蔣思雨，郝剛，唐善虎，李思寧，孫棟，張林

（西南民族大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都 610041）

月桂酰精氨酸乙酯（Lauroyl arginine ethyl ester，LAE）是一種陽(yáng)離子表面活性劑，在前期的研究中發(fā)現(xiàn)它對(duì)G-、G+菌及霉菌有廣譜的抑菌活性，在體內(nèi)能被胃蛋白酶和胰蛋白酶水解，具有高度的安全性[1]。目前，LAE 被美國(guó)FDA 批準(zhǔn)為一般公認(rèn)安全（GRAS）食品添加劑，通過(guò)歐洲EFSA 的安全食品認(rèn)證[2]。2020年國(guó)家藥監(jiān)局已批準(zhǔn)LAE 作為化妝品防腐劑使用。2018 年我國(guó)食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心發(fā)布了關(guān)于《食品添加劑月桂酰精氨酸乙酯鹽酸鹽》的征求意見(jiàn)，截止目前，GB 2760《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》還未將LAE納入其中。LAE 作為新型保鮮劑，具有較高的食品應(yīng)用潛力，常與其他保鮮劑協(xié)同使用。彭美玲等[1]研究發(fā)現(xiàn)LAE 與殼聚糖以及乳酸鏈球菌素進(jìn)行復(fù)配，可以有效抑制牦牛鮮肉腸中微生物生長(zhǎng)；陳山喬等[3]發(fā)現(xiàn)LAE 與山梨酸鈉復(fù)配可以有效抑制榨菜中的致腐菌。

目前，已有一些關(guān)于LAE 抑菌機(jī)理的研究報(bào)道。李陽(yáng)等[4]發(fā)現(xiàn)LAE與尼泊金甲酯鈉具有良好的協(xié)同抑菌效果；Rodríguez 等[5]研究了LAE 對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)LAE 可以導(dǎo)致細(xì)胞膜發(fā)生損傷，但未能使細(xì)胞裂解。Xu 等[6]研究了LAE 對(duì)指狀青霉菌和胡蘿卜果膠桿菌的抗菌活性和作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)LAE 具有明顯破壞真菌和細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的能力，能夠影響細(xì)胞膜的通透性，干擾膜電位，抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。Kim 等[7]研究了LAE 阻斷銅綠假單胞菌生物膜形成的信號(hào)，發(fā)現(xiàn)LAE 可以有效阻斷銅綠假單胞菌所需的鐵信號(hào)，抑制G-菌細(xì)胞膜的形成。

月桂酰精氨酸乙酯（LAE）作為一種潛在的新型保鮮劑，很多研究表明其具有良好的抑菌性，但對(duì)LAE 抑菌機(jī)理全面、深入的研究相對(duì)較少。本研究選擇大腸桿菌和英諾克李斯特菌作為G-、G+菌的代表菌，通過(guò)考察LAE 的抑菌活性、對(duì)細(xì)菌表面特性的影響、以及LAE 對(duì)脂質(zhì)體包裹的熒光染料的泄漏與LAE對(duì)細(xì)菌內(nèi)膜和外膜滲透性的影響，較全面地研究LAE以細(xì)菌細(xì)胞膜為主要作用靶點(diǎn)的抑菌作用機(jī)理，提出了LAE 滲透細(xì)胞膜的作用模式。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌（Escherich coilATCC51459）、英諾克李斯特菌（Listeria innocuaATCC33090）為西南民族大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存。

月桂酰精氨酸乙酯（BR），成都傲飛生物化學(xué)品責(zé)任有限公司；內(nèi)毒素檢測(cè)鱟試劑盒，廈門(mén)鱟試劑生物科技股份有限公司；大豆卵磷脂、甘油磷酸酯、鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）、利福平、十六烷、鈣黃綠素、β-巰基乙醇，上海羅恩試劑公司；紅霉素，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；鉀離子、鈣離子檢測(cè)試劑盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 培養(yǎng)基與緩沖液

