馬瓊，李軍生，黃國(guó)霞，閻柳娟，馬紀(jì)

（廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西柳州 545006）

黃曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）是由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的雙呋喃環(huán)類毒素。衍生物約有20 多種，具有極強(qiáng)的致畸性、致癌性和致突變性，對(duì)肺部、肝臟、神經(jīng)系統(tǒng)等器官具有極強(qiáng)的毒性[1]。1993 年，黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織癌癥研究機(jī)構(gòu)列為一類致癌物，常見(jiàn)的黃曲霉毒素（B1、B2、G1、G2），AFG1的毒性僅次于AFB1[2,3]。玉米、花生、大豆等農(nóng)作物在種植、收獲、儲(chǔ)藏、加工等過(guò)程中易滋生毒素。常采用物理、化學(xué)、生物等傳統(tǒng)方法去除黃曲霉毒素[4-8]。雖然吸附、熱處理、萃取等物理方法可以去除黃曲霉毒素，但存在去除效率較低、成本高、對(duì)溫度的要求較高等問(wèn)題。經(jīng)酸堿、氧化還原等化學(xué)方法處理易產(chǎn)生副產(chǎn)物以及殘留試劑，導(dǎo)致二次污染。生物方法主要采用微生物或其產(chǎn)生的酶及其制劑來(lái)對(duì)黃曲霉毒素進(jìn)行去除，過(guò)程中有可能產(chǎn)生新的有毒物質(zhì)。所以研究一種高效去除黃曲霉毒素的方法十分必要。DNA 是生物體內(nèi)主要的遺傳物質(zhì)，廣泛存在于自然界中，具有極高的生物安全性。黃曲霉毒素屬呋喃香豆素的衍生物，是一類典型DNA 嵌入劑分子，因此，通過(guò)生物安全的DNA 選擇性主動(dòng)俘獲消除黃曲霉毒素的創(chuàng)新構(gòu)想，正好為更加安全高效地消除黃曲霉毒素提供了新思路和借鑒。

DNA 主要由含氮堿基、戊糖和磷酸骨架組成，具有獨(dú)特的雙螺旋結(jié)構(gòu)，對(duì)許多平面芳香結(jié)構(gòu)的化合物具有很好的親和力[9]。1961 年，Lerman[10]發(fā)現(xiàn)吖啶分子可以通過(guò)疏水作用、氫鍵、離子相互作用、范德華力等非共價(jià)作用方式嵌入DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)中。類似吖啶的多環(huán)小分子化合物能與DNA 通過(guò)非共價(jià)相互作用嵌入DNA 堿基對(duì)之間并與之形成嵌插復(fù)合物，諸如吖啶、溴化乙錠、道諾霉素以及蒽醌類復(fù)合物等多環(huán)類化合物[11-13]，通過(guò)對(duì)這些多環(huán)類化合物的深入研究，構(gòu)建了成熟的DNA 嵌入理論。利用嵌入劑所具有的嵌入性質(zhì)，可以設(shè)計(jì)出高效的DNA 嵌入劑，用于選擇性去除有害的多環(huán)類化合物。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)共振散射光譜對(duì)AFB1、多環(huán)芳烴、茜草色素光澤汀以及大黃素等多種平面小分子與DNA 的相互作用進(jìn)行研究[14-18]。依據(jù)DNA 嵌入理論設(shè)計(jì)的一系列新型吸附材料，如磁珠負(fù)載DNA、DNA 凝膠珠、DNA 組裝的聚砜顆粒等DNA 嵌插材料[19-21]，用以選擇性去除溴化乙錠、多環(huán)芳烴、吖啶橙等有害物質(zhì)。

紫外光譜、共振散射光譜、圓二色譜等實(shí)驗(yàn)已經(jīng)充分證明AFG1與DNA之間的相互作用是典型嵌插結(jié)合模式[22]。為此，本文首先通過(guò)共振散射光譜檢測(cè)AFG1的DNA 結(jié)合飽和值，并通過(guò)AFG1的DNA 結(jié)合飽和值進(jìn)一步評(píng)價(jià)AFG1嵌入DNA 分子的能力大小。然后，再通過(guò)檢測(cè)AFG1的DNA 結(jié)合飽和值變化，揭示溫度、pH、氯化鈉、氯化鈣、L-天冬氨酸、葡萄糖、尿素、亮氨酸、賴氨酸等外部因素的變化對(duì)AFG1嵌入DNA 分子能力的影響，據(jù)此構(gòu)建和進(jìn)一步優(yōu)化DNA 選擇性吸附消除AFG1的有效方法。最后通過(guò)吸附動(dòng)力學(xué)、等溫吸附模型以及吸附熱力學(xué)等進(jìn)一步探究DNA 選擇性吸附AFG1過(guò)程，為探索構(gòu)建一種新型高效去除黃曲霉毒素的方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

