馬瓊,李軍生,黃國(guó)霞,閻柳娟,馬紀(jì)
(廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院,廣西柳州 545006)
黃曲霉毒素(Aflatoxin,AFT)是由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的雙呋喃環(huán)類毒素。衍生物約有20 多種,具有極強(qiáng)的致畸性、致癌性和致突變性,對(duì)肺部、肝臟、神經(jīng)系統(tǒng)等器官具有極強(qiáng)的毒性[1]。1993 年,黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織癌癥研究機(jī)構(gòu)列為一類致癌物,常見的黃曲霉毒素(B1、B2、G1、G2),AFG1的毒性僅次于AFB1[2,3]。玉米、花生、大豆等農(nóng)作物在種植、收獲、儲(chǔ)藏、加工等過程中易滋生毒素。常采用物理、化學(xué)、生物等傳統(tǒng)方法去除黃曲霉毒素[4-8]。雖然吸附、熱處理、萃取等物理方法可以去除黃曲霉毒素,但存在去除效率較低、成本高、對(duì)溫度的要求較高等問題。經(jīng)酸堿、氧化還原等化學(xué)方法處理易產(chǎn)生副產(chǎn)物以及殘留試劑,導(dǎo)致二次污染。生物方法主要采用微生物或其產(chǎn)生的酶及其制劑來對(duì)黃曲霉毒素進(jìn)行去除,過程中有可能產(chǎn)生新的有毒物質(zhì)。所以研究一種高效去除黃曲霉毒素的方法十分必要。DNA 是生物體內(nèi)主要的遺傳物質(zhì),廣泛存在于自然界中,具有極高的生物安全性。黃曲霉毒素屬呋喃香豆素的衍生物,是一類典型DNA 嵌入劑分子,因此,通過生物安全的DNA 選擇性主動(dòng)俘獲消除黃曲霉毒素的創(chuàng)新構(gòu)想,正好為更加安全高效地消除黃曲霉毒素提供了新思路和借鑒。
DNA 主要由含氮堿基、戊糖和磷酸骨架組成,具有獨(dú)特的雙螺旋結(jié)構(gòu),對(duì)許多平面芳香結(jié)構(gòu)的化合物具有很好的親和力[9]。1961 年,Lerman[10]發(fā)現(xiàn)吖啶分子可以通過疏水作用、氫鍵、離子相互作用、范德華力等非共價(jià)作用方式嵌入DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)中。類似吖啶的多環(huán)小分子化合物能與DNA 通過非共價(jià)相互作用嵌入DNA 堿基對(duì)之間并與之形成嵌插復(fù)合物,諸如吖啶、溴化乙錠、道諾霉素以及蒽醌類復(fù)合物等多環(huán)類化合物[11-13],通過對(duì)這些多環(huán)類化合物的深入研究,構(gòu)建了成熟的DNA 嵌入理論。利用嵌入劑所具有的嵌入性質(zhì),可以設(shè)計(jì)出高效的DNA 嵌入劑,用于選擇性去除有害的多環(huán)類化合物。同時(shí),本實(shí)驗(yàn)室通過共振散射光譜對(duì)AFB1、多環(huán)芳烴、茜草色素光澤汀以及大黃素等多種平面小分子與DNA 的相互作用進(jìn)行研究[14-18]。依據(jù)DNA 嵌入理論設(shè)計(jì)的一系列新型吸附材料,如磁珠負(fù)載DNA、DNA 凝膠珠、DNA 組裝的聚砜顆粒等DNA 嵌插材料[19-21],用以選擇性去除溴化乙錠、多環(huán)芳烴、吖啶橙等有害物質(zhì)。
紫外光譜、共振散射光譜、圓二色譜等實(shí)驗(yàn)已經(jīng)充分證明AFG1與DNA之間的相互作用是典型嵌插結(jié)合模式[22]。為此,本文首先通過共振散射光譜檢測(cè)AFG1的DNA 結(jié)合飽和值,并通過AFG1的DNA 結(jié)合飽和值進(jìn)一步評(píng)價(jià)AFG1嵌入DNA 分子的能力大小。然后,再通過檢測(cè)AFG1的DNA 結(jié)合飽和值變化,揭示溫度、pH、氯化鈉、氯化鈣、L-天冬氨酸、葡萄糖、尿素、亮氨酸、賴氨酸等外部因素的變化對(duì)AFG1嵌入DNA 分子能力的影響,據(jù)此構(gòu)建和進(jìn)一步優(yōu)化DNA 選擇性吸附消除AFG1的有效方法。最后通過吸附動(dòng)力學(xué)、等溫吸附模型以及吸附熱力學(xué)等進(jìn)一步探究DNA 選擇性吸附AFG1過程,為探索構(gòu)建一種新型高效去除黃曲霉毒素的方法提供參考。
