床生物樣本中心，遼寧 錦州 121000)

在人類疾病的研究中，生物樣本在由臨床向基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化的過程中發(fā)揮著不可替代的作用。隨著現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷更新與發(fā)展，在全球范圍內(nèi)越來越多的研究加大了研究對象的規(guī)模以及通量，而這些研究對生物樣本的數(shù)量以及質(zhì)量提出了更高的要求[1-2]。研究表明使用優(yōu)質(zhì)的生物樣本才能得到精準(zhǔn)的實驗結(jié)果，才能為之后的研究提供有價值的信息，而使用低質(zhì)量生物樣本的研究可能由于數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確，不能更好地反饋臨床疾病的治療，因此高質(zhì)量的生物樣本才是臨床疾病與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中的重要保障[3-4]。

隨著樣本存儲方式的多元化，傳統(tǒng)的石蠟包埋樣本在實驗研究中的優(yōu)勢漸弱，其很難滿足日益增長的高質(zhì)量腫瘤標(biāo)本的需求[5]。以往眾多研究采用的腫瘤標(biāo)本僅依據(jù)課題需要臨時收集，導(dǎo)致研究結(jié)果對比性差、時間跨度小、連貫性差，也造成許多有價值的腫瘤標(biāo)本及其相關(guān)數(shù)據(jù)的流失。生物樣本庫中存儲的腫瘤組織能彌補這方面的不足，開始成為腫瘤基礎(chǔ)研究和臨床研究的重要標(biāo)本來源[6]。而長時間低溫凍存腫瘤組織標(biāo)本是否影響其生物大分子活性與完整性，學(xué)術(shù)界一直存在爭議[7]。目前認為低溫保存下組織樣本的生物大分子基本不會發(fā)生降解，可用于不同的實驗研究，然而長時間的低溫凍存可能會影響其穩(wěn)定性，帶來一定程度的降解。為闡明這一問題，本研究選擇我院外科胃腸道腫瘤組織標(biāo)本庫內(nèi)凍存時間長短不一的胃癌及結(jié)直腸癌標(biāo)本作為研究對象，對存儲組織樣本的DNA、RNA及蛋白質(zhì)的純度和完整性進行分析，旨在了解長期凍存對胃腸道腫瘤組織生物大分子的影響。

1 材料與方法

1.1 組織樣本

隨機選取2014年1月至2021年1月間錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床生物樣本中心采集、凍存的結(jié)直腸癌樣本及胃癌樣本的癌組織、癌旁組織及正常組織共96份。所有組織樣本的切取均由資深臨床外科醫(yī)生操作，組織樣本在離體后30 min內(nèi)完成采集，分裝到裝有RNA保存液的凍存管中，快速轉(zhuǎn)入液氮內(nèi)，然后放入-80 ℃冰箱中凍存。采集順序按正常組織(距腫瘤邊緣>5 cm)、癌旁組織(距腫瘤邊緣≤3 cm)、腫瘤組織分別進行切取，癌旁組織、正常組織取相同部位的“黏膜組織”樣本，每份樣本大小約為0.5 cm3。所選取樣本的患者在術(shù)前均未接受過放化療。樣本編號與腫瘤部位、凍存時間的對應(yīng)關(guān)系，見表1，其中用T代表腫瘤組織，P代表癌旁組織，N代表正常組織，S代表胃部，C代表結(jié)直腸。

表1 樣本編號與腫瘤部位、凍存時間的對應(yīng)關(guān)系

1.2 癌組織樣本腫瘤含量評估

本中心每一例患者的組織均會分裝成體積相等的3～5管進行凍存，取出1管癌組織經(jīng)固定、水洗、浸蠟以及包埋后進行組織切片，由資深的病理醫(yī)師閱片，評估該組織中腫瘤細胞含量。本研究所有癌組織中腫瘤細胞的含量均大于60%。

1.3 核酸提取及質(zhì)量控制

DNA采用Tissue DNA Kit(OMEGA，美國)進行提取。DNA純度A260/A280比值的測定采用分光光度計(Thermo，NanoDrop 2000，美國)。DNA完整性通過1%瓊脂糖凝膠電泳評估，組織樣本的上樣量為5 μL，電泳時間30 min，電泳條帶利用垂直電泳系統(tǒng)(ChemiDoc XRS，BIO-RAD，美國)和凝膠成像系統(tǒng)觀察。RNA采用Tissue RNA Kit(OMEGA，美國)進行提取。RNA純度A260/A280比值的測定采用分光光度計(Thermo，NanoDrop 2000，美國)。RNA完整性通過生物分析儀(Agilent 2100，美國)測定RNA分子完整數(shù)(RNA integrity number，RIN)。