AFG1（Pribolab 公司）溶液的配制：利用適量的φ=98%無(wú)水乙醇溶解AFG1粉末后用Tris-HCl 緩沖溶液稀釋至所需濃度待用。DNA（Solarbio Science 公司）溶液的配制：超純水溶解DNA 粉末，于0～4 ℃下保存，其純度以260 nm 與280 nm 吸光度的比值檢測(cè)（A260nm/A280nm=1.87＞1.8，符合試驗(yàn)要求），由公式C=A/εL（ε＝6 600 L/(mol·cm)）確定濃度?；钚蕴康呐渲疲喝?.25 mg 活性炭用Tris-HCl 浸泡活化一段時(shí)間稀釋待用。Tris-HCl 緩沖液的配制：按照不同比例將0.1 mol/L Tris（三羥甲基氨基甲烷）與0.1 mol/L HCl溶液混合配制成一系列的緩沖液待用。環(huán)境共存物的配制：環(huán)境共存物均以0.1 mol/L 配制稀釋成所需濃度待用。綁定液的配制：按比例將0.01 mol/L Tris-HCl（pH 值8.0）與0.001 mol/L EDTA 配制成綁定液待用。磁珠，富生物科技有限公司。

熒光分光光度計(jì)，Cary Eclipse Agilent；紫外分光光度計(jì)，Cary 60 Agilent Technologies；DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；恒溫振蕩器，IS-RDV3 CRYSTAL；TGL-16G 高速離心機(jī)，上海市安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 DNA 結(jié)合飽和值

1.2.1 共振散射光譜與DNA 結(jié)合飽和值檢測(cè)

在30 ℃條件下，首先向1.0×1.0 cm 的石英比色皿中加入2 mL 的AFG1溶液（pH 值為7.40，5.31×10-7mol/L）待溶液穩(wěn)定時(shí)于熒光分光光度計(jì)上進(jìn)行同步掃描并記錄。隨后每次滴加10 μL DNA 溶液于AFG1溶液，充分混勻后靜置10 min 掃描共振光散射光譜，當(dāng)溶液共振光散射強(qiáng)度不再發(fā)生變化時(shí)，此時(shí)達(dá)到飽和，根據(jù)公式計(jì)算DNA 結(jié)合飽和值。

1.2.2 環(huán)境因素對(duì)AFG1-DNA結(jié)合飽和值的效果

向試管中分別加入0.5 mL AFG1、0.5 mL DNA、1 mL 環(huán)境因素、1 mL pH 值7.40 的Tris-HCl 緩沖液，經(jīng)恒溫振蕩器搖勻，靜置5 min 待溶液穩(wěn)定后，掃描并記錄共振散射光譜。選擇對(duì)AFG1-DNA 影響最大的共振散射強(qiáng)度對(duì)應(yīng)的環(huán)境因素的濃度，測(cè)定DNA 結(jié)合飽和值。

1.3 吸附因素對(duì)AFG1去除率計(jì)算

1.3.1 AFG1標(biāo)準(zhǔn)曲線

以不同濃度的AFG1為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，繪制出AFG1的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1。

圖1 熒光光譜測(cè)定AFG1的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve for determination of AFG1 by fluorescence spectroscopy

1.3.2 DNA 和活性炭在去除AFG1效果的比較

首先將100 μL AFG1和100 μL DNA 混勻后在30 ℃下反應(yīng)10 min、隨后依次加入100 μL 磁珠、200 μL 綁定液等放置于EP 管內(nèi)，搖勻，然后放置于恒溫振蕩器中反應(yīng)60 min，用磁鐵分離上清液，經(jīng)離心后，掃描上清液的熒光光譜（Ex=370 nm；掃描范圍：220～600 nm；掃描速度：快；Ex silt=10 nm；Em silt=10 nm）并記錄。代入標(biāo)準(zhǔn)曲線（熒光強(qiáng)度與AFG1濃度的線性曲線）求出Ct。其中，AFG1與DNA結(jié)合的量由AFG1吸附量（Q）和AFG1去除率（%）確定，其計(jì)算公式如下[23]。將活性炭替代DNA 做類似處理，其中活性炭在pH 值為7.40 的Tris-HCl 緩沖液中活化一段時(shí)間后，加入AFG1溶液反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)條件以及計(jì)算方法同DNA。

式中：

Q——吸附劑的吸附容量，mg/g；

F——AFG1去除率，%；

C0——AFG1的初始濃度，mol/L；

Ct——AFG1的平衡濃度，mol/L；

V——溶液體積，L；

m——吸附劑的質(zhì)量，g。

1.3.3 共存物對(duì)AFG1去除率的效果

向EP 管內(nèi)分別加入100 μL AFG1溶液、100 μL DNA 溶液、100 μL 磁珠、100 μL 環(huán)境因素、200 μL綁定液，其操作條件以及方法同1.3.2，計(jì)算共存物對(duì)AFG1去除率。