AFG1(Pribolab 公司)溶液的配制:利用適量的φ=98%無(wú)水乙醇溶解AFG1粉末后用Tris-HCl 緩沖溶液稀釋至所需濃度待用。DNA(Solarbio Science 公司)溶液的配制:超純水溶解DNA 粉末,于0~4 ℃下保存,其純度以260 nm 與280 nm 吸光度的比值檢測(cè)(A260nm/A280nm=1.87>1.8,符合試驗(yàn)要求),由公式C=A/εL(ε=6 600 L/(mol·cm))確定濃度?;钚蕴康呐渲疲喝?.25 mg 活性炭用Tris-HCl 浸泡活化一段時(shí)間稀釋待用。Tris-HCl 緩沖液的配制:按照不同比例將0.1 mol/L Tris(三羥甲基氨基甲烷)與0.1 mol/L HCl溶液混合配制成一系列的緩沖液待用。環(huán)境共存物的配制:環(huán)境共存物均以0.1 mol/L 配制稀釋成所需濃度待用。綁定液的配制:按比例將0.01 mol/L Tris-HCl(pH 值8.0)與0.001 mol/L EDTA 配制成綁定液待用。磁珠,富生物科技有限公司。
熒光分光光度計(jì),Cary Eclipse Agilent;紫外分光光度計(jì),Cary 60 Agilent Technologies;DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器,鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;恒溫振蕩器,IS-RDV3 CRYSTAL;TGL-16G 高速離心機(jī),上海市安亭科學(xué)儀器廠。
1.2.1 共振散射光譜與DNA 結(jié)合飽和值檢測(cè)
在30 ℃條件下,首先向1.0×1.0 cm 的石英比色皿中加入2 mL 的AFG1溶液(pH 值為7.40,5.31×10-7mol/L)待溶液穩(wěn)定時(shí)于熒光分光光度計(jì)上進(jìn)行同步掃描并記錄。隨后每次滴加10 μL DNA 溶液于AFG1溶液,充分混勻后靜置10 min 掃描共振光散射光譜,當(dāng)溶液共振光散射強(qiáng)度不再發(fā)生變化時(shí),此時(shí)達(dá)到飽和,根據(jù)公式計(jì)算DNA 結(jié)合飽和值。
1.2.2 環(huán)境因素對(duì)AFG1-DNA結(jié)合飽和值的效果
向試管中分別加入0.5 mL AFG1、0.5 mL DNA、1 mL 環(huán)境因素、1 mL pH 值7.40 的Tris-HCl 緩沖液,經(jīng)恒溫振蕩器搖勻,靜置5 min 待溶液穩(wěn)定后,掃描并記錄共振散射光譜。選擇對(duì)AFG1-DNA 影響最大的共振散射強(qiáng)度對(duì)應(yīng)的環(huán)境因素的濃度,測(cè)定DNA 結(jié)合飽和值。
1.3.1 AFG1標(biāo)準(zhǔn)曲線
以不同濃度的AFG1為橫坐標(biāo),對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo),繪制出AFG1的標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖1。
圖1 熒光光譜測(cè)定AFG1的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve for determination of AFG1 by fluorescence spectroscopy
1.3.2 DNA 和活性炭在去除AFG1效果的比較
首先將100 μL AFG1和100 μL DNA 混勻后在30 ℃下反應(yīng)10 min、隨后依次加入100 μL 磁珠、200 μL 綁定液等放置于EP 管內(nèi),搖勻,然后放置于恒溫振蕩器中反應(yīng)60 min,用磁鐵分離上清液,經(jīng)離心后,掃描上清液的熒光光譜(Ex=370 nm;掃描范圍:220~600 nm;掃描速度:快;Ex silt=10 nm;Em silt=10 nm)并記錄。代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(熒光強(qiáng)度與AFG1濃度的線性曲線)求出Ct。其中,AFG1與DNA結(jié)合的量由AFG1吸附量(Q)和AFG1去除率(%)確定,其計(jì)算公式如下[23]。將活性炭替代DNA 做類似處理,其中活性炭在pH 值為7.40 的Tris-HCl 緩沖液中活化一段時(shí)間后,加入AFG1溶液反應(yīng),實(shí)驗(yàn)條件以及計(jì)算方法同DNA。
式中:
Q——吸附劑的吸附容量,mg/g;
F——AFG1去除率,%;
C0——AFG1的初始濃度,mol/L;
Ct——AFG1的平衡濃度,mol/L;
V——溶液體積,L;
m——吸附劑的質(zhì)量,g。
1.3.3 共存物對(duì)AFG1去除率的效果
向EP 管內(nèi)分別加入100 μL AFG1溶液、100 μL DNA 溶液、100 μL 磁珠、100 μL 環(huán)境因素、200 μL綁定液,其操作條件以及方法同1.3.2,計(jì)算共存物對(duì)AFG1去除率。
1.4.1 速率模型