LB 培養(yǎng)基（g/L）：5 g 酵母提取物、10 g 胰蛋白胨、10 g NaCl，pH 值調(diào)至7.0。

M9 培養(yǎng)基（g/100 mL）：1.28 g Na2HPO4·7H2O、0.3 g KH2PO4、0.05 g NaCl、0.1 g NH4Cl、0.05 g MgSO4、0.001 g CaCl2、0.5 g 乳糖。注意：MgSO4單獨(dú)滅菌后混勻，以避免產(chǎn)生沉淀。

PBS 緩沖溶液（g/L）：7.9 g NaCl、0.2 g KCl、0.24 g KH2PO4、1.8 g K2HPO4，pH 值調(diào)至7.4。

β-半乳糖苷酶反應(yīng)緩沖液（g/100 mL）：0.8 g NaCl、0.02 g KCl、0.29 g Na2HPO4·12H2O、0.024 g KH2PO4、0.025 g MgSO4·7H2O、0.39 gβ-硫基乙醇。

1.3 儀器與設(shè)備

5804R 型臺(tái)式冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf 公司；318cf 型酶標(biāo)儀，上海沛歐分析儀器有限公司；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；MB99-2 型自動(dòng)液相色譜分離層析儀，上海瀘西分析儀器廠有限公司；SCIENTZ-IID 型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；Zetasizer Nano ZS 型激光粒度儀，馬爾文儀器有限公司；F-4700 型熒光/化學(xué)發(fā)光分析儀，日本株式會(huì)社日立高新技術(shù)科學(xué)那珂事業(yè)所。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 抑菌曲線(xiàn)的測(cè)定

參照楊昆等[8]的方法稍作修改。取200 μL LB 培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的待測(cè)菌液置于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入5 μL LAE 溶液，終濃度為1 MIC、2 MIC，37 ℃搖床培養(yǎng)；對(duì)照組為無(wú)菌水。每隔半小時(shí)酶標(biāo)儀λ=630 nm 測(cè)A 值，并以時(shí)間為橫坐標(biāo)，A 值為縱坐標(biāo)繪制抑菌曲線(xiàn)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，取平均值。

1.4.2 LAE 結(jié)合脂多糖（LPS）中和內(nèi)毒素的活性

參照內(nèi)毒素檢測(cè)鱟試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行適當(dāng)?shù)男薷?。?shí)驗(yàn)重復(fù)三次，取平均值。

1.4.3 LAE 對(duì)細(xì)菌表面電位的影響

參照郭彥君等[9]的方法稍作修改。在無(wú)菌超凈臺(tái)上，將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的待測(cè)菌液離心，使用無(wú)菌超純水洗滌2 次后重懸，取少量菌懸液至離心管中，加入LAE 溶液終濃度分別為1 MIC、2 MIC，陰性對(duì)照為無(wú)菌超純水，充分振蕩懸勻靜置10 min，離心后棄上清液，使用1 mol/L KNO3溶液洗滌2 次，最后用KNO3溶液將其重懸至1×108CFU/mL，使用激光粒度儀測(cè)定細(xì)菌細(xì)胞表面電位。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，取平均值。

1.4.4 LAE 對(duì)細(xì)菌表面疏水性的影響

參照李鈺芳等[10]的方法稍作修改。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的待測(cè)菌液離心，用生理鹽水洗滌2 次，并用1 mol/L KNO3將其重懸至1×108CFU/mL，每管加入LAE 溶液使其最終濃度為1/2 MIC、1 MIC、2 MIC，陰性對(duì)照為生理鹽水。將其置于水浴鍋37 ℃孵育15 min 后，在λ=630 nm 處測(cè)量（記為A0）。再取1.2 mL的菌液加入0.2 mL 十六烷，將其置于旋渦器劇烈振蕩，常溫靜置25 min，待兩相完全分離后，取下層水相溶液在λ=630 nm 處測(cè)量（記為A1）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，取平均值。計(jì)算公式如下：

