趙寧，郭喜良

(錦州醫(yī)科大學(xué)，遼寧 錦州 121000)

隨著全球經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，糖尿病已成為威脅人類(lèi)健康的重要疾病之一。據(jù)估計(jì)，到2040年全世界可能有6億糖尿病患者[1]。糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病常見(jiàn)的眼部并發(fā)癥之一，在糖尿病患者中總發(fā)病率為35%，是導(dǎo)致成人失明的主要原因[2]。然而，目前臨床上針對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變?nèi)匀蝗狈τ行У乃幬锖椭委煼椒?。近年?lái)的研究表明，視網(wǎng)膜神經(jīng)組織病變?cè)贒R的早期階段越來(lái)越受到關(guān)注[3]，主要的病理改變包括星形膠質(zhì)細(xì)胞活化、視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞凋亡、神經(jīng)節(jié)喪失、核層變薄等[4-5]。Müller細(xì)胞是視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞的主要組成部分，在維持視網(wǎng)膜功能結(jié)構(gòu)中發(fā)揮著必不可少的作用。此外，Müller細(xì)胞能分泌多種細(xì)胞因子，為視網(wǎng)膜神經(jīng)元提供營(yíng)養(yǎng)支持，在維持視網(wǎng)膜生理功能方面發(fā)揮重要作用[6]。

在DR發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中，炎癥反應(yīng)越來(lái)越受到重視。在DR形成過(guò)程中，多種炎癥因子可誘導(dǎo)環(huán)氧化酶2(COX2)的表達(dá)。已有研究報(bào)道，由COX2/前列腺素E2(PGE2)信號(hào)通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，激活NF-κB，釋放大量的炎癥因子，導(dǎo)致視網(wǎng)膜毛細(xì)血管細(xì)胞凋亡、視網(wǎng)膜周細(xì)胞和毛細(xì)血管退行性變，促進(jìn)DR的發(fā)生發(fā)展[7-8]。紅景天苷是中藥紅景天中分離出來(lái)的一種活性成分，具有多種生物活性和藥理活性。有研究表明，紅景天苷能有效降低血糖濃度，起到抗氧化應(yīng)激、抗炎癥、抗凋亡等藥理作用[9-11]。本研究旨在探討Sal對(duì)高糖作用后rMC-1細(xì)胞凋亡的抑制作用。

1 材料和方法

1.1 材料

rMC-1為本實(shí)驗(yàn)室保存；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青有限公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone生物科技有限公司；Sal購(gòu)自美倫生物技術(shù)有限公司(純度≥98%)；PGE2ELISA試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司；COX2多克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；Bax、Bcl-2多克隆抗體購(gòu)自萬(wàn)類(lèi)生物科技有限公司；SDS-PAGE凝膠電泳試劑盒、Annexin-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自索萊寶科技有限公司；CCK8試劑盒購(gòu)自上海尚寶生物科技有限公司；NS398購(gòu)自英國(guó)Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

用含體積分?jǐn)?shù)10% FBS的完全高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)rMC-1，將其置于37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中。當(dāng)細(xì)胞融合率至70%時(shí)，傳代培養(yǎng)。

1.2.2 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活力

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的rMC-1，將細(xì)胞密度調(diào)整至1×104個(gè)/孔接種在96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，按照0、0.125、0.25、0.5、1 mmol/L濃度將Sal分別置于高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h。在待測(cè)孔中加入CCK8試劑，培養(yǎng)箱中孵育1.5 h，用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定。

1.2.3 細(xì)胞分組

實(shí)驗(yàn)分為4組，即正常對(duì)照組：DMEM培養(yǎng)液(葡萄糖濃度為5.5 mmol/L)；高糖組：高糖DMEM培養(yǎng)液(葡萄糖濃度為35.5 mmol/L)；Sal干預(yù)組：高糖DMEM培養(yǎng)液+Sal 0.5 mmol/L；COX2抑制劑組：在高糖培養(yǎng)基中加入NS398(濃度為10 μmol/L)，均培養(yǎng)48 h。

1.2.4 ELISA法檢測(cè)PGE2水平

將rMC-1按照5×105個(gè)/孔密度接種于6孔板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，貼壁后換液。各組細(xì)胞按照1.2.3處理方法培養(yǎng)以后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，置于4 ℃下，以1000 rpm轉(zhuǎn)速離心10 min，收集培養(yǎng)液上清液。分別加入50 μL標(biāo)準(zhǔn)品和樣品于相應(yīng)孔中，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處吸光度OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次各組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