吸附動(dòng)力學(xué)描述了吸附劑的吸附速率。測(cè)定不同時(shí)間下每單位質(zhì)量的吸附劑的吸附量,常用Pseudo-first Order Kinetics 模型(3)和Pseudo-second Order Kinetics 模型(4)來描述。用線性公式表示如下[24]:
式中:
Qe——平衡時(shí)每單位質(zhì)量的吸附劑的吸附質(zhì)量,mg/g;
Qt——在t時(shí)刻每單位質(zhì)量的吸附劑的吸附質(zhì)量,mg/g;
t——時(shí)間,min;
K1——準(zhǔn)一階吸附速率常數(shù),1/min;
K2——準(zhǔn)二階吸附速率常數(shù),g/(mg·min)。
1.4.2 等溫吸附模型
用Langmuir 和Freundlich 吸附等溫線來分析等溫吸附過程[24],評(píng)價(jià)吸附劑的吸附特性、吸附容量和表面性質(zhì)。Langmuir 和Freundlich 等溫線的一般形式由式(5)、(6)給出。
式中:
Qe——單位重量吸附劑對(duì)AFG1的吸附量,mg/g;
Qmax——AFG1的最大吸附量,mg/g;
Ce——達(dá)到吸附平衡時(shí)對(duì)AFG1的吸附量,mg/g;
KL——與吸附能相關(guān)的Langmuir 常數(shù),L/mg;
Kf——Freundlich 常數(shù),mg/g;
1/n——吸附劑表面的不均勻程度。
1.4.3 熱力學(xué)模型
在30、35、40、45 和50 ℃的溫度下,分析吸附熱過程。利用Vant Hoff 方程(7)~(9)[25]確定吸附過程的ΔH0和ΔS0。
式中:
K——吸附分布常數(shù);
ΔH0——焓變;
ΔS0——熵變;
T——開爾文溫度;
R——?dú)怏w常數(shù)8.314 J/(K·mol);
ΔH0——由斜率計(jì)算;
ΔS0——由lnK和1/T擬合的曲線(9)的截距計(jì)算。
向花生油樣品中加入適量AFG1標(biāo)準(zhǔn)液,得到AFG1濃度為84.75 μg/L 的花生油樣品。用DNA(25.00×10-3μg/mL)吸附去除污染花生油中的AFG1。在最佳吸附溫度和吸附時(shí)間下,加入磁珠,反應(yīng)80 min,經(jīng)磁鐵分離磁珠,洗脫后萃取,然后用熒光光譜法測(cè)定洗脫液中AFG1的熒光強(qiáng)度。AFG1濃度的計(jì)算方法同1.3。
本試驗(yàn)中采用Excel 2016 以及SPSS 19.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理,采用Origin 2018 繪制分析圖以及模型擬合的分析處理。
2.1.1 DNA 結(jié)合飽和值的檢測(cè)
DNA 結(jié)合飽和值可以用來評(píng)價(jià)平面小分子與DNA 嵌插結(jié)合能力的大小。平面小分子與DNA 分子的結(jié)合的位點(diǎn)和數(shù)量是確定的,其結(jié)構(gòu)決定了嵌入DNA 的能力強(qiáng)弱。當(dāng)平面小分子的濃度過量時(shí),共振光散射信號(hào)隨著DNA 濃度的增加而增強(qiáng)。然而,當(dāng)DNA 濃度達(dá)到極限時(shí),即使DNA 濃度增加,共振散射信號(hào)也不再增加。此時(shí)的DNA 濃度為飽和DNA 濃度(計(jì)算公式如(10))。圖2 可知,在30 ℃,pH 值7.4 條件下,當(dāng)AFG1的濃度一定時(shí),隨著DNA 濃度的增加,共振散射信號(hào)也逐漸增加,但是當(dāng)DNA 的濃度達(dá)到3.19×10-7mol/L,共振散射峰信號(hào)強(qiáng)度不再增強(qiáng)。此時(shí),認(rèn)為AFG1與DNA 的結(jié)合達(dá)到飽和,DNA 結(jié)合飽和值為1.66。溴化乙錠和補(bǔ)骨脂素是非常典型的DNA 嵌入劑,實(shí)驗(yàn)室前期人員還對(duì)溴化乙錠、黃曲霉毒素B1、補(bǔ)骨脂素的DNA 結(jié)合飽和值(表1)進(jìn)行了測(cè)定。從表中可以看出AFG1與DNA 的結(jié)合和飽和值小于溴化乙錠和AFB1的結(jié)合飽和值,但是大于補(bǔ)骨脂素的DNA 的結(jié)合飽和值。所以,AFG1與DNA的結(jié)合能力小于溴化乙錠和AFB1,大于補(bǔ)骨脂素。
表1 不同試劑與DNA 相互作用的DNA 結(jié)合飽和值Table 1 DNA binding saturation values of interaction between different reagents and DNA
圖2 DNA 濃度對(duì)AFG1-DNA 共振散射光譜的影響Fig.2 Effect of DNA concentration on resonance scattering spectra of AFG1-DNA
式中:
Z——DNA 結(jié)合飽和值(BSV);
Cm——平面小分子的濃度,mol/L;