1.4 蛋白質(zhì)提取及質(zhì)量控制

采用M-PER哺乳動物總蛋白提取試劑盒(Pierce，美國)抽提組織中蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)濃度通過BCA法(碧云天)進行測定?？捡R斯亮藍(SIGMA 公司，美國)法測定蛋白質(zhì)分子完整性[8]。蛋白質(zhì)樣本經(jīng)聚丙烯凝膠電泳2 h后，將整塊凝膠置于固定液中固定1 h，再染色30 min，最后用脫色液反復(fù)多次對凝膠進行脫色，直至肉眼可見清晰條帶。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0軟件對所有實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。采用單因素方差分析DNA的A260/A280比值、RNA 的A260/A280比值、RIN值以及蛋白質(zhì)濃度。采用卡方檢驗分析DNA和蛋白質(zhì)的完整性。設(shè)定P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 DNA分子的純度及完整性

組織樣本DNA的完整性采用1%瓊脂糖凝膠電泳圖進行分析，依據(jù)電泳條帶的清晰程度及拖尾情況對其進行質(zhì)量分級。A級：電泳條帶無拖尾情況，且清晰明亮；B級：條帶有一定的拖尾，清晰；C級：電泳無清晰條帶，泳道呈彌散帶狀，見圖1。選取的胃腸道腫瘤組織樣本提取DNA進行的純度測定(A260/A280)及質(zhì)量分級結(jié)果見表2?？梢?，A、B、C這3個質(zhì)量分級中癌組織、癌旁組織及正常組織的樣本數(shù)目比分別為(23∶7∶2)、(22∶10∶0)和(12∶17∶3)，正常組織與癌組織有顯著性差異(P=0.020)，正常組織與癌旁組織有顯著性差異(P=0.021)，癌組織與癌旁組織無顯著性差異(P=0.279)。胃癌與結(jié)直腸癌樣本中A、B、C級別的數(shù)量比為(30∶15∶3)vs(25∶21∶2)，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，未見顯著性差異(P=0.437)。將存儲年限分為≤2年、3～5年和≥6年3個組，A260/A280值無顯著性差異(P>0.05)，且A、B、C質(zhì)量級別的數(shù)量比分別為(22∶13∶1)、(19∶15∶2)和(15∶7∶2)，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析均無顯著性差異(P>0.05)，見圖2。

表2 樣本DNA純度值及完整性分級

圖1 DNA完整性分級標(biāo)準(zhǔn)示圖

圖2 不同存儲年限組織樣本DNA A260/A280比較

2.2 RNA分子的純度及完整性

不同存儲年限的胃癌和結(jié)直腸癌樣本提取的RNA檢測A260/A280及RIN值見表3?？梢姡改c道腫瘤在≤2年、3～5年和≥6年不同存儲時間的組織樣本RNA純度(A260/A280)均無顯著性差異(P>0.05)，見圖3。Agilent 2100生物分析儀采用1～10的編號系統(tǒng)，其中1表示RNA降解最為嚴重，10表示RNA最完整。通過對比樣本RIN值的差異，發(fā)現(xiàn)胃癌與結(jié)直腸癌組織樣本RNA完整性無顯著性差異(P>0.05)，見圖4。而存儲≥6年的樣本RNA完整性較存儲3～5年及≤2年均有顯著下降(P<0.05)，見圖5。提示組織樣本在冷凍保存6年以上時間后，RNA發(fā)生嚴重降解。

表3 樣本RNA A260/A280及RIN值

圖3 不同存儲年限組織樣本RNA A260/A280比較

圖4 胃癌與結(jié)直腸癌RIN值比較

圖5 不同存儲年限組織樣本RIN值比較

2.3 蛋白質(zhì)的濃度及完整性

檢測并記錄每個組織樣本蛋白質(zhì)的濃度(μg/μL)，發(fā)現(xiàn)不同存儲時間(≤2年、3～5年、≥6年)蛋白質(zhì)濃度無顯著性差異(P>0.05)，見圖6。采用考馬斯亮藍染色來檢測胃腸道腫瘤各組織樣本在低溫凍存不同時間后蛋白質(zhì)的完整性，見圖7。圖中可以看出，組織樣本存儲時間≤2年的蛋白質(zhì)條帶清晰且數(shù)目較多，存儲時間在3～5年的蛋白質(zhì)條帶數(shù)目相較于≤2年有所減少，而存儲時間≥6年的組織中提取的蛋白質(zhì)條帶模糊且肉眼可見少于3條。因此，根據(jù)電泳條帶的狀態(tài)將蛋白質(zhì)完整性進行質(zhì)量分級：(1)A級，低分子量到高分子量的蛋白質(zhì)條帶均清晰可見；(2)B級，清晰條帶數(shù)目在5條以上；(3)C級，條帶模糊，條帶數(shù)目在5條以下。蛋白質(zhì)濃度及完整性分級見表4。胃癌與結(jié)直腸癌樣本中蛋白質(zhì)完整性A、B、C分級之比為(17∶27∶4)和(19∶23∶6)，兩者在蛋白質(zhì)完整性無顯著性差異(P>0.05)。癌組織、癌旁組織及正常組織的樣本數(shù)目比分別為(14∶15∶3)、(11∶17∶4)和(11∶18∶3)，三者無顯著性差異(P>0.05)。組織樣本存儲時間≤2年、3～5年和≥6年的蛋白質(zhì)完整性分級A、B、C級數(shù)目之比分別為(22∶14∶0)、(14∶20∶2)和(0∶16∶8)，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，組織樣本存儲時間≤2年與3～5年的蛋白質(zhì)完整性無顯著性差異(P>0.05)，而存儲時間≥6年與≤2年與3～5年有顯著性差異(P<0.05)，提示蛋白質(zhì)在低溫凍存超過6年時間后發(fā)生降解。