式中：

X——細(xì)菌吸附率，%。

1.4.5 LAE 與脂質(zhì)體的相互作用

（1）制備包裹鈣黃綠素的脂質(zhì)體

參照薄膜分散法[11]制作鈣黃綠素脂質(zhì)體，采用大豆卵磷脂和大豆心磷脂進(jìn)行制備。先取0.4 g 磷脂（卵磷脂:心磷脂=4:1）于燒杯中，加入30 mL 氯仿溶解，加入10 mL 50 mmol/L 鈣黃綠素/PBS 混合溶液，使其充分溶解，溶解過(guò)程要注意避光，直到無(wú)沉淀物質(zhì)為止。置于超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，在冰浴條件下300 W 間歇超聲30 min，使其變?yōu)榫幌?；隨后置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，溫度＜40 ℃減壓蒸發(fā)除去氯仿，溶液呈膠狀時(shí)，補(bǔ)加2～3 mL PBS 緩沖溶液洗脫。形成的脂質(zhì)體在0.22 μm 的聚碳酸酯濾器進(jìn)行過(guò)濾，棄去濾液，取未能過(guò)濾的溶液上葡聚糖凝膠G-25 柱（1.6×50 cm），使用PBS 溶液進(jìn)行洗脫，根據(jù)峰值，收集脂質(zhì)體，4 ℃進(jìn)行保存。制備空白脂質(zhì)體，則取相同的0.4 g 磷脂（卵磷脂:心磷脂=4:1）于燒杯中，加入30 mL 氯仿，加入10 mL PBS 緩沖溶液。混勻后進(jìn)行超聲波破碎，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行蒸發(fā)。使用前可做適當(dāng)?shù)南♂尅?/p>

（2）LAE 引起包裹鈣黃綠素的脂質(zhì)體的泄漏的影響

取1.5 mL 已包裹鈣黃綠素的脂質(zhì)體溶液于試管中，加入1.5 mL 不同濃度（8、16、32、64、128 μg/mL）的LAE 溶液，測(cè)其熒光強(qiáng)度為F；陽(yáng)性對(duì)照為加入1.5 mL PBS 緩沖溶液，+30 μLφ=10% Triton X-100 溶液，測(cè)其熒光強(qiáng)度為Ft；陰性對(duì)照加入1.5 mL PBS緩沖溶液，測(cè)其熒光強(qiáng)度為F0。樣品在室溫下孵育5 min 后用熒光/化學(xué)發(fā)光分析儀進(jìn)行檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)535 nm，電壓400 V，狹縫2.5 nm。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，取平均值。鈣黃綠素泄漏率計(jì)算公式如下：

式中：

L——泄漏率，%；

F——樣品組的熒光強(qiáng)度；

F0——陰性對(duì)照組的熒光強(qiáng)度；

Ft——陽(yáng)性對(duì)照組的熒光強(qiáng)度。

（3）LAE 對(duì)空白脂質(zhì)體膜破裂實(shí)驗(yàn)的影響

取100 μL 空白脂質(zhì)體于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔再加入100 μL 不同濃度（8、16、32、64、128 μg/mL）的LAE 溶液；陽(yáng)性對(duì)照為加入100 μL PBS 緩沖溶液+10 μLφ=10% Triton X-100 溶液；陰性對(duì)照為加入100 μL PBS 緩沖溶液。室溫下孵育5 min 后，置于λ=595 nm 的酶標(biāo)儀中測(cè)量A2值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，取平均值。

1.4.6 LAE 對(duì)G-菌外膜的滲透性的影響

參照郝剛等[12]的方法稍作修改。在無(wú)菌超凈臺(tái)中，將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌菌液離心、洗滌、重懸。取160 μL 大腸桿菌菌液于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔中再加入20 μL LAE 溶液，使其終濃度為1/2 MIC，再分別加入20 μL 紅霉素與利福平；陰性對(duì)照為加入20 μL 無(wú)菌超純水+20 μL 紅霉素與利福平。37 ℃培養(yǎng)10 h 后酶標(biāo)儀λ=630 nm 處測(cè)A3值，根據(jù)吸光度的減少來(lái)檢測(cè)LAE 是否可以增加G-菌外膜的滲透性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，取平均值。

1.4.7 LAE 對(duì)胞內(nèi)K+、Ca2+的泄漏的影響

參照鉀離子、鈣離子檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行適當(dāng)?shù)男薷摹?shí)驗(yàn)重復(fù)三次，取平均值。

