陳繼紅，嚴(yán)思思，羅非君*，林親錄，李勃

（1.中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410004）（2.江蘇康之源糧油有限公司，江蘇宿遷 223800）

根據(jù)中國(guó)居民營(yíng)養(yǎng)與健康狀況檢測(cè)報(bào)告[1]的數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)60 歲以上的老年人高膽固醇血癥患病率為18.1%，高密度脂蛋白膽固醇（High Density Lipoprotein Cholesterol，HDL-c）和低密度脂蛋白膽固醇（Low Density Lipoprotein Cholesterol，LDL-C）血癥的患病率分別高達(dá)31.4%和8.8%，而在十年前我國(guó)60 歲以上的老年人高膽固醇血癥患病率僅為6.1%，十年間增加了兩倍，嚴(yán)重降低了人們的生活品質(zhì)。高膽固醇血癥的形成與飲食密切相關(guān)，包括日常膳食用油的選擇，因此研究膳食油脂對(duì)膽固醇代謝的影響對(duì)控制高膽固醇血癥有重要意義。

烹調(diào)油是我國(guó)膳食油脂的重要組成部分，目前市售的烹調(diào)油品類繁多。根據(jù)油脂來(lái)源分，可大致分為植物油和動(dòng)物油。自上世紀(jì)以來(lái)，大量研究表明攝入過(guò)多飽和脂肪酸（SFA）會(huì)增加機(jī)體中循環(huán)膽固醇的含量，從而形成高膽固醇血癥，增加心血管疾病的患病率[2]。因此，飽和脂肪酸被認(rèn)為是導(dǎo)致高血脂而誘發(fā)心血管疾病的重要因素。盡管2020 年《美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)雜志》發(fā)表了一篇大型薈萃分析，表示沒(méi)有證據(jù)表明限制飽和脂肪酸攝入能有助于預(yù)防心血管疾病[3,4]，但仍有大部分工作結(jié)果支持減少SFA 的攝入有利于降低心血管疾病患病風(fēng)險(xiǎn)[5-7]。稻米油是植物油中SFA 含量較高（可達(dá)20%）的食用油[8]，且其中含有包括γ-谷維素、甾醇、維生素E 等[9]生物活性成分。在生產(chǎn)方面，米糠作為稻谷的副產(chǎn)物，年產(chǎn)率高達(dá)1.242×107t，為稻米油的生產(chǎn)提供了豐富的原材料[10]。稻米油可成為既保障菜肴口感又能有效降低膽固醇引起的心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的良好選擇，且流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)攝入稻米油與人血漿膽固醇降低密切相關(guān)[11,12]，但其分子機(jī)理尚不清楚。動(dòng)物油（如豬油）雖然烹飪時(shí)具有較好的菜肴口感，但易于高膽固醇血癥。本課題比較了飽和脂肪酸含量較高（約40%）的食用豬油及飽和脂肪酸含量較低（約20%）的稻米油對(duì)金黃地鼠膽固醇代謝的影響。通過(guò)對(duì)金黃地鼠的宏觀表型、生化指標(biāo)的測(cè)定，確定稻米油是否可改善血脂水平和抑制高膽固醇；通過(guò)對(duì)膽固醇相關(guān)基因的分析，確定其可能調(diào)控機(jī)制，為米糠油的廣泛開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)試劑：豬油采購(gòu)自雙匯集團(tuán)的豬板油煉制所得，稻米油采購(gòu)自益海嘉里集團(tuán)的金龍魚(yú)米糠油。水合氯醛、苯酚、異丙醇、多聚甲醛、氯仿、無(wú)水乙醇均來(lái)自國(guó)藥試劑，Trizol-up、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、核酸染料Gel Stain、DNA marker 選自全式金生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖選自鼎國(guó)生物試劑有限公司。