各組細(xì)胞按照1.2.3處理方法培養(yǎng)以后，加入預(yù)冷的PBS洗滌，離心沉淀細(xì)胞后用1 mL 1×BindingBuffer重新懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×108/L。每管加入100 μL細(xì)胞懸液，再加入AnnexinV-FITC(5 μL)于5 mL流式管中，輕輕混勻后，室溫下避光孵育10 min。加入5 μL碘化丙啶溶液(PI)，室溫下避光孵育5 min。加入PBS至500 μL，在1 h內(nèi)用進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)。

1.2.6 Western blot檢測(cè)蛋白相對(duì)表達(dá)

各組細(xì)胞按照1.2.3處理方法培養(yǎng)以后，提取細(xì)胞總蛋白，10%SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)至PVDF膜、室溫封閉漂洗后，分別孵育抗COX2、Bcl-2、Bax、抗內(nèi)參照GAPDH的一抗4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌3次后，加入HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育90 min。TBST洗滌3次后，使用ECL試劑盒顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0軟件處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果，計(jì)量資料結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，在方差齊性條件下采用單因素方差(one-way ANOVA)分析。兩組組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CCK8檢測(cè)rMC-1細(xì)胞活力

通過(guò)CCK8檢測(cè)Sal對(duì)高糖作用后rMC-1細(xì)胞活力的影響，見(jiàn)表1。高糖作用后rMC-1增殖率明顯降低(P<0.05)；與高糖組比較，Sal干預(yù)組(0.125 mmol/L，0.25 mmol/L)細(xì)胞增值率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，Sal干預(yù)組(0.5 mmol/L，1 mmol/L)細(xì)胞增殖率顯著上升(P<0.05)。Sal在濃度為0.5 mmol/L及1 mmol/L時(shí)細(xì)胞增值率相差不大，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，因此實(shí)驗(yàn)篩選Sal最佳濃度為0.5 mmol/L用于后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

表1 各組細(xì)胞增值率變化

2.2 Elisa法檢測(cè)PGE2水平

Elisa檢測(cè)SAL對(duì)高糖作用后rMC-1細(xì)胞炎性細(xì)胞因子PGE2的影響。高糖作用后PGE2表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)。與高糖組相比，0.5 mM Sal干預(yù)高糖作用的rMC-1細(xì)胞48 h后，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中PGE2表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。COX2/PGE2信號(hào)通路在炎癥反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，為了研究該通路是否參與了高糖誘導(dǎo)的rMC-1損傷，使用COX2抑制劑NS398。與高糖組比較，COX2抑制劑組PGE2表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 PGE2、COX2的表達(dá)變化

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡，與對(duì)照組相比，高糖作用后細(xì)胞凋亡率著增加(P<0.01)。與高糖組相比，0.5 mM Sal干預(yù)高糖作用的rMC-1細(xì)胞48 h后，凋亡率顯著降低，COX2抑制劑組細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)，見(jiàn)圖1、表3。

圖1 Sal對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響

表3 Sal對(duì)細(xì)胞凋亡率及Bax、Bcl-2表達(dá)水平的影響

2.4 Western blot檢測(cè)COX2、Bax、Bcl-2蛋白質(zhì)的表達(dá)量

Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。與正常對(duì)照組比較，高糖組rMC-1細(xì)胞中COX2、Bax表達(dá)量明顯升高，Bcl-2表達(dá)量明顯降低(P<0.01)。與高糖組比較，Sal干預(yù)組、COX2抑制劑組COX2、Bax表達(dá)量顯著降低，Bcl-2表達(dá)量明顯升高(P<0.05)，見(jiàn)圖2、表3。

A：正常對(duì)照組；B：高糖組；C：Sal干預(yù)組；D：COX2抑制劑組

3 討 論

DR是糖尿病患者最常見(jiàn)、最嚴(yán)重的眼部微血管并發(fā)癥之一。其發(fā)病率及嚴(yán)重程度隨著糖尿病病程的延長(zhǎng)而增加。糖尿病病程在5年之內(nèi)，DR的發(fā)病率為44.4%。當(dāng)糖尿病的病程延長(zhǎng)至7年，DR的發(fā)病率可達(dá)到56%以上[12]。高血糖狀態(tài)是DR發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ)，視網(wǎng)膜神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在長(zhǎng)期高血糖的環(huán)境下代謝紊亂，繼而引發(fā)微血管損傷。DR的發(fā)生與血糖升高密切相關(guān)[13-14]，長(zhǎng)期高血糖可導(dǎo)致視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞細(xì)胞器損傷，細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變，進(jìn)而導(dǎo)致Müller細(xì)胞活化，引起其功能障礙。有研究報(bào)道，體外高糖環(huán)境誘導(dǎo)視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)，進(jìn)而降低細(xì)胞活力[15]。本研究采用CCK8檢測(cè)Sal對(duì)高糖作用rMC-1細(xì)胞活力的影響，結(jié)果表明，Sal能夠顯著提高高糖作用后Müller細(xì)胞活力。