1.4 DNA 對(duì)AFG1吸附行為的研究

1.4.1 速率模型

吸附動(dòng)力學(xué)描述了吸附劑的吸附速率。測(cè)定不同時(shí)間下每單位質(zhì)量的吸附劑的吸附量，常用Pseudo-first Order Kinetics 模型（3）和Pseudo-second Order Kinetics 模型（4）來(lái)描述。用線性公式表示如下[24]：

式中：

Qe——平衡時(shí)每單位質(zhì)量的吸附劑的吸附質(zhì)量，mg/g；

Qt——在t時(shí)刻每單位質(zhì)量的吸附劑的吸附質(zhì)量，mg/g；

t——時(shí)間，min；

K1——準(zhǔn)一階吸附速率常數(shù)，1/min；

K2——準(zhǔn)二階吸附速率常數(shù)，g/(mg·min)。

1.4.2 等溫吸附模型

用Langmuir 和Freundlich 吸附等溫線來(lái)分析等溫吸附過(guò)程[24]，評(píng)價(jià)吸附劑的吸附特性、吸附容量和表面性質(zhì)。Langmuir 和Freundlich 等溫線的一般形式由式（5）、（6）給出。

式中：

Qe——單位重量吸附劑對(duì)AFG1的吸附量，mg/g；

Qmax——AFG1的最大吸附量，mg/g；

Ce——達(dá)到吸附平衡時(shí)對(duì)AFG1的吸附量，mg/g；

KL——與吸附能相關(guān)的Langmuir 常數(shù)，L/mg；

Kf——Freundlich 常數(shù)，mg/g；

1/n——吸附劑表面的不均勻程度。

1.4.3 熱力學(xué)模型

在30、35、40、45 和50 ℃的溫度下，分析吸附熱過(guò)程。利用Vant Hoff 方程（7）～（9）[25]確定吸附過(guò)程的ΔH0和ΔS0。

式中：

K——吸附分布常數(shù)；

ΔH0——焓變；

ΔS0——熵變；

T——開(kāi)爾文溫度；

R——?dú)怏w常數(shù)8.314 J/(K·mol)；

ΔH0——由斜率計(jì)算；

ΔS0——由lnK和1/T擬合的曲線（9）的截距計(jì)算。

1.5 去除花生油中的AFG1

向花生油樣品中加入適量AFG1標(biāo)準(zhǔn)液，得到AFG1濃度為84.75 μg/L 的花生油樣品。用DNA（25.00×10-3μg/mL）吸附去除污染花生油中的AFG1。在最佳吸附溫度和吸附時(shí)間下，加入磁珠，反應(yīng)80 min，經(jīng)磁鐵分離磁珠，洗脫后萃取，然后用熒光光譜法測(cè)定洗脫液中AFG1的熒光強(qiáng)度。AFG1濃度的計(jì)算方法同1.3。

1.6 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)中采用Excel 2016 以及SPSS 19.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，采用Origin 2018 繪制分析圖以及模型擬合的分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA 結(jié)合飽和值

2.1.1 DNA 結(jié)合飽和值的檢測(cè)

DNA 結(jié)合飽和值可以用來(lái)評(píng)價(jià)平面小分子與DNA 嵌插結(jié)合能力的大小。平面小分子與DNA 分子的結(jié)合的位點(diǎn)和數(shù)量是確定的，其結(jié)構(gòu)決定了嵌入DNA 的能力強(qiáng)弱。當(dāng)平面小分子的濃度過(guò)量時(shí)，共振光散射信號(hào)隨著DNA 濃度的增加而增強(qiáng)。然而，當(dāng)DNA 濃度達(dá)到極限時(shí)，即使DNA 濃度增加，共振散射信號(hào)也不再增加。此時(shí)的DNA 濃度為飽和DNA 濃度（計(jì)算公式如（10））。圖2 可知，在30 ℃，pH 值7.4 條件下，當(dāng)AFG1的濃度一定時(shí)，隨著DNA 濃度的增加，共振散射信號(hào)也逐漸增加，但是當(dāng)DNA 的濃度達(dá)到3.19×10-7mol/L，共振散射峰信號(hào)強(qiáng)度不再增強(qiáng)。此時(shí)，認(rèn)為AFG1與DNA 的結(jié)合達(dá)到飽和，DNA 結(jié)合飽和值為1.66。溴化乙錠和補(bǔ)骨脂素是非常典型的DNA 嵌入劑，實(shí)驗(yàn)室前期人員還對(duì)溴化乙錠、黃曲霉毒素B1、補(bǔ)骨脂素的DNA 結(jié)合飽和值（表1）進(jìn)行了測(cè)定。從表中可以看出AFG1與DNA 的結(jié)合和飽和值小于溴化乙錠和AFB1的結(jié)合飽和值，但是大于補(bǔ)骨脂素的DNA 的結(jié)合飽和值。所以，AFG1與DNA的結(jié)合能力小于溴化乙錠和AFB1，大于補(bǔ)骨脂素。