實(shí)驗(yàn)儀器：BS-220 邁瑞全自動(dòng)生化分析儀、-80 ℃超低溫冰箱，中科美菱低溫科技公司；凝膠成像儀，美國(guó)Bio-rad 公司；MLtra Genetic 型超純水系統(tǒng)，英國(guó)ELGA 公司；L420 離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開(kāi)發(fā)有限公司；SX-500 高壓滅菌鍋,日本TOMY公司；IMS-30 全自動(dòng)雪花制冰機(jī),上海博科科學(xué)儀器有限公司；SpectraMax i3x 多功能酶標(biāo)儀，美谷分子儀器（上海）有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理

1 材料與方法

雄性敘利亞金黃地鼠30 只（8 周齡）購(gòu)自湖南省斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)為SCXK（遼）2020-0001。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（編號(hào)43321563），實(shí)驗(yàn)程序符合《中國(guó)動(dòng)物飼養(yǎng)使用指南》。在環(huán)境控制的室內(nèi)（溫度（24±0.5）℃，相對(duì)濕度（52±0.5）℃，燈光控制在12 h 晝夜交替），整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，所有金黃地鼠自由飲水和進(jìn)食，定期打掃清潔衛(wèi)生，飼料保質(zhì)期正常等。在實(shí)驗(yàn)室飼料適應(yīng)一周后，將金黃地鼠隨機(jī)分為2 組，每組15 只，15 只分入5 籠，每籠3 只。每組隨機(jī)抽取5 只，通過(guò)內(nèi)眥采其血液，分別檢測(cè)血清中HDL-c、LDL-c、總膽固醇（TC）及甘油三酯（TG）濃度，確定無(wú)差異顯著性后分別給2 組地鼠飼喂不同飼料。飼料分別為用豬油（LD）和稻米油（RD）制成的純化型飼料，其配方如表1 所示，飼料中的脂肪供能水平為維持地鼠生長(zhǎng)所需的正常水平。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要每日檢查，保證實(shí)驗(yàn)金黃地鼠的生存狀況一切正常，每周記錄金黃地鼠的采食量和體質(zhì)量。飼養(yǎng)12 周后禁食8 h，自由飲水。禁食8 h 后利用水合氯醛麻醉，摘其眼球取血，后斷頸處死，剖腹分離取主動(dòng)脈弓、肝臟等組織用生理鹽水清洗干凈，稱重拍照后于-80 ℃低溫保存待用。

表1 飼料配方表Table 1 Feed formula table

1.3 血清生化檢測(cè)

金黃地鼠麻醉后用毛細(xì)管內(nèi)眥取血，用真空采血管收集，再將其于低溫2 500 r/min 離心10 min 后，取血清，采用邁瑞全自動(dòng)生化分析儀BS-220 檢測(cè)血清中TC、HDL-c、LDL-c 和TG 濃度，并檢測(cè)血糖（GLU）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）的活力。

1.4 主動(dòng)脈和肝臟的蘇木精-伊紅染色法（HE）染色

取金黃地鼠主動(dòng)脈弓和肝臟左小葉固定于質(zhì)量體積比為w=4%的多聚甲醛溶液中48 h 后，進(jìn)行石蠟包埋、切片和染色，最后用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察并拍照。

1.5 肝臟中TC 和TG 濃度檢測(cè)

采用購(gòu)買自南京建成生物技術(shù)有限公司的試劑盒按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行加樣操作，最后通過(guò)酶標(biāo)儀讀取對(duì)應(yīng)OD 值，再通過(guò)計(jì)算公式算出相應(yīng)的濃度。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量（RT-qPCR）檢測(cè)

采用RT-qPCR 法來(lái)研究使用不同油脂對(duì)參與脂質(zhì)和膽汁酸代謝的基因的影響。使用Trizol 法從肝樣品中提取總RNA，并按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。RNA 的質(zhì)量通過(guò)分光光度法和電泳檢查。最后，用熒光定量PCR 試劑盒按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作并擴(kuò)增，將靶基因mRNA 的表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化為β-actin 的mRNA 水平，目的基因表達(dá)量由計(jì)算方法。實(shí)驗(yàn)中所用的引物序列信息如表2 所示。

表2 RT-QPCR 實(shí)驗(yàn)PCR 引物列表Table 2 List of PCR primers for RT-QPCR experiment