1.4.8 LAE 對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜的滲透性的影響

參照蘇戰(zhàn)強(qiáng)等[13]的方法稍作修改。在無(wú)菌超凈臺(tái)中，將LB 培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌菌液離心，無(wú)菌生理鹽水（0.85wt%）洗滌，重懸。取2 mL菌懸液，加入10 mL 的M9 乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)8 h 后進(jìn)行離心洗滌，使用β-半乳糖苷酶反應(yīng)緩沖液將其重懸至A4=0.2（λ=630 nm）。

（1）細(xì)胞質(zhì)膜的滲透性檢測(cè)

取800 μL 待測(cè)菌液于離心管里，加入100 μL LAE溶液（終濃度為MIC、2 MIC），再加入100 μL 1 mg/mL的鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）進(jìn)行混勻，37 ℃培養(yǎng)，每隔0.5 h 測(cè)一次At值（λ=405 nm）；陰性對(duì)照為加100 μLβ-半乳糖苷酶反應(yīng)緩沖液+100 μL ONPG，測(cè)A5值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，取平均值。計(jì)算公式如下：

式中：

A——細(xì)胞質(zhì)膜滲透性增加導(dǎo)致吸光度值的增加值；

At——每隔半小時(shí)的吸光度值；

A0——陰性對(duì)照組的吸光度值。

（2）β-半乳糖苷酶滲透至胞外的檢測(cè)

取900 μL 菌液于離心管中，加入100 μL LAE 溶液（終濃度為MIC、2 MIC），混勻后，37 ℃孵育1 h。孵育結(jié)束后離心取上清900 μL，再加100 μL 的1 mg/mL ONPG 混勻后繼續(xù)孵育4 h，測(cè)量A6值（λ=405 nm）；陰性對(duì)照為取900 μL 菌液于離心管中，37 ℃培養(yǎng)1 h后置于超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)300 W間歇超聲30 min，加入100 μL 的1 mg/mL ONPG 混勻后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，測(cè)A7值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，取平均值。計(jì)算公式如下：

式中：

H——β-半乳糖苷酶相對(duì)活性，%；

A6——樣品組的吸光度值；

A7——陰性對(duì)照組的吸光度值。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft excel 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、Origin 2018 軟件進(jìn)行繪圖、IBM SPSS Statistics 20 進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 LAE 對(duì)大腸桿菌和英諾克李斯特菌的抑菌曲線(xiàn)

以大腸桿菌和英諾克李斯特菌作為G-、G+菌的代表菌，LAE 對(duì)細(xì)菌的抑殺作用可用菌液的吸光度值的變化來(lái)檢測(cè)，通過(guò)抑菌曲線(xiàn)進(jìn)一步比較LAE 對(duì)G-、G+菌的抑菌效果。大腸桿菌和英諾克李斯特菌最小抑菌濃度（MIC）均為8 μg/mL。如圖1 顯示，測(cè)試的大腸桿菌和李斯特菌在無(wú)LAE 處理時(shí)的生長(zhǎng)狀態(tài)都良好，LAE 1/2 MIC 時(shí)也無(wú)法抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，當(dāng)菌液加入LAE 1 MIC 后，兩種菌的吸光度值都明顯下降。LAE 對(duì)大腸桿菌的抑菌速度非常快，LAE 1 MIC處理30 min 后，大腸桿菌吸光度值由0.526 降低至0.135，隨后趨于穩(wěn)定，LAE 2 MIC 抑制效果明顯優(yōu)于LAE 1 MIC。LAE 對(duì)英諾克李斯特菌的抑菌速度相對(duì)緩慢，1 h 后李斯特菌數(shù)量減少一半左右，后逐漸趨于穩(wěn)定。由此可見(jiàn)，LAE 對(duì)G-、G+菌均有明顯的抑菌活性，但對(duì)G-菌的抑菌速度要高于G+菌，暗示LAE 對(duì)G-、G+菌的抑菌機(jī)理可能存在不同。

圖1 LAE 對(duì)大腸桿菌（a）和李斯特菌（b）的時(shí)間-抑菌曲線(xiàn)Fig.1 Time-kill curves of LAE against E.coli (a) and Listeria (b)