Cn——飽和DNA 的濃度,mol/L。
2.1.2 環(huán)境因素對(duì)AFG1-DNA結(jié)合飽和值的影響
2.1.2.1 溫度和pH 對(duì)AFG1-DNA 結(jié)合飽和值的影響
由圖3a 可知,隨著溫度的升高,信號(hào)強(qiáng)度先增大后下降,開始時(shí)分子與分子之間的相對(duì)運(yùn)動(dòng)加快。30 ℃時(shí),共振散射峰信號(hào)強(qiáng)度最大,溫度的升高,DNA雙鏈?zhǔn)軣峤庑?,結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,不利于AFG1-DNA 結(jié)合。25 ℃、30 ℃以及35 ℃的飽和值分別為1.38、1.66、1.23。30 ℃時(shí)飽和值最大,AFG1-DNA 的結(jié)合能力最強(qiáng),因此30 ℃為AFG1-DNA 的相互作用的適宜溫度[27]。
圖3 (a)溫度對(duì)AFG1-DNA 共振散射峰信號(hào)的影響,(b)不同DNA濃度下對(duì)AFG1-DNA 的共振散射強(qiáng)度的影響Fig.3 (a) Effect of temperature on the resonance scattering peak intensity of AFG1-DNA;(b) Effect of DNA concentration on resonance scattering intensity (p<0.05)
圖4 為pH 值對(duì)AFG1-DNA 嵌插結(jié)合的影響,在pH 值5.80~7.40 之間,體系溶液呈現(xiàn)酸性,共振散射峰信號(hào)強(qiáng)度逐漸增大,DNA 雙鏈中的氫鍵在酸性條件下,不穩(wěn)定且易斷裂,同時(shí)溶液中的氫離子與DNA 中帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)相互吸引,大量的氫離子聚集在DNA 堿基周圍,阻礙了AFG1與DNA 相互結(jié)合。在pH 值7.40~9.00 之間,體系溶液呈現(xiàn)堿性,使得DNA 變性解旋,導(dǎo)致AFG1與DNA 相互結(jié)合的部位減少,共振散射峰信號(hào)逐漸減弱[28]。在pH 值5.80、7.40 和9.00 的條件下,AFG1-DNA 結(jié)合飽和值分別為1.47、1.66、1.65,pH 值7.40 時(shí),AFG1-DNA 結(jié)合飽和值最大,因此,pH 值7.40 為AFG1-DNA 的相互作用的適宜pH 值。
圖4 pH 對(duì)AFG1-DNA 共振散射峰信號(hào)的影響Fig.4 Effect of pH on resonance scattering peak signal of AFG1-DNA (p<0.05)
2.1.2.2 氯化鈉、氯化鈣、L-天冬氨酸和葡萄糖對(duì)AFG1-DNA 結(jié)合飽和值的影響
圖5a 中,NaCl 的濃度在0~1.00×10-5mol/L 之間時(shí),AFG1-DNA 共振散射峰信號(hào)先增大后減小。原因可能是由于在低離子強(qiáng)度時(shí)鈉離子與DNA 中帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)反應(yīng),靜電相互吸引從而有利于AFG1-DNA 的相互作用,隨著離子強(qiáng)度的增加,DNA斷裂,破壞了DNA 分子的穩(wěn)定性,DNA 的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[29]。固定氯化鈉和 AFG1的濃度分別為1.00×10-5mol/L 和5.31×10-7mol/L 時(shí),AFG1-DNA 結(jié)合飽和值為1.45。
圖5b 所示,0~1.00×10-7mol/L 之間,隨著鈣離子濃度的增加,遂導(dǎo)致AFG1-DNA 的共振散射峰信號(hào)強(qiáng)度增加,鈣離子對(duì)磷酸鹽有高化學(xué)親和性,不是在DNA 表面簡(jiǎn)單的縮合,而是在DNA 堿基中的磷酸基團(tuán)點(diǎn)狀吸附,逐漸聚集在 D N A 的周圍。在1.00×10-7mol/L~1.00×10-4mol/L 范圍內(nèi),隨著鈣離子濃度的增加,體系溶液富含大量鈣離子,鈣離子與DNA 的這種極化效應(yīng)不會(huì)一直增加,所以,AFG1-DNA 的共振散射峰信號(hào)強(qiáng)度減弱。由于鈣離子吸附在DNA 的周圍,阻礙了AFG1-DNA 的結(jié)合[30]。固定氯化鈣和AFG1的濃度為1.00×10-7mol/L 和5.31×10-7mol/L 時(shí),AFG1-DNA 結(jié)合飽和值為1.45。