DR的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，炎癥反應(yīng)是其關(guān)鍵因素之一。炎癥反應(yīng)通過(guò)破壞血-視網(wǎng)膜屏障，導(dǎo)致DR患者視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生異常改變[16]。COX2是一種廣泛存在的炎癥介質(zhì)，在正常情況下，幾乎檢測(cè)不到其表達(dá)，但在病理情況下表達(dá)水平上調(diào)，并通過(guò)催化花生四希酸合成大量PGE2[17]。PGE2是COX2的主要下游代謝產(chǎn)物，在DR動(dòng)物模型中，高糖作用使COX2表達(dá)水平上調(diào)，隨之PGE2大量合成。COX2抑制劑可以顯著抑制PGE2表達(dá)水平，從而抑制高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜血管滲透性及毛細(xì)血管變性[18]。此外，Dan Wu等研究發(fā)現(xiàn)在紫外線誘導(dǎo)的皮膚炎癥模型中，Sal可靶向作用于COX2氨基酸殘基Arg106和Tyr341上，產(chǎn)生氫鍵與COX2直接結(jié)合，進(jìn)而抑制SUV照射引起的PGE2的產(chǎn)生，減輕炎癥反應(yīng)[19]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在濃度為35.5 mmol/L高糖作用下，rMC-1細(xì)胞中COX2、PGE2蛋白表達(dá)水平均顯著上升，表明高糖環(huán)境誘導(dǎo)視網(wǎng)膜Müller發(fā)生炎癥反應(yīng)，而Sal處理組rMC-1細(xì)胞中COX2、PGE2蛋白表達(dá)水平均顯著低于高糖組，表明Sal可以有效降低高糖作用下視網(wǎng)膜Müller中炎癥介質(zhì)COX2、PGE2的表達(dá)。

有報(bào)道表明DR的發(fā)病機(jī)制與視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，多種凋亡相關(guān)基因參與調(diào)控過(guò)程，其中包括促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白[20]。Bcl-2作為抗凋亡蛋白成員，可以阻止多種信號(hào)通路進(jìn)而阻斷細(xì)胞凋亡、延長(zhǎng)細(xì)胞存活時(shí)間，而B(niǎo)ax屬于促凋亡蛋白，能夠介導(dǎo)或者促使細(xì)胞凋亡。在正常生理環(huán)境下，細(xì)胞內(nèi)Bcl-2與Bax比值呈一定的比例。但高糖誘導(dǎo)后，視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著下降，Bax蛋白表達(dá)水平顯著上升，Bcl-2與Bax比值下降，最終激活Caspases介導(dǎo)的視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞凋亡，因此Bcl-2與Bax比值是細(xì)胞凋亡或存活的關(guān)鍵因素[21]。李青春等研究發(fā)現(xiàn)，在STZ誘導(dǎo)的糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠模型中，Bcl-2表達(dá)減弱，Bax表達(dá)增強(qiáng)[22]。此外，Hui Shan等研究發(fā)現(xiàn)，Sal可通過(guò)調(diào)整Bcl-2/Bax比值，改善PM 2.5誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞凋亡[23]。本實(shí)驗(yàn)研究，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況，與正常對(duì)照組相比，高糖組rMC-1細(xì)胞凋亡率顯著升高，而Sal能夠逆轉(zhuǎn)高糖作用后rMC-1細(xì)胞凋亡率的升高。通過(guò)Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá)情況，高糖環(huán)境下Bcl-2表達(dá)降低、Bax表達(dá)升高。而Sal干預(yù)后，與高糖組比較Bcl-2表達(dá)升高、Bax表達(dá)降低、Bcl-2/Bax比值升高，進(jìn)而證明Sal對(duì)高糖作用后的rMC-1細(xì)胞發(fā)揮抗凋亡作用。此外，在高糖誘導(dǎo)的rMC-1細(xì)胞中加入NS398，細(xì)胞凋亡率降低，Bcl-2表達(dá)升高、Bax表達(dá)降低。因而推斷在高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞模型中，Sal的保護(hù)作用可能與抑制COX2/PGE2信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，Sal可增加高糖環(huán)境下rMC-1細(xì)胞活性，同時(shí)對(duì)高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有抑制作用。Sal的保護(hù)作用與上調(diào)Bcl-2及下調(diào)Bax的表達(dá)相關(guān)。此外，Sal可以顯著降低高糖作用后rMC-1細(xì)胞中COX2、PGE2蛋白的表達(dá)，說(shuō)明Sal可能通過(guò)COX2/PGE2信號(hào)通路對(duì)高糖環(huán)境下視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞凋亡發(fā)揮抑制作用。Sal對(duì)高糖作用下視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的抗凋亡作用有望成為治療DR的研究方向。