表1 不同試劑與DNA 相互作用的DNA 結(jié)合飽和值Table 1 DNA binding saturation values of interaction between different reagents and DNA

圖2 DNA 濃度對(duì)AFG1-DNA 共振散射光譜的影響Fig.2 Effect of DNA concentration on resonance scattering spectra of AFG1-DNA

式中：

Z——DNA 結(jié)合飽和值（BSV）；

Cm——平面小分子的濃度，mol/L；

Cn——飽和DNA 的濃度，mol/L。

2.1.2 環(huán)境因素對(duì)AFG1-DNA結(jié)合飽和值的影響

2.1.2.1 溫度和pH 對(duì)AFG1-DNA 結(jié)合飽和值的影響

由圖3a 可知，隨著溫度的升高，信號(hào)強(qiáng)度先增大后下降，開(kāi)始時(shí)分子與分子之間的相對(duì)運(yùn)動(dòng)加快。30 ℃時(shí)，共振散射峰信號(hào)強(qiáng)度最大，溫度的升高，DNA雙鏈?zhǔn)軣峤庑?，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，不利于AFG1-DNA 結(jié)合。25 ℃、30 ℃以及35 ℃的飽和值分別為1.38、1.66、1.23。30 ℃時(shí)飽和值最大，AFG1-DNA 的結(jié)合能力最強(qiáng)，因此30 ℃為AFG1-DNA 的相互作用的適宜溫度[27]。

圖3 (a)溫度對(duì)AFG1-DNA 共振散射峰信號(hào)的影響，(b)不同DNA濃度下對(duì)AFG1-DNA 的共振散射強(qiáng)度的影響Fig.3 (a) Effect of temperature on the resonance scattering peak intensity of AFG1-DNA;(b) Effect of DNA concentration on resonance scattering intensity (p<0.05)

圖4 為pH 值對(duì)AFG1-DNA 嵌插結(jié)合的影響，在pH 值5.80～7.40 之間，體系溶液呈現(xiàn)酸性，共振散射峰信號(hào)強(qiáng)度逐漸增大，DNA 雙鏈中的氫鍵在酸性條件下，不穩(wěn)定且易斷裂，同時(shí)溶液中的氫離子與DNA 中帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)相互吸引，大量的氫離子聚集在DNA 堿基周圍，阻礙了AFG1與DNA 相互結(jié)合。在pH 值7.40～9.00 之間，體系溶液呈現(xiàn)堿性，使得DNA 變性解旋，導(dǎo)致AFG1與DNA 相互結(jié)合的部位減少，共振散射峰信號(hào)逐漸減弱[28]。在pH 值5.80、7.40 和9.00 的條件下，AFG1-DNA 結(jié)合飽和值分別為1.47、1.66、1.65，pH 值7.40 時(shí)，AFG1-DNA 結(jié)合飽和值最大，因此，pH 值7.40 為AFG1-DNA 的相互作用的適宜pH 值。

圖4 pH 對(duì)AFG1-DNA 共振散射峰信號(hào)的影響Fig.4 Effect of pH on resonance scattering peak signal of AFG1-DNA (p<0.05)

2.1.2.2 氯化鈉、氯化鈣、L-天冬氨酸和葡萄糖對(duì)AFG1-DNA 結(jié)合飽和值的影響

圖5a 中，NaCl 的濃度在0～1.00×10-5mol/L 之間時(shí)，AFG1-DNA 共振散射峰信號(hào)先增大后減小。原因可能是由于在低離子強(qiáng)度時(shí)鈉離子與DNA 中帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)反應(yīng)，靜電相互吸引從而有利于AFG1-DNA 的相互作用，隨著離子強(qiáng)度的增加，DNA斷裂，破壞了DNA 分子的穩(wěn)定性，DNA 的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[29]。固定氯化鈉和 AFG1的濃度分別為1.00×10-5mol/L 和5.31×10-7mol/L 時(shí)，AFG1-DNA 結(jié)合飽和值為1.45。

圖5b 所示，0～1.00×10-7mol/L 之間，隨著鈣離子濃度的增加，遂導(dǎo)致AFG1-DNA 的共振散射峰信號(hào)強(qiáng)度增加，鈣離子對(duì)磷酸鹽有高化學(xué)親和性，不是在DNA 表面簡(jiǎn)單的縮合，而是在DNA 堿基中的磷酸基團(tuán)點(diǎn)狀吸附，逐漸聚集在 D N A 的周圍。在1.00×10-7mol/L～1.00×10-4mol/L 范圍內(nèi)，隨著鈣離子濃度的增加，體系溶液富含大量鈣離子，鈣離子與DNA 的這種極化效應(yīng)不會(huì)一直增加，所以，AFG1-DNA 的共振散射峰信號(hào)強(qiáng)度減弱。由于鈣離子吸附在DNA 的周圍，阻礙了AFG1-DNA 的結(jié)合[30]。固定氯化鈣和AFG1的濃度為1.00×10-7mol/L 和5.31×10-7mol/L 時(shí)，AFG1-DNA 結(jié)合飽和值為1.45。