2.2 LAE 結(jié)合細(xì)菌脂多糖（LPS）中和內(nèi)毒素的活性

革蘭氏陰性菌的外膜上存在一種電負(fù)性糖脂類(lèi)物質(zhì)-脂多糖（LPS），是內(nèi)毒素主要成分之一。帶正電荷的物質(zhì)與脂多糖的結(jié)合可以用內(nèi)毒素中和作用來(lái)檢測(cè)，可根據(jù)LAE 中和內(nèi)毒素的能力來(lái)判斷LAE 結(jié)合LPS 的親和力[14]。由圖2 可以看出，LAE 在8 μg/mL的時(shí)候可以與脂多糖相互結(jié)合，中和率為26.72%，隨著濃度的增加中和內(nèi)毒素的能力也隨之呈顯著性增加并趨于穩(wěn)定（p＜0.05），最高可達(dá)到96.56%且保持在90.05%以上的結(jié)合能力，對(duì)內(nèi)毒素的中和能力也被認(rèn)為貢獻(xiàn)了部分的抗菌活性[15]。陰離子的脂多糖是細(xì)胞外膜的外側(cè)唯一的脂質(zhì)種類(lèi)，LAE 與LPS 之間極強(qiáng)的親和能力說(shuō)明陽(yáng)離子LAE 與G-菌細(xì)胞最初的相互作用是經(jīng)過(guò)與脂多糖的結(jié)合，LPS 可能是LAE 作用于G-菌外膜的一種重要的殺菌機(jī)制，同時(shí)也說(shuō)明靜電相互作用在殺菌過(guò)程中起著重要的作用[16]。

圖2 LAE 與細(xì)菌脂多糖的結(jié)合性Fig.2 Binding of LAE to Bacterial Lipopolysaccharides

2.3 LAE 對(duì)細(xì)菌表面電位的影響

細(xì)菌的表面存在一些羧基或磷壁酸等陰性基團(tuán)，使細(xì)菌表面攜帶負(fù)電荷，細(xì)菌表面電荷的大小影響到細(xì)菌表面粘附作用和聚集作用等特性[17]。LAE 與細(xì)菌細(xì)胞表面作用是LAE 與細(xì)菌接觸的第一步。由表1可以看出經(jīng)過(guò)LAE 處理過(guò)的2 種菌細(xì)胞表面Zeta 電位都發(fā)生變化，細(xì)菌表面電負(fù)性都呈顯著降低的趨勢(shì)（p＜0.05），且隨著LAE濃度的增加電負(fù)性降低越多。Wang 等[18]研究發(fā)現(xiàn)乳酸處理單核細(xì)胞增生李斯特菌可導(dǎo)致其Zeta 電位變?yōu)檩^小的負(fù)值，甚至轉(zhuǎn)變?yōu)檎怠ＥcLAE 作用于細(xì)胞表面電位相似，LAE 可以干擾細(xì)菌表面電荷，使正電荷的LAE 與細(xì)菌表面多種陰性分子間發(fā)生靜電作用，中和了一部分電荷[17,19]。

表1 LAE 對(duì)細(xì)菌細(xì)胞表面電位的影響Table 1 Effect of LAE on bacterial bell surface potential

2.4 LAE 對(duì)細(xì)菌表面疏水性的影響

十六烷是一種疏水性溶液，其對(duì)細(xì)菌的吸附率的改變可以體現(xiàn)細(xì)菌表面疏水性的變化[20]。由表2 可以看出，LAE 作用于李斯特菌和大腸桿菌后，隨著LAE濃度的增加，十六烷對(duì)細(xì)菌的吸附率呈顯著性增加（p＜0.05），從李斯特菌組結(jié)果觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LAE 1/2 MIC處理后，細(xì)菌表面吸附率為1.60%，LAE 2 MIC 處理后增加為5.44%，表明LAE 對(duì)菌體細(xì)胞表面疏水性呈濃度依賴(lài)性；而大腸桿菌組結(jié)果觀察發(fā)現(xiàn)十六烷對(duì)細(xì)菌的吸附率增加幅度更加明顯，經(jīng)LAE 1/2 MIC 處理后，細(xì)菌表面吸附率為2.57%，LAE 1 MIC 處理后吸附率為19.37%，隨之增長(zhǎng)為L(zhǎng)AE 2 MIC 后，細(xì)菌表面吸附率增加為26.05%。這可能與LAE 的分子結(jié)構(gòu)有關(guān)，LAE 分子是由月桂酸、L-精氨酸、乙醇組成，呈長(zhǎng)鏈狀，具兩親性，LAE 分子一側(cè)是親水性的精氨酸的側(cè)鏈胍基帶正電荷，另一側(cè)是疏水性的月桂酸的十二烷脂肪鏈烴。推測(cè)LAE 分子接觸細(xì)菌是先以胍基結(jié)合細(xì)菌表面帶負(fù)電荷的基團(tuán)，然后疏水的脂肪鏈烴尾部附著于細(xì)菌表面，使得細(xì)菌表面的疏水性提高[21]。由于G-菌細(xì)胞外膜有大量的帶負(fù)電的脂多糖，能結(jié)合更多的LAE，這使得被LAE 吸附的大腸桿菌表面疏水性增加。這也能從側(cè)面解釋為什么LAE 對(duì)大腸桿菌的殺菌速度相比較李斯特菌更加迅速。