如圖5c,0~1.28×10-8mol/L 時(shí),AFG1-DNA 的相互作用的共振散射峰信號(hào)強(qiáng)度逐漸增加,在濃度1.28×10-8mol/L~1.60×10-6mol/L 范圍內(nèi)變化時(shí),AFG1-DNA的相互作用的共振散射峰信號(hào)強(qiáng)度逐漸減弱。原因可能是天冬氨酸帶負(fù)電與DNA 中帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)相互排斥從而影響結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,不利于AFG1與DNA 相互作用[31]。固定L-天冬氨酸的濃度為1.28×10-8mol/L,AFG1-DNA 結(jié)合飽和值為1.29。
由圖5d 可知,葡萄糖濃度在0~6.10×10-7mol/L范圍內(nèi)變化時(shí),共振散射信號(hào)先增大后減小。原因可能是蛋白質(zhì)在體內(nèi)和體外都容易發(fā)生糖基化,與蛋白質(zhì)類似,糖基化也可能會(huì)影響DNA 的結(jié)構(gòu)。在體外,葡萄糖的羰基與DNA 中的堿基的反應(yīng)與葡萄糖的羰基和蛋白質(zhì)的氨基發(fā)生的非酶促反應(yīng)類似,破壞DNA雙鏈的完整性,使得DNA 結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,不利于AFG1與DNA 的相互作用[32]。固定葡萄糖的濃度為6.10×10-7mol/L,AFG1-DNA 結(jié)合飽和值為1.05。
圖5 氯化鈉(a)、氯化鈣(b)、L-天冬氨酸(c)、葡萄糖(d)的濃度變化對(duì)AFG1-DNA 共振散射峰強(qiáng)度的影響Fig.5 Effects of the concentration changes of sodium chloride(a),calcium chloride (b),L-aspartic acid (c) and glucose (d) on the intensity ofAFG1-DNA resonance scattering peak
2.1.2.3 尿素、亮氨酸、L-賴氨酸和維生素C 對(duì)AFG1-DNA 結(jié)合飽和值的影響
由圖6a 可知,尿素的濃度在0~3.20×10-6mol/L之間變化時(shí),隨著尿素濃度的變化,尿素溶液中的帶正電的銨根離子與DNA 堿基中帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)相互吸引,通過靜電相互作用結(jié)合,使得DNA 分子的結(jié)構(gòu)變得穩(wěn)固,有利于AFG1-DNA 的相互作用。但是當(dāng)尿素濃度逐漸變大時(shí),高濃度的尿素使得DNA 發(fā)生變性解旋。從而不利于AFG1與DNA 的相互作用。同時(shí),尿素分子存在于生物分子周圍,影響生物分子的性質(zhì)和相互作用,作為一種良好的氫鍵受體和供體,尿素不僅可以與芳香基團(tuán)發(fā)生特殊的結(jié)合,也可以與核酸堿基類似物,核甘和單磷酸核甘等模型化合物結(jié)合,并且優(yōu)先與后者模型化合物結(jié)合[33]。固定尿素的濃度為3.20×10-6mol/L,AFG1-DNA 的結(jié)合飽和值為1.95。由此可以推測(cè),適宜濃度的尿素溶液,有利AFG1-DNA 的相互作用。
圖6b 可知,在0~1.28×10-8mol/L 濃度范圍內(nèi),隨著亮氨酸的濃度的增加,對(duì)AFG1與DNA 相互作用的共振散射強(qiáng)度的影響時(shí)先增加后減弱,由曹偉娜等研究結(jié)果,我們可以推測(cè),亮氨酸與DNA 帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)發(fā)生靜電結(jié)合現(xiàn)象,DNA 分子結(jié)構(gòu)收縮,DNA 結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定[34]。當(dāng)亮氨酸的濃度不斷增加的過程中,亮氨酸的存在對(duì)DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)的構(gòu)象的影響不顯著,促進(jìn)作用不明顯。固定亮氨酸的濃度為1.28×10-8mol/L,AFG1-DNA 的結(jié)合飽和值為1.95?;谝陨戏治隹梢酝茰y(cè)亮氨酸有利于AFG1與DNA的相互作用。