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差（SEM），對(duì)所有結(jié)果運(yùn)用SPSS 17.0 軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行成對(duì)樣本t檢驗(yàn)，再運(yùn)用雙尾法比較兩組數(shù)據(jù)間均值的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 攝入不同油脂對(duì)金黃地鼠的體質(zhì)量和采食量的影響

在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每周監(jiān)測(cè)體質(zhì)量和食物消耗。分別攝入豬油和米糠油對(duì)金黃地鼠體質(zhì)量的影響如表3 所示，12 周后，兩組的金黃地鼠均體質(zhì)量由初始的140 g 左右增長(zhǎng)至180 g 左右，兩組間體質(zhì)量無(wú)差異顯著性。由表3 可知，兩組間采食量也無(wú)顯著性差異。

表3 攝入不同油脂對(duì)金黃地鼠體質(zhì)量和采食量的影響（g）Table 3 Effects of different oil intake on body weight and feed intake of golden hamsters

2.2 攝入不同油脂對(duì)金黃地鼠血脂濃度的影響

由圖1 可知，與實(shí)驗(yàn)前相比，實(shí)驗(yàn)12 周后，兩組金黃地鼠血脂濃度升高，且TC 和HDL-c 濃度均極顯著升高，相較與0 周分別增加了2.44 倍和1.43 倍。兩組之間進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，第12 周金黃地鼠的LDL-c 濃度RD 組比LD 組降低了46.78%（圖2d），與前人的研究一致，攝入稻米油顯著降低了低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）濃度[13]。這些結(jié)果表明：攝入油脂使金黃地鼠血脂濃度升高，相比于攝入豬油，攝入稻米油能顯著改善血脂濃度，進(jìn)而改善膽固醇代謝。

圖1 攝入不同油脂對(duì)金黃地鼠血脂的影響Fig.1 Effect of different oil intake on lipid of golden hamsters

圖2 攝入不同油脂對(duì)金黃地鼠肝臟形態(tài)的影響Fig.2 Effects of different oil intake on liver morphology of golden hamsters

2.3 攝入不同油脂對(duì)金黃地鼠肝臟形態(tài)和肝脂的影響

兩組金黃地鼠的肝臟從外觀形態(tài)、色澤等方面來(lái)看，LD 組有肝臟局部呈現(xiàn)淡黃色的現(xiàn)象，RD 組的肝臟無(wú)肉眼可分辨的變化（圖2e），兩組間的肝臟質(zhì)量無(wú)顯著性差異（圖2a），但是RD 組金黃地鼠的肝指數(shù)低于LD 組的肝指數(shù)（圖2b），且通過(guò)測(cè)定肝臟TC和TG 的濃度，結(jié)果顯示相較于LD 組，RD 組金黃地鼠肝臟中的TC 濃度顯著降低了41.73%（圖2c），但是肝臟中的TG 濃度無(wú)差異顯著性變化（圖2d）。以上結(jié)果說(shuō)明相較于攝入豬油，攝入稻米油可以降低金黃地鼠肝指數(shù)和肝臟中TC、TG 的濃度，進(jìn)而降低金黃地鼠肝臟中的膽固醇濃度。

2.4 攝入不同油脂對(duì)金黃地鼠肝功能和病理形態(tài)的影響

谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）是描述肝損傷的指標(biāo)，肝細(xì)胞損傷的特定標(biāo)志物。由圖3可知，RD 組金黃地鼠ALT 和AST 活力均有低于LD組的趨勢(shì)，分別降低了42.91%和30.82%。通過(guò)肝臟HE 染色病理切片可看出，LD 組的肝臟細(xì)胞可見(jiàn)明顯空泡、細(xì)胞核固縮部分甚至溶解。Du 等[14]研究結(jié)果也顯示米糠油預(yù)處理顯著降低了AST 和ALT 水平，減輕了肝細(xì)胞損傷和細(xì)胞凋亡。

圖3 攝入不同油脂對(duì)金黃地鼠肝功能和病理形態(tài)的影響Fig.3 Effects of different oil intake on liver function and pathological morphology of golden hamsters