如圖5c，0～1.28×10-8mol/L 時(shí)，AFG1-DNA 的相互作用的共振散射峰信號(hào)強(qiáng)度逐漸增加，在濃度1.28×10-8mol/L～1.60×10-6mol/L 范圍內(nèi)變化時(shí)，AFG1-DNA的相互作用的共振散射峰信號(hào)強(qiáng)度逐漸減弱。原因可能是天冬氨酸帶負(fù)電與DNA 中帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)相互排斥從而影響結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，不利于AFG1與DNA 相互作用[31]。固定L-天冬氨酸的濃度為1.28×10-8mol/L，AFG1-DNA 結(jié)合飽和值為1.29。

由圖5d 可知，葡萄糖濃度在0～6.10×10-7mol/L范圍內(nèi)變化時(shí)，共振散射信號(hào)先增大后減小。原因可能是蛋白質(zhì)在體內(nèi)和體外都容易發(fā)生糖基化，與蛋白質(zhì)類似，糖基化也可能會(huì)影響DNA 的結(jié)構(gòu)。在體外，葡萄糖的羰基與DNA 中的堿基的反應(yīng)與葡萄糖的羰基和蛋白質(zhì)的氨基發(fā)生的非酶促反應(yīng)類似，破壞DNA雙鏈的完整性，使得DNA 結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，不利于AFG1與DNA 的相互作用[32]。固定葡萄糖的濃度為6.10×10-7mol/L，AFG1-DNA 結(jié)合飽和值為1.05。

圖5 氯化鈉（a）、氯化鈣（b）、L-天冬氨酸（c）、葡萄糖（d）的濃度變化對(duì)AFG1-DNA 共振散射峰強(qiáng)度的影響Fig.5 Effects of the concentration changes of sodium chloride(a),calcium chloride (b),L-aspartic acid (c) and glucose (d) on the intensity ofAFG1-DNA resonance scattering peak

2.1.2.3 尿素、亮氨酸、L-賴氨酸和維生素C 對(duì)AFG1-DNA 結(jié)合飽和值的影響

由圖6a 可知，尿素的濃度在0～3.20×10-6mol/L之間變化時(shí)，隨著尿素濃度的變化，尿素溶液中的帶正電的銨根離子與DNA 堿基中帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)相互吸引，通過(guò)靜電相互作用結(jié)合，使得DNA 分子的結(jié)構(gòu)變得穩(wěn)固，有利于AFG1-DNA 的相互作用。但是當(dāng)尿素濃度逐漸變大時(shí)，高濃度的尿素使得DNA 發(fā)生變性解旋。從而不利于AFG1與DNA 的相互作用。同時(shí)，尿素分子存在于生物分子周圍，影響生物分子的性質(zhì)和相互作用，作為一種良好的氫鍵受體和供體，尿素不僅可以與芳香基團(tuán)發(fā)生特殊的結(jié)合，也可以與核酸堿基類似物，核甘和單磷酸核甘等模型化合物結(jié)合，并且優(yōu)先與后者模型化合物結(jié)合[33]。固定尿素的濃度為3.20×10-6mol/L，AFG1-DNA 的結(jié)合飽和值為1.95。由此可以推測(cè)，適宜濃度的尿素溶液，有利AFG1-DNA 的相互作用。

圖6b 可知，在0～1.28×10-8mol/L 濃度范圍內(nèi)，隨著亮氨酸的濃度的增加，對(duì)AFG1與DNA 相互作用的共振散射強(qiáng)度的影響時(shí)先增加后減弱，由曹偉娜等研究結(jié)果，我們可以推測(cè)，亮氨酸與DNA 帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)發(fā)生靜電結(jié)合現(xiàn)象，DNA 分子結(jié)構(gòu)收縮，DNA 結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定[34]。當(dāng)亮氨酸的濃度不斷增加的過(guò)程中，亮氨酸的存在對(duì)DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)的構(gòu)象的影響不顯著，促進(jìn)作用不明顯。固定亮氨酸的濃度為1.28×10-8mol/L，AFG1-DNA 的結(jié)合飽和值為1.95?；谝陨戏治隹梢酝茰y(cè)亮氨酸有利于AFG1與DNA的相互作用。