圖6 不同存儲年限蛋白質(zhì)濃度

圖7 不同存儲年限蛋白染色圖

表4 樣本蛋白質(zhì)濃度值及完整性分級

續(xù)表

3 討 論

生物樣本在長時間低溫存儲后，定期檢測其質(zhì)量，驗證是否發(fā)生質(zhì)量的改變已成為生物樣本庫工作的重中之重，因為高質(zhì)量的腫瘤樣本是保障實驗研究有效進行的首要條件[9]。長期低溫凍存的組織樣本提取的生物大分子是否能滿足基礎(chǔ)實驗和臨床研究的需求，國內(nèi)外的報道尚不多見。目前國際上對于不同存儲方式提取的生物大分子并沒有固定的衡量標(biāo)準(zhǔn)，能否有效地應(yīng)用于科學(xué)研究完全取決于該研究對生物大分子純度和完整性的要求。RIN值≥7被認為是高質(zhì)量的RNA，可用于基因芯片等[10]，Aye Yüzbaolu[11]指出全基因組表達分析也需要RNA保持較高的完整性。而RIN值≥5表示RNA具有良好的完整性，可用于一般的分子生物學(xué)研究，如RT-PCR分析[12]。對于降解較嚴重的RNA樣本，需要進一步研究是哪些因素導(dǎo)致降解，方便后續(xù)樣本的存儲及利用。

低溫凍存溫度、凍存時間等因素都能導(dǎo)致生物大分子質(zhì)量發(fā)生改變。在低于生物樣本正常生理溫度的環(huán)境下，細胞都會受到寒冷刺激，而這種刺激將直接影響細胞正常的生理代謝，進而對生物大分子的質(zhì)量或表達產(chǎn)生影響，只是由于存儲溫度高低和時間長短的不同，造成影響大小的差異性[13]。研究表明[14]，長時間凍存于-80 ℃環(huán)境中的組織樣本能獲得高質(zhì)量的DNA，本文結(jié)果與文獻一致。但是由于RNA與蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定性，長時間保存可能帶來不同程度的降解。凍存時間對RNA與蛋白質(zhì)的影響研究主要集中在完整性，普遍認為保存較長時間后會發(fā)生降解，胃腸、胰腺等產(chǎn)生消化酶較多的組織樣本RNA與蛋白質(zhì)降解較快，而有些腫瘤如乳腺癌等則可保存更長時間，這和保存對象的組織自身特征有關(guān)[15]。低溫對蛋白質(zhì)的影響不僅體現(xiàn)在完整性上，在酶功能、二級結(jié)構(gòu)及表達量等方面也有一定影響。Rouy等[16]研究發(fā)現(xiàn)將樣本儲存在-80 ℃環(huán)境中，隨著時間的不斷延長，基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)會逐步發(fā)生降解。Mazur等[17]認為，暴露于高濃度溶液中的細胞內(nèi)蛋白質(zhì)在低溫冷凍時發(fā)生了不可逆的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變。在受到酸、堿、重金屬鹽等作用下，蛋白質(zhì)發(fā)生的不可逆改變將失去原有的生理作用。Hubel等[18]的研究結(jié)果表明肺癌和乳腺癌細胞表面蛋白在凍存后的表達量出現(xiàn)下調(diào)。有研究指出[19-21]，低溫保護劑的加入能一定程度上延長生物大分子的降解時間。目前，低溫凍存依然是維持組織樣本蛋白質(zhì)活性與完整性的主要手段，國際國內(nèi)對此研究還不足夠深入，因此在今后的研究與實踐中還需不斷探索條件，積累經(jīng)驗，建立最優(yōu)的低溫保存方法以便更長時間地維持蛋白質(zhì)活性與穩(wěn)定性。

對低溫存儲組織樣本生物大分子的質(zhì)量研究可為研究胃腸道腫瘤的發(fā)生、發(fā)展機制以及個體化治療和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)提供寶貴的臨床樣本資源，不僅可以縮短科研工作周期，加快醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化及研究進程，還可確?？蒲泄ぷ鞯恼_性和科學(xué)性，對促進胃腸道腫瘤的發(fā)展具有十分重要的醫(yī)學(xué)意義。