圖6c 賴氨酸的濃度為0~4.00×10-7mol/L 為范圍內(nèi)變化時(shí),AFG1-DNA 的相互作用的共振散射峰信號(hào)強(qiáng)度逐漸增加,在4.00×10-7~1.00×10-5mol/L 范圍內(nèi)變化時(shí),共振散射峰信號(hào)強(qiáng)度逐漸減弱。固定賴氨酸的濃度為4.00×10-7mol/L,AFG1-DNA 的結(jié)合飽和值為2.32。原因可能是帶正電荷的賴氨酸與DNA 中帶負(fù)電的磷酸骨架相吸引,增強(qiáng)DNA 鏈剛性構(gòu)象,從而使DNA 的分子結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定。有利于AFG1與DNA 的相互作用[31]。
如圖6d 在濃度0~1.02×10-9mol/L 范圍內(nèi)時(shí),共振散射峰信號(hào)強(qiáng)度逐漸增加,在濃度1.02×10-9~3.2×10-6mol/L 范圍內(nèi)變化時(shí),共振散射峰信號(hào)強(qiáng)度逐漸減弱。固定維生素C 的濃度為1.02×10-9mol/L,AFG1-DNA 結(jié)合飽和值為2.90。原因可能是在適宜濃度下對(duì)DNA 氧化損傷有保護(hù)作用。保護(hù)了DNA 結(jié)構(gòu)的完整性,從而有利于AFG1與DNA 的結(jié)合[35]。
圖6 尿素(a)、亮氨酸(b)、賴氨酸(c)、維生素C(d)的濃度變化對(duì)AFG1-DNA 共振散射峰強(qiáng)度的影響Fig.6 Effect of the concentration changes of urea (a),leucine (b),lysine (c) and vitamin C (d) on the intensity of AFG1-DNA resonance scattering peak
在30 ℃,pH 值7.40 的條件下,添加共存物后時(shí),AFG1的結(jié)合飽和值的變化見表3。根據(jù)DNA 結(jié)合飽和值的變化可知,氯化鈉和氯化鈣、葡萄糖以及L-天冬氨酸存在時(shí),AFG1的DNA 結(jié)合飽和值小于基準(zhǔn)條件下的DNA 結(jié)合飽和值,尿素、賴氨酸、亮氨酸以及維生素C 存在時(shí),AFG1的DNA 結(jié)合飽和值大于基準(zhǔn)條件下的DNA 結(jié)合飽和值。共存物的濃度、黏度以及帶電性等因素均可能對(duì)AFG1與DNA嵌插結(jié)合產(chǎn)生影響,其中氯化鈉和氯化鈣、葡萄糖以及帶負(fù)電基團(tuán)的L-天冬氨酸不利于AFG1嵌入DNA 分子。而帶正電基團(tuán)的尿素、賴氨酸以及亮氨酸、維生素C等有利于AFG1嵌入DNA 分子。
2.2.1 DNA 用量、溫度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)AFG1去除率的影響
由圖7a 可知,AFG1的去除率逐漸增加,DNA 的用量達(dá)到2.50×10-5g/mL 時(shí),去除率為86.42%,之后去除率不再發(fā)生顯著的變化,表明吸附接近平衡。正如Hashem[36]所述,隨著DNA 用量的不斷增加,吸附位點(diǎn)的不飽和度逐漸降低,單位面積的吸附位點(diǎn)的數(shù)量相應(yīng)的也減少。此外,吸附劑的顆粒過多擁擠,導(dǎo)致吸附位點(diǎn)重疊,不能對(duì)AFG1進(jìn)行有效的吸附。
圖7 DNA 用量、溫度、反應(yīng)時(shí)間對(duì)AFG1去除率的影響Fig.7 Effects of DNA dosage,temperature,and reaction time on AFG1 removal rate
圖7b 表明,在30 ℃時(shí),去除率為87.08%,隨著溫度的升高,AFG1的吸附率逐漸減小,原因可能是隨著溫度的升高,DNA 的結(jié)構(gòu)變得松散不穩(wěn)定,不利于AFG1與DNA 的嵌插作用,從而使得AFG1從DNA中脫落下來,解吸在溶液中。
圖7c 為DNA 對(duì)AFG1的吸附率隨時(shí)間的變化情況,80 min 時(shí),AFG1的去除率達(dá)到了88.14%,80 min之后,AFG1的去除率幾乎不發(fā)生變化。吸附過程是緩慢而動(dòng)態(tài)的,初始階段AFG1快速與DNA 上的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。隨著吸附時(shí)間的延長(zhǎng),有效的吸附位點(diǎn)逐漸減少,導(dǎo)致吸附速率也隨之緩慢,表明吸附達(dá)到平衡狀態(tài)。
2.2.2 DNA 和活性炭對(duì)AFG1去除率的影響
基于AFG1與DNA 嵌插結(jié)合作用,利用DNA 吸附AFG1,并進(jìn)行了活性炭去除水中AFG1的實(shí)驗(yàn)對(duì)比,DNA 和活性炭對(duì)AFG1的吸附量見表2。DNA 對(duì)AFG1吸附量為7.54×10-3mol/g(2 180.34 mg/g),AFG1去除率為88.14%。活性炭對(duì)AFG1的吸附量為3.66×10-5mol/g(9.10 mg/g),去除率為75.67%,與傳統(tǒng)活性炭法相比,DNA 去除AFG1的效果較好,即DNA 含量?jī)H為活性炭的1/125。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,DNA能有效地去除AFG1。