圖6c 賴氨酸的濃度為0～4.00×10-7mol/L 為范圍內(nèi)變化時(shí)，AFG1-DNA 的相互作用的共振散射峰信號(hào)強(qiáng)度逐漸增加，在4.00×10-7～1.00×10-5mol/L 范圍內(nèi)變化時(shí)，共振散射峰信號(hào)強(qiáng)度逐漸減弱。固定賴氨酸的濃度為4.00×10-7mol/L，AFG1-DNA 的結(jié)合飽和值為2.32。原因可能是帶正電荷的賴氨酸與DNA 中帶負(fù)電的磷酸骨架相吸引，增強(qiáng)DNA 鏈剛性構(gòu)象，從而使DNA 的分子結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定。有利于AFG1與DNA 的相互作用[31]。

如圖6d 在濃度0～1.02×10-9mol/L 范圍內(nèi)時(shí)，共振散射峰信號(hào)強(qiáng)度逐漸增加，在濃度1.02×10-9～3.2×10-6mol/L 范圍內(nèi)變化時(shí)，共振散射峰信號(hào)強(qiáng)度逐漸減弱。固定維生素C 的濃度為1.02×10-9mol/L，AFG1-DNA 結(jié)合飽和值為2.90。原因可能是在適宜濃度下對(duì)DNA 氧化損傷有保護(hù)作用。保護(hù)了DNA 結(jié)構(gòu)的完整性，從而有利于AFG1與DNA 的結(jié)合[35]。

圖6 尿素（a）、亮氨酸（b）、賴氨酸（c）、維生素C（d）的濃度變化對(duì)AFG1-DNA 共振散射峰強(qiáng)度的影響Fig.6 Effect of the concentration changes of urea (a),leucine (b),lysine (c) and vitamin C (d) on the intensity of AFG1-DNA resonance scattering peak

在30 ℃，pH 值7.40 的條件下，添加共存物后時(shí)，AFG1的結(jié)合飽和值的變化見(jiàn)表3。根據(jù)DNA 結(jié)合飽和值的變化可知，氯化鈉和氯化鈣、葡萄糖以及L-天冬氨酸存在時(shí)，AFG1的DNA 結(jié)合飽和值小于基準(zhǔn)條件下的DNA 結(jié)合飽和值，尿素、賴氨酸、亮氨酸以及維生素C 存在時(shí)，AFG1的DNA 結(jié)合飽和值大于基準(zhǔn)條件下的DNA 結(jié)合飽和值。共存物的濃度、黏度以及帶電性等因素均可能對(duì)AFG1與DNA嵌插結(jié)合產(chǎn)生影響，其中氯化鈉和氯化鈣、葡萄糖以及帶負(fù)電基團(tuán)的L-天冬氨酸不利于AFG1嵌入DNA 分子。而帶正電基團(tuán)的尿素、賴氨酸以及亮氨酸、維生素C等有利于AFG1嵌入DNA 分子。

2.2 影響DNA 對(duì)AFG1吸附的因素分析

2.2.1 DNA 用量、溫度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)AFG1去除率的影響

由圖7a 可知，AFG1的去除率逐漸增加，DNA 的用量達(dá)到2.50×10-5g/mL 時(shí)，去除率為86.42%，之后去除率不再發(fā)生顯著的變化，表明吸附接近平衡。正如Hashem[36]所述，隨著DNA 用量的不斷增加，吸附位點(diǎn)的不飽和度逐漸降低，單位面積的吸附位點(diǎn)的數(shù)量相應(yīng)的也減少。此外，吸附劑的顆粒過(guò)多擁擠，導(dǎo)致吸附位點(diǎn)重疊，不能對(duì)AFG1進(jìn)行有效的吸附。

圖7 DNA 用量、溫度、反應(yīng)時(shí)間對(duì)AFG1去除率的影響Fig.7 Effects of DNA dosage,temperature,and reaction time on AFG1 removal rate

圖7b 表明，在30 ℃時(shí)，去除率為87.08%，隨著溫度的升高，AFG1的吸附率逐漸減小，原因可能是隨著溫度的升高，DNA 的結(jié)構(gòu)變得松散不穩(wěn)定，不利于AFG1與DNA 的嵌插作用，從而使得AFG1從DNA中脫落下來(lái)，解吸在溶液中。

圖7c 為DNA 對(duì)AFG1的吸附率隨時(shí)間的變化情況，80 min 時(shí)，AFG1的去除率達(dá)到了88.14%，80 min之后，AFG1的去除率幾乎不發(fā)生變化。吸附過(guò)程是緩慢而動(dòng)態(tài)的，初始階段AFG1快速與DNA 上的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。隨著吸附時(shí)間的延長(zhǎng)，有效的吸附位點(diǎn)逐漸減少，導(dǎo)致吸附速率也隨之緩慢，表明吸附達(dá)到平衡狀態(tài)。