表2 LAE 對(duì)細(xì)菌細(xì)胞表面疏水性的影響Table 2 Effect of LAE on the hydrophobicity of bacterial cell surface

2.5 LAE 與脂質(zhì)體的相互作用

2.5.1 LAE 引起包裹鈣黃綠素脂質(zhì)體泄漏的影響

為了研究LAE 與膜的相互作用，我們構(gòu)建脂質(zhì)體模型來(lái)模擬細(xì)胞質(zhì)膜。磷脂成分的選擇反應(yīng)了細(xì)菌質(zhì)膜的組成，我們選用中性的蛋黃卵磷脂（磷脂酰膽堿，EYPC）和帶負(fù)電的蛋黃心磷脂（磷脂酰甘油，EYPG）按4:1（m:m）混合配制，使脂質(zhì)體包裹著小分子水溶性鈣黃綠素?zé)晒庵甘緞22,23]。通過(guò)LAE 作用于鈣黃綠素脂質(zhì)體引起熒光素的泄露來(lái)考察LAE 與膜的作用方式。由圖3 看出，LAE 可以使脂質(zhì)體中鈣黃綠素發(fā)生泄漏，8 μg/mL 時(shí)就能引起接近70%的熒光素泄露，并與濃度呈正相關(guān)，當(dāng)LAE 達(dá)到128 μg/mL 時(shí)，其所引起的鈣黃綠素泄漏達(dá)到80%。李元生等[24]研究中抗菌肽Shepherin 能迅速作用于磷脂雙分子層使其產(chǎn)生孔隙造成鈣黃綠素的泄漏。Amanda 等[25]發(fā)現(xiàn)隨著抗菌肽的濃度增加，鈣黃綠素的泄漏率會(huì)隨之增加。上述研究表明LAE 可能與某類(lèi)抗菌肽抑制機(jī)制類(lèi)似，可以擾動(dòng)脂質(zhì)體膜磷脂雙分子層失去平衡。

圖3 LAE 引起包裹鈣黃綠素的脂質(zhì)體的泄漏Fig.3 LAE causes leakage of liposomes encapsulating calcein

2.5.2 LAE 對(duì)空白脂質(zhì)體膜破裂的影響

Triton X-100 溶液是一種乳化劑，可以溶解脂質(zhì)，完全破壞細(xì)胞膜?？疾炝薒AE 對(duì)空白脂質(zhì)體膜的破裂作用，由圖4 可知φ=0.5%的Triton X-100 溶液完全破壞了脂質(zhì)體膜。而LAE 處理與陰性對(duì)照相比僅有略微下降。郝剛[12]發(fā)現(xiàn)抗菌肽BF2-A和BF2-X均不能引起脂質(zhì)體的膜破裂，即LAE 與抗菌肽BF2-A 和BF2-X 對(duì)空白脂質(zhì)體的影響相似。根據(jù)LAE 引起鈣黃綠素脂質(zhì)體泄漏的變化得出，LAE 可能并沒(méi)有使脂質(zhì)體膜完全崩塌[26,27]。