表2 DNA 和活性炭吸附AFG1的效果Table 2 Effect of DNA and activated carbon on adsorption of AFG1
2.2.3 共存物對(duì)AFG1去除率的影響
通過DNA 結(jié)合飽和值的大小,預(yù)測(cè)共存物對(duì)AFG1-DNA 嵌插結(jié)合的影響,在此基礎(chǔ)上,觀察DNA吸附AFG1的效果。如表3,在30 ℃,pH 值7.40 條件下,當(dāng)DNA 用量為2.50×10-3mg 時(shí),AFG1的濃度為1.20×10-4mol/L 時(shí),AFG1的去除率為88.14%。添加共存物后,根據(jù)DNA 結(jié)合飽和值以及AFG1的去除率可知,氯化鈉、氯化鈣、L-天冬氨酸和葡萄糖不利于DNA 對(duì)AFG1的吸附,尿素、亮氨酸、賴氨酸和維生素C 有利于DNA 對(duì)AFG1的吸附。
表3 DNA 結(jié)合飽和值以及AFG1去除率Table 3 DNA binding saturation value and AFG1 removal rate
2.3.1 速率模型
準(zhǔn)一階和準(zhǔn)二階兩種動(dòng)力學(xué)模型的動(dòng)力學(xué)參數(shù)分別顯示在圖8a、8b 和表4,當(dāng)DNA 的用量為1.00、1.50、2.50 μg 時(shí),準(zhǔn)二階動(dòng)力模型的相關(guān)系數(shù)(0.997 0、0.998 8、0.999 2)均大于準(zhǔn)一階動(dòng)力學(xué)模型(0.754 3、0.689 6、0.836 9),這一結(jié)果表明:準(zhǔn)二階動(dòng)力學(xué)模型有較好的相關(guān)性。根據(jù)準(zhǔn)一階動(dòng)力學(xué)方程計(jì)算,DNA對(duì)AFG1的最大吸附量(238.65、123.46、80.38 mg/g)。而根據(jù)準(zhǔn)二階動(dòng)力學(xué)方程計(jì)算DNA對(duì)AFG1的最大吸附量(469.48、303.95、194.93 mg/g),更接近實(shí)驗(yàn)Qe的值。吸附過程更符合準(zhǔn)二階動(dòng)力學(xué)模型的描述,表明吸附過程的限速步驟為化學(xué)相互作用。
表4 不同附劑用量下準(zhǔn)一階和準(zhǔn)二階動(dòng)力模型的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 4 Kinetic parameters of pseudo-first order and pseudo-second order models under different dosage of additives
圖8 (a、b)分別為準(zhǔn)一階和準(zhǔn)二階動(dòng)力模型線性擬合圖Fig.8 (a,b) shows the linear fitting diagram of pseudo-first order and pseudo-second order model
2.3.2 等溫吸附模型
等溫吸附的平衡吸附容量為最大吸附容量。Langmuir 和Freundlich 模型的參數(shù)如表5。Freundlich模型的相關(guān)系數(shù)(0.999 9)大于Langmuir 模型的相關(guān)系數(shù)(0.974 8)。Langmuir 模型所揭示的吸附過程為單層吸附,而Freundlich 模型所揭示的吸附過程為多層吸附。根據(jù)實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果,DNA 對(duì)AFG1的吸附過程更符合Freundlich 模型,該吸附過程為多層吸附。
表5 等溫吸附模型的相關(guān)參數(shù)Table 5 Parameters of Langmuir and Freundlich isothermal adsorption models
圖9 (a)(b)分別為L(zhǎng)angmuir、Freundlich 等溫吸附模型Fig.9 (a) and (b) show Langmuir and Freundlich isothermal adsorption models respectively
2.3.3 熱力學(xué)模型