2.2.2 DNA 和活性炭對(duì)AFG1去除率的影響

基于AFG1與DNA 嵌插結(jié)合作用，利用DNA 吸附AFG1，并進(jìn)行了活性炭去除水中AFG1的實(shí)驗(yàn)對(duì)比，DNA 和活性炭對(duì)AFG1的吸附量見(jiàn)表2。DNA 對(duì)AFG1吸附量為7.54×10-3mol/g（2 180.34 mg/g），AFG1去除率為88.14%。活性炭對(duì)AFG1的吸附量為3.66×10-5mol/g（9.10 mg/g），去除率為75.67%，與傳統(tǒng)活性炭法相比，DNA 去除AFG1的效果較好，即DNA 含量?jī)H為活性炭的1/125。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DNA能有效地去除AFG1。

表2 DNA 和活性炭吸附AFG1的效果Table 2 Effect of DNA and activated carbon on adsorption of AFG1

2.2.3 共存物對(duì)AFG1去除率的影響

通過(guò)DNA 結(jié)合飽和值的大小，預(yù)測(cè)共存物對(duì)AFG1-DNA 嵌插結(jié)合的影響，在此基礎(chǔ)上，觀察DNA吸附AFG1的效果。如表3，在30 ℃，pH 值7.40 條件下，當(dāng)DNA 用量為2.50×10-3mg 時(shí)，AFG1的濃度為1.20×10-4mol/L 時(shí)，AFG1的去除率為88.14%。添加共存物后，根據(jù)DNA 結(jié)合飽和值以及AFG1的去除率可知，氯化鈉、氯化鈣、L-天冬氨酸和葡萄糖不利于DNA 對(duì)AFG1的吸附，尿素、亮氨酸、賴氨酸和維生素C 有利于DNA 對(duì)AFG1的吸附。

表3 DNA 結(jié)合飽和值以及AFG1去除率Table 3 DNA binding saturation value and AFG1 removal rate

2.3 DNA 對(duì)AFG1吸附行為的研究

2.3.1 速率模型

準(zhǔn)一階和準(zhǔn)二階兩種動(dòng)力學(xué)模型的動(dòng)力學(xué)參數(shù)分別顯示在圖8a、8b 和表4，當(dāng)DNA 的用量為1.00、1.50、2.50 μg 時(shí)，準(zhǔn)二階動(dòng)力模型的相關(guān)系數(shù)（0.997 0、0.998 8、0.999 2）均大于準(zhǔn)一階動(dòng)力學(xué)模型（0.754 3、0.689 6、0.836 9），這一結(jié)果表明：準(zhǔn)二階動(dòng)力學(xué)模型有較好的相關(guān)性。根據(jù)準(zhǔn)一階動(dòng)力學(xué)方程計(jì)算，DNA對(duì)AFG1的最大吸附量（238.65、123.46、80.38 mg/g）。而根據(jù)準(zhǔn)二階動(dòng)力學(xué)方程計(jì)算DNA對(duì)AFG1的最大吸附量（469.48、303.95、194.93 mg/g），更接近實(shí)驗(yàn)Qe的值。吸附過(guò)程更符合準(zhǔn)二階動(dòng)力學(xué)模型的描述，表明吸附過(guò)程的限速步驟為化學(xué)相互作用。

表4 不同附劑用量下準(zhǔn)一階和準(zhǔn)二階動(dòng)力模型的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 4 Kinetic parameters of pseudo-first order and pseudo-second order models under different dosage of additives

圖8 （a、b）分別為準(zhǔn)一階和準(zhǔn)二階動(dòng)力模型線性擬合圖Fig.8 (a,b) shows the linear fitting diagram of pseudo-first order and pseudo-second order model

2.3.2 等溫吸附模型

等溫吸附的平衡吸附容量為最大吸附容量。Langmuir 和Freundlich 模型的參數(shù)如表5。Freundlich模型的相關(guān)系數(shù)（0.999 9）大于Langmuir 模型的相關(guān)系數(shù)（0.974 8）。Langmuir 模型所揭示的吸附過(guò)程為單層吸附，而Freundlich 模型所揭示的吸附過(guò)程為多層吸附。根據(jù)實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果，DNA 對(duì)AFG1的吸附過(guò)程更符合Freundlich 模型，該吸附過(guò)程為多層吸附。

表5 等溫吸附模型的相關(guān)參數(shù)Table 5 Parameters of Langmuir and Freundlich isothermal adsorption models

圖9 （a）（b）分別為L(zhǎng)angmuir、Freundlich 等溫吸附模型Fig.9 (a) and (b) show Langmuir and Freundlich isothermal adsorption models respectively

2.3.3 熱力學(xué)模型

表6 可知，ΔH0（-90.33）＜0，表明DNA 對(duì)AFG1的吸附是一個(gè)放熱過(guò)程。ΔS0（307.33）＞0，說(shuō)明體系中溶液的無(wú)序性增加，計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)自由能ΔG0＜0，說(shuō)明該吸附過(guò)程是能夠自發(fā)進(jìn)行的放熱反應(yīng)。