圖4 LAE 對(duì)脂質(zhì)體膜破裂Fig.4 Rupture of liposome membrane by LAE

2.6 LAE 對(duì)G-菌外膜的滲透性的影響

紅霉素與利福平是疏水性的抗生素藥物，這2 種抗生素不能進(jìn)入細(xì)胞壁膜完整的革蘭氏陰性菌外膜內(nèi)，但可以穿過(guò)某些外膜缺陷突變株或外膜被螯合劑破壞的細(xì)胞外膜[28]。因此可以將這2 種抗生素作為抑菌劑誘導(dǎo)G-菌細(xì)胞外膜滲透性增加的探針。我們通過(guò)檢測(cè)LAE 與紅霉素和利福平的協(xié)同抗菌作用來(lái)考察LAE 滲透G-菌細(xì)胞外膜的能力[29]。由圖5 可知LAE與紅霉素或利福平協(xié)同作用于大腸桿菌的吸光度值明顯低于紅霉素或利福平單獨(dú)作用于大腸桿菌的吸光度值。結(jié)果表明LAE 與這兩種疏水性抗生素間具有明顯的協(xié)同抑菌作用，抗生素濃度越大效果越明顯。1/2 MIC的LAE 不足以抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)，但似乎擾亂了大腸桿菌細(xì)胞外膜結(jié)構(gòu)，誘使其滲透性增加，使大腸桿菌對(duì)各種濃度的紅霉素和利福平變得更加敏感。

圖5 LAE 對(duì)大腸桿菌菌外膜的滲透性檢測(cè)Fig.5 Permeability test of LAE to the outer membrane of E.coli

2.7 胞內(nèi)K+、Ca2+的泄漏

K+、Ca2+的泄漏情況可以反映細(xì)胞膜通透性的變化程度。由圖6 可以看出，與對(duì)照組比較，發(fā)現(xiàn)濃度為1/2 MIC 的LAE 并不會(huì)導(dǎo)致K+、Ca2+的泄漏增加；當(dāng)LAE 濃度升高，K+、Ca2+的泄漏率才隨之呈顯著性增加（p＜0.05），LAE 處理后細(xì)胞釋放的K+、Ca2+量的增加說(shuō)明LAE 作用胞膜后確實(shí)增加了通透性，導(dǎo)致離子泄漏，并且在LAE 高濃度下（≥2 MIC），LAE對(duì)李斯特菌的K+、Ca2+離子泄漏率均高于大腸桿菌，這可能是LAE 對(duì)李斯特菌細(xì)胞質(zhì)膜的擾動(dòng)要更大一些。表明經(jīng)LAE 處理后，菌體細(xì)胞膜上的離子通道可能發(fā)生損傷，引起離子的泄漏，而K+、Ca2+是維持細(xì)胞滲透壓和膜電位的關(guān)鍵性離子，其泄露會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜內(nèi)外滲透壓的失衡，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[30,31]。此結(jié)果與ε-聚賴(lài)氨酸損傷大腸桿菌細(xì)胞，引起大腸桿菌胞內(nèi)離子泄漏情況類(lèi)似[32]。

圖6 LAE 對(duì)胞內(nèi)K+、Ca2+的泄漏Fig.6 Leakage of intracellular K+ and Ca2+ by LAE

2.8 LAE 對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜的滲透性的影響

2.8.1 細(xì)胞質(zhì)膜的滲透性檢測(cè)

β-半乳糖苷酶是細(xì)菌中普遍存在的一種誘導(dǎo)酶，當(dāng)培養(yǎng)基中有葡萄糖時(shí)不表達(dá)，葡萄糖耗盡而培養(yǎng)基里又有乳糖時(shí)，乳糖可誘導(dǎo)β-半乳糖苷酶產(chǎn)生，分泌于細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）是β-半乳糖苷酶的底物，可被β-半乳糖苷酶水解為黃色的鄰-硝基苯酚，可以用來(lái)檢測(cè)β-半乳糖苷酶的活性。ONPG 進(jìn)入胞質(zhì)內(nèi)還需要乳糖透性酶的運(yùn)輸，因此對(duì)于質(zhì)膜完整的細(xì)胞來(lái)說(shuō)其β-半乳糖苷酶的活性變化較慢。如果細(xì)菌細(xì)胞膜被破壞，其滲透性發(fā)生變化，ONPG 可以迅速進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，被β-半乳糖苷酶水解，吸光度值會(huì)增加，以此考察LAE 對(duì)大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)膜滲透性的影響[33]。如圖7 所示，經(jīng)處理30 min 后，吸光度值快速升高，2 MIC 的菌液中β-半乳糖苷酶的含量在30 min 內(nèi)達(dá)到最大值。這說(shuō)明ONPG 已迅速進(jìn)入胞內(nèi)并被水解，LAE 可以使大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)膜滲透性增加，濃度隨之增加，對(duì)細(xì)胞膜的滲透性越強(qiáng)。這與LAE 對(duì)大腸桿菌抑菌曲線(xiàn)和脂質(zhì)體熒光素泄露的研究結(jié)果一致[34]。