表6 可知,ΔH0(-90.33)<0,表明DNA 對(duì)AFG1的吸附是一個(gè)放熱過程。ΔS0(307.33)>0,說明體系中溶液的無(wú)序性增加,計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)自由能ΔG0<0,說明該吸附過程是能夠自發(fā)進(jìn)行的放熱反應(yīng)。
表6 不同溫度下AFG1在DNA 上吸附的熱力學(xué)參數(shù)Table 6 Thermodynamic parameters of AFG1 adsorption on DNA at different temperatures
在超市購(gòu)買的花生油中添加適量的AFG1,此時(shí)測(cè)得花生油中AFG1的含量為84.75 μg/kg,在花生油中的去除率達(dá)到了 85.25%~86.46%,殘留量在11.47~12.50 μg/kg,結(jié)果表明,利用AFG1與DNA 嵌插結(jié)合,可以去除油中的AFG1。由于花生油的產(chǎn)地和工藝的差別,AFG1的含量存在差異。測(cè)得兩個(gè)地區(qū)售賣的毛油中AFG1的濃度分別為82.70、99.01 μg/kg,去除率在 80.48%~85.45%之間。且殘留量在14.42~18.37 μg/kg 之間。Rosa 等[37]采用生物吸附的方法吸附時(shí)間為6 h 時(shí),AFG1的去除率為82.00%。杜黎等[38]通過冷等離子體處理后降解大豆油中黃曲霉毒素的去除率僅為79.65%。綜上DNA 可以有效的去除黃曲霉毒素。
表7 除去花生油中黃曲霉毒素G1Table 7 Pollution of aflatoxin G1 from different sources
本文利用DNA 嵌插原理去除AFG1,通過DNA構(gòu)建選擇性消除AFG1的方法。通過對(duì)溫度、pH 值、氯化鈉、氯化鈣、葡萄糖、維生素C 等外部因素的探究。進(jìn)一步優(yōu)化DNA 去除AFG1的條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,AFG1的濃度為5.31×10-7mol/L 時(shí),30 ℃,pH 值7.40 為AFG1嵌入DNA 分子的最佳條件,此時(shí)DNA結(jié)合飽和值為1.66 和去除率為88.14%,NaCl、CaCl2、L-天冬氨酸、葡萄糖、尿素、亮氨酸、賴氨酸、維生素C 等外部因素存在下,其DNA 結(jié)合飽和值分別為1.45、1.45、1.29、1.05、1.95、1.95、2.32 和2.90。去除率分別為78.08%、76.44%、75.92%、75.16%、88.41%、88.67%、88.87%、90.27%。根據(jù)DNA 結(jié)合飽和值以及AFG1的去除率的結(jié)果可知環(huán)境因素的濃度、黏度以及帶電性等均可能對(duì)DNA 吸附AFG1產(chǎn)生影響,其中氯化鈉和氯化鈣、葡萄糖在實(shí)驗(yàn)濃度下不利于DNA 吸附消除AFG1以及帶負(fù)電基團(tuán)的L-天冬氨酸也不利于AFG1嵌入DNA 分子。而帶正電基團(tuán)的尿素、賴氨酸以及亮氨酸、維生素C 等有利于AFG1嵌入DNA 分子,進(jìn)而對(duì)DNA 消除AFG1產(chǎn)生影響。并且通過與活性炭對(duì)比可知,當(dāng)活性炭為DNA 用量的125 倍時(shí),DNA 的去除率為88.14%,而活性炭的去除率為75.67%仍低于DNA 的去除效率,所以DNA能較好的去除AFG1。影響吸附過程的原因除了以上環(huán)境因素外,與DNA 用量、溫度以及反應(yīng)時(shí)間有關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在30 ℃、DNA 用量為2.50×10-5g/mL時(shí),DNA 吸附AFG1在80 min 時(shí)接近平衡,AFG1去除率為88.14%。通過動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)和熱力學(xué)參數(shù)的結(jié)果可知,得出DNA 對(duì)AFG1的吸附過程符合準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型,表明吸附過程的限速步驟為化學(xué)相互作用。Langmuir(R2=0.974 8)和Freundlich(R2=0.999 9)等溫吸附模型擬合結(jié)果表明吸附過程更加符合Freundlich 模型,該吸附過程為多層吸附。熱力學(xué)模型擬合參數(shù)顯示該過程是自發(fā)進(jìn)行的放熱過程。去除花生油中的AFG1,其去除率在80.48%~86.46%。殘留量在11.00~18.37 μg/kg。本文對(duì)DNA 吸附消除黃曲霉毒素G1進(jìn)行了初步探索。有望應(yīng)用于DNA 固定化的研究,將DNA 與絲素纖維、絲素蛋白交聯(lián)構(gòu)建DNA固定化材料,進(jìn)一步消除AFG1。