表6 不同溫度下AFG1在DNA 上吸附的熱力學(xué)參數(shù)Table 6 Thermodynamic parameters of AFG1 adsorption on DNA at different temperatures

2.4 除去花生油中的AFG1

在超市購(gòu)買的花生油中添加適量的AFG1，此時(shí)測(cè)得花生油中AFG1的含量為84.75 μg/kg，在花生油中的去除率達(dá)到了 85.25%～86.46%，殘留量在11.47～12.50 μg/kg，結(jié)果表明，利用AFG1與DNA 嵌插結(jié)合，可以去除油中的AFG1。由于花生油的產(chǎn)地和工藝的差別，AFG1的含量存在差異。測(cè)得兩個(gè)地區(qū)售賣的毛油中AFG1的濃度分別為82.70、99.01 μg/kg，去除率在 80.48%～85.45%之間。且殘留量在14.42～18.37 μg/kg 之間。Rosa 等[37]采用生物吸附的方法吸附時(shí)間為6 h 時(shí)，AFG1的去除率為82.00%。杜黎等[38]通過(guò)冷等離子體處理后降解大豆油中黃曲霉毒素的去除率僅為79.65%。綜上DNA 可以有效的去除黃曲霉毒素。

表7 除去花生油中黃曲霉毒素G1Table 7 Pollution of aflatoxin G1 from different sources

3 結(jié)論

本文利用DNA 嵌插原理去除AFG1，通過(guò)DNA構(gòu)建選擇性消除AFG1的方法。通過(guò)對(duì)溫度、pH 值、氯化鈉、氯化鈣、葡萄糖、維生素C 等外部因素的探究。進(jìn)一步優(yōu)化DNA 去除AFG1的條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AFG1的濃度為5.31×10-7mol/L 時(shí)，30 ℃，pH 值7.40 為AFG1嵌入DNA 分子的最佳條件，此時(shí)DNA結(jié)合飽和值為1.66 和去除率為88.14%，NaCl、CaCl2、L-天冬氨酸、葡萄糖、尿素、亮氨酸、賴氨酸、維生素C 等外部因素存在下，其DNA 結(jié)合飽和值分別為1.45、1.45、1.29、1.05、1.95、1.95、2.32 和2.90。去除率分別為78.08%、76.44%、75.92%、75.16%、88.41%、88.67%、88.87%、90.27%。根據(jù)DNA 結(jié)合飽和值以及AFG1的去除率的結(jié)果可知環(huán)境因素的濃度、黏度以及帶電性等均可能對(duì)DNA 吸附AFG1產(chǎn)生影響，其中氯化鈉和氯化鈣、葡萄糖在實(shí)驗(yàn)濃度下不利于DNA 吸附消除AFG1以及帶負(fù)電基團(tuán)的L-天冬氨酸也不利于AFG1嵌入DNA 分子。而帶正電基團(tuán)的尿素、賴氨酸以及亮氨酸、維生素C 等有利于AFG1嵌入DNA 分子，進(jìn)而對(duì)DNA 消除AFG1產(chǎn)生影響。并且通過(guò)與活性炭對(duì)比可知，當(dāng)活性炭為DNA 用量的125 倍時(shí)，DNA 的去除率為88.14%，而活性炭的去除率為75.67%仍低于DNA 的去除效率，所以DNA能較好的去除AFG1。影響吸附過(guò)程的原因除了以上環(huán)境因素外，與DNA 用量、溫度以及反應(yīng)時(shí)間有關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在30 ℃、DNA 用量為2.50×10-5g/mL時(shí)，DNA 吸附AFG1在80 min 時(shí)接近平衡，AFG1去除率為88.14%。通過(guò)動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)和熱力學(xué)參數(shù)的結(jié)果可知，得出DNA 對(duì)AFG1的吸附過(guò)程符合準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型，表明吸附過(guò)程的限速步驟為化學(xué)相互作用。Langmuir（R2=0.974 8）和Freundlich（R2=0.999 9）等溫吸附模型擬合結(jié)果表明吸附過(guò)程更加符合Freundlich 模型，該吸附過(guò)程為多層吸附。熱力學(xué)模型擬合參數(shù)顯示該過(guò)程是自發(fā)進(jìn)行的放熱過(guò)程。去除花生油中的AFG1，其去除率在80.48%～86.46%。殘留量在11.00～18.37 μg/kg。本文對(duì)DNA 吸附消除黃曲霉毒素G1進(jìn)行了初步探索。有望應(yīng)用于DNA 固定化的研究，將DNA 與絲素纖維、絲素蛋白交聯(lián)構(gòu)建DNA固定化材料，進(jìn)一步消除AFG1。