2.5 攝入不同油脂對(duì)金黃地鼠主動(dòng)脈弓病理切片影響

取每組兩只金黃地鼠主動(dòng)脈弓進(jìn)行了HE 染色病理切片，放大200 倍仔細(xì)觀察（圖4）。結(jié)果顯示，兩組金黃地鼠均無(wú)動(dòng)脈粥樣硬化形成。

圖4 攝入不同油脂對(duì)金黃地鼠主動(dòng)脈弓病理切片的影響Fig.4 Effects of ingestion of different oils on pathological sections of aortic arch of golden hamsters

2.6 攝入不同油脂對(duì)金黃地鼠肝臟中膽汁酸和膽固醇合成相關(guān)基因的影響

肝臟組織中CYP27A1、LDLr、AQP8、sulfotransferase 2A1、SLC27A5、SR-BI是膽汁酸和膽固醇合成相關(guān)的基因。CYP27A1是膽汁酸合成經(jīng)典途徑和替代途徑的限速酶[15]，該基因的表達(dá)升高表明膽汁酸的生物合成增強(qiáng)，增強(qiáng)的膽汁酸生物合成將使用更多的膽固醇作為底物并降低肝臟膽固醇水平。LDLr和SR-BI是細(xì)胞從循環(huán)中吸收膽固醇的關(guān)鍵受體[16]，AQP8是肝細(xì)胞線粒體水通道蛋白8，一種多功能膜通道蛋白，膽固醇的相關(guān)基因[17,18]，能夠降低膽固醇和脂肪酸合成以及相應(yīng)的關(guān)鍵生物合成酶3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A 還原酶和脂肪酶的表達(dá)[19]。為了更進(jìn)一步的探究稻米油的降膽固醇作用機(jī)制，通過(guò)RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)，研究了肝臟組織與膽固醇代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平。如圖5 所示，與LD 相比，RD 組的倉(cāng)鼠肝臟中低密度脂蛋白受體（Low Density Lipoprotein Receptor，LDLr）、細(xì)胞色素P450 家族成員（CYP27A1）顯著升高2.04 倍和2.14 倍（圖5a、5d），且肝細(xì)胞線粒體水通道蛋白8（AQP8）的表達(dá)量極顯著上調(diào)2.83倍（圖5f）。對(duì)于B 族I 型清道夫受體（SR-BI）、磺基轉(zhuǎn)移酶2A1（sulfotransferase 2A1）和脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白5（SLC27A5）的表達(dá)量無(wú)顯著差異（圖5b、5c、5e）。結(jié)果提示：稻米油能調(diào)控膽固醇代謝相關(guān)基因的表達(dá)。這些基因表達(dá)水平上升能促使膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)，分解代謝為膽汁酸排泄，抑制高膽固醇血癥。

圖5 攝入不同油脂對(duì)金黃地鼠肝臟中膽固醇代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.5 Effects of different oil intake on the expressions of cholesterol metabolizing-related genes in liver of golden hamster

3 討論

通過(guò)生化指標(biāo)的測(cè)定，有研究者比較了在大鼠飼料中分別加入5%wt和20%wt的稻米油或花生油（SFA可達(dá)28%）對(duì)機(jī)體膽固醇水平的影響，發(fā)現(xiàn)無(wú)論在5%wt 或20%wt 條件下，攝入稻米油均可以降低血清和肝臟中TC 濃度，并且無(wú)論在5%wt 或20%wt 條件下均能顯著降低VLDL-c+LDL-c 的濃度，但在5%wt條件下對(duì)HDL-c 無(wú)差異顯著性影響。該結(jié)果與本研究結(jié)果相似，即稻米油可以降低總膽固醇水平，特別是對(duì)LDL-c 有顯著影響[20]。臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，相較于攝入花生油，攝入稻米油的輕度高膽固醇血癥患者血清中TC、LDL-c 濃度及LDL-c/HDL-c 比值均降低[21]。Tomas 等[22]比較了稻米油或中短鏈脂肪酸豐富的椰子油（10%wt）攝入后對(duì)金黃地鼠膽固醇代謝的影響，同樣發(fā)現(xiàn)攝入稻米油可以降低血清TC 和non-HDL-c 的濃度，2018 年的一份研究分別比較了在金黃地鼠飼料中分別加入豬油、麥麩油或稻米油（9.5%wt）對(duì)其膽固醇代謝的影響，其結(jié)果也顯示攝入稻米油能顯著降低血清TC、LDL-c 和肝臟TC 濃度[23]，這些研究結(jié)果和本研究結(jié)果一致，均證明了稻米油具有改善膽固醇代謝的功能，但是對(duì)于其機(jī)理的報(bào)道還很少。