圖7 細(xì)胞質(zhì)膜的滲透性檢測(cè)Fig.7 Permeability test of plasma membrane

2.8.2β-半乳糖苷酶滲透至胞外的檢測(cè)

前面的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)LAE 可以擾亂細(xì)胞膜，使離子、ONPG、熒光素等小分子物質(zhì)可以進(jìn)出胞膜。β-半乳糖苷酶是大分子細(xì)菌內(nèi)源性酶，存在于細(xì)胞膜內(nèi)，而在胞外是無(wú)法檢測(cè)到，當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞膜受到外界的嚴(yán)重破壞，會(huì)使β-半乳糖苷酶泄漏至胞外[35]。我們通過(guò)測(cè)量LAE 處理細(xì)菌后上清中β-半乳糖苷酶的相對(duì)活性，來(lái)判斷β-半乳糖苷酶是否從細(xì)胞中泄漏，從而判斷LAE對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜的破壞程度。由表3可以看出，經(jīng)1 MIC、2 MIC 濃度的LAE 處理后，上清液中β-半乳糖苷酶的相對(duì)活性為56.26%、60.31%。這表明LAE 展現(xiàn)出一定程度的細(xì)胞質(zhì)膜破壞能力，使膜產(chǎn)生較大孔洞，導(dǎo)致胞內(nèi)大分子的酶蛋白物質(zhì)的泄漏。

表3 β-半乳糖苷酶滲透至胞外的檢測(cè)Table 3 Detection of β-galactosidase permeation into the extracellular space

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)選擇大腸桿菌和英諾克李斯特菌作為G-、G+菌的代表菌，研究了LAE 以細(xì)菌細(xì)胞壁膜為主要作用靶點(diǎn)的抑菌機(jī)制。通過(guò)分析LAE 的抑菌特性，并結(jié)合LAE 的分子結(jié)構(gòu)特征，推測(cè)LAE 與細(xì)菌壁膜的作用模式可能是以分子精氨酸側(cè)鏈帶正電的胍基以靜電吸引與細(xì)菌表面帶負(fù)電的基團(tuán)相互作用，吸附在細(xì)菌表面，中和部分電荷，使膜電位降低；大腸桿菌的細(xì)胞壁帶有更多的負(fù)電荷基團(tuán)，吸附了更多的LAE，使得大腸桿菌表面的疏水性更大。吸附在細(xì)菌表面的LAE 用疏水性的脂肪鏈烴端插入磷脂雙分子層膜，在擾動(dòng)脂質(zhì)體膜的過(guò)程中引起了包裹的熒光指示劑泄露；在擾動(dòng)G-外膜時(shí)，使得疏水性探針紅霉素和利福平能進(jìn)入外膜；在擾動(dòng)細(xì)胞質(zhì)膜時(shí)，不僅能使小分子的K+、Ca2+從細(xì)胞中泄露，以及ONPG 滲入細(xì)胞內(nèi)，還使得大分子酶蛋白也能從胞內(nèi)滲出胞外。LAE 并不能使脂質(zhì)體膜崩塌，但1MIC 的LAE 可以導(dǎo)致半數(shù)的β-半乳糖苷酶泄露，說(shuō)明胞膜的破壞程度比較大。在后續(xù)的研究中我們會(huì)繼續(xù)探索LAE 作用細(xì)菌的其他胞內(nèi)物質(zhì)靶點(diǎn)。