有研究表明，對(duì)小鼠[24]和倉(cāng)鼠[25]進(jìn)行高脂肪飲食喂養(yǎng)12 周以后，主動(dòng)脈根部的組織學(xué)病變和動(dòng)脈粥樣硬化，而在本次實(shí)驗(yàn)中飲食條件只是適用地鼠的正常生活水平，未發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化。然而對(duì)于肝損傷的指標(biāo)測(cè)定，先前的研究證實(shí)了喂食高脂飲食的大鼠中的ALT 和AST 濃度升高[26]。肝臟進(jìn)行HE 染色發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞顯示出與單核細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)的細(xì)胞質(zhì)空泡化和局灶性肝壞死，而高脂HFD+RBO（稻米油）組[24-26]肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)有輕微的空泡。他們的研究顯示稻米油能夠緩解肝臟受到損傷和我們的研究結(jié)果相一致，這些結(jié)果證明稻米油能夠?qū)C(jī)體起到保護(hù)和治療作用。通過(guò)RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)得出，食用稻米油能夠上調(diào)肝臟中膽汁酸和膽固醇合成相關(guān)基因的mRNA 表達(dá)水平。Reena 等[27]的研究也顯示稻米油能夠上調(diào)LDLr基因的表達(dá)，與本研究基本一致，但本研究現(xiàn)稻米油能夠上調(diào)一系列膽固醇代謝相關(guān)基因的表達(dá)。前人研究發(fā)現(xiàn)不同脂肪酸飲食影響LDLr表達(dá)[28]。提高LDLr的mRNA 表達(dá)水平，使細(xì)胞質(zhì)膜表面的內(nèi)吞作用結(jié)合LDL 進(jìn)入肝細(xì)胞內(nèi)代謝，從而清除血清中的LDL，促進(jìn)膽固醇的分解代謝。植物甾醇可以降低LDL-c 濃度[29-31]，能夠提高AQP8的mRNA 表達(dá)[32,33]，提高轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)入，促進(jìn)膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)，利于膽汁的分泌，減少膽固醇的水平。

4 結(jié)論

機(jī)體內(nèi)的膽固醇主要來(lái)源于食物和生物合成，而肝臟是膽固醇合成的主要場(chǎng)所。在肝臟中膽固醇通過(guò)極低密度脂蛋白分泌到血漿，其中大部分的膽固醇轉(zhuǎn)變?yōu)槟懼?，隨膽汁排出。在小腸下段，膽汁酸通過(guò)腸粘膜的重吸收回到肝臟，小部分經(jīng)腸道排出；機(jī)體膽固醇的異常與多種疾病的發(fā)生相關(guān)[34]。本研究發(fā)現(xiàn)：與食用豬油相比，食用稻米油可以降低金黃地鼠中血脂的水平，并改善其膽固醇的代謝。稻米油能調(diào)控CYP27A1、LDLr、AQP8、sulfotransferase 2A1等基因表達(dá)相關(guān)，這些基因?qū)儆谀懼岷湍懝檀己铣上嚓P(guān)的基因，稻米油可能通過(guò)調(diào)控膽汁酸和膽固醇合成相關(guān)的基因表達(dá)，降低機(jī)體的膽固醇水平。中國(guó)南方農(nóng)村傳統(tǒng)上都是食用豬油，本文采用豬油做對(duì)照，置換米糠油能明顯改善血脂和高膽固醇，本課題的研究能為人們科學(xué)使用油脂烹制食品提供重要的理論依據(jù)。