于普光，馮家勁，占學(xué)康，李 健，任 帥，陳科明，韋秋綾，何 瑞，李廣永

(1寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，銀川 750004；2寧夏醫(yī)科大學(xué)生育力保持教育部重點實驗室；3寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院泌尿外科；*通訊作者,E-mail:guangyongli1979@126.com)

陰道是女性的生殖器官，既是產(chǎn)道的一部分，也是主要的性器官。與腸管等其他管狀器官相似，陰道是一個由三層組織(即黏膜層、肌層和外膜)組成的中空管狀結(jié)構(gòu)，其黏膜層是非角化的鱗狀上皮，陰道肌層為平滑肌，肌束之間縱橫交錯成網(wǎng)格狀，陰道組織的血管和神經(jīng)分布于此[1]。發(fā)生在陰道的眾多疾病如非特異性陰道炎、陰道肌層病變、陰道囊腫、陰道上皮病變、陰道癌前病變、陰道癌等，都與血管神經(jīng)病變有密切關(guān)系[2]。近年來，基于陰道肌層神經(jīng)血管病變導(dǎo)致的疾病如萎縮性陰道炎、女性性功能障礙等的研究越來越多，這一系列疾病都說明血管神經(jīng)在疾病發(fā)生發(fā)展中的重要性[3]，而我們傳統(tǒng)的切片只是對組織進行冠狀位或矢狀位的切割，尤其對于血管和神經(jīng)這樣的組織不能充分顯示其完整性和走向分布。因此，本研究擬尋找一種新的可以顯示陰道血管和神經(jīng)全層的實驗方法，用于完整地顯露陰道組織神經(jīng)血管層，為陰道相關(guān)疾病的研究提供新的方法和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 動物

分別取雌性SD大鼠和ICR小鼠各20只作為研究對象，動物均由寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供(10752309202000082)。

1.2 主要儀器和試劑

本研究主要用到的試劑有丙酮溶液、10%中性緩沖福爾馬林(含4%甲醛)(上海至鑫化工有限公司)，HE染色試劑盒、Masson三色染色試劑盒和甘氨酸銀染色試劑盒(武漢賽維爾生物科技有限公司)、CD31單克隆抗體(Abcam艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司)、外科顯微器械(金鐘上海醫(yī)療器械有限公司)、立體式顯微鏡(德國徠卡Leica上海聚慕醫(yī)療有限公司)、防滑托載玻片和蓋玻片(江蘇世泰實驗器材有限公司)。

1.3 取材與固定

大鼠用10%水合氯醛以0.01 ml/g的劑量，小鼠用5%水合氯醛以0.01 ml/g的劑量行腹腔注射麻醉。待麻醉滿意后，在恥骨聯(lián)合上方做一1 cm切口剪開皮膚，逐層暴露，取下陰道組織，順著長軸剪開，在PBS中浸泡3 min左右后，將大鼠和小鼠的陰道組織分別放在提前預(yù)冷的4 ℃丙酮溶液與10%中性緩沖福爾馬林(pH 7.2～7.4)中固定，將組織放入4 ℃冰箱，在每種固定液中分別固定24 h和48 h，次日取出后再次用PBS沖洗干凈用于制作鋪片。

1.4 鋪片制作

將固定好的陰道組織放于盛有PBS的玻璃皿中，在立體式顯微鏡下將陰道組織用眼科剪分成合適大小的組織塊，如圖1所示，使用兩把顯微鑷，一把鑷子用于固定，另一把鑷子從組織的一個角剝起，剝離時動作應(yīng)輕柔，勿將組織撕壞，若一邊不好剝離，可以換一邊剝起，總之從四個角向中間剝相對容易，不容易把組織撕壞，先剝離黏膜層，待黏膜層剝離干凈后，翻轉(zhuǎn)組織另一面，剝離最外側(cè)漿膜層，然后逐漸剝離干凈，留下肌層即神經(jīng)血管所在層。將剝離好的組織泡在PBS中待用。

A.肉眼下的操作 B.顯微鏡下的鋪片圖C.將分離好的組織貼在載玻片上圖1 制作鋪片的關(guān)鍵步驟展示Figure 1 Display of the key steps in making a full-thickness slice

1.5 主要染色方法

在用中性緩沖福爾馬林和丙酮固定24 h后，對大鼠和小鼠的陰道鋪片進行以下染色，并統(tǒng)計分析不同固定方法下組織脫片率。

1.5.1 HE染色 將制備好的鋪片放入蘇木素染液浸染3 min，沖水反藍15 min，放入鹽酸酒精中分化3 s，沖水，放入伊紅溶液中1 min，沖水15 min，在顯微鏡下觀察染色情況，滿意后脫水，用中性樹膠封片。

1.5.2 嗜銀染色 將制備好的鋪片放入甘氨酸銀染液C處理5 min，蒸餾水漂洗3次后放入甘氨酸銀染液B(已提前37 ℃預(yù)熱好)中處理3～5 min，再放入甘氨酸銀染液A(已提前15 min于45 ℃預(yù)熱好)中，在顯微鏡下觀察還原效果，數(shù)秒后快速拿出，蒸餾水沖洗，如遇到染色背景過深需要用甘氨酸銀染液D處理，并用蒸餾水漂洗后脫水封片。

1.5.3 CD31免疫組化染色 將預(yù)先制好的鋪片用PBS漂洗3次，用微波爐在0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)中抗原修復(fù)15 min(丙酮固定的組織不需要此步驟)，待自然冷卻后加0.3%Triton-X100一滴孵育15 min，山羊血清工作液室溫封閉1 h，滴加一抗工作液CD31至于搖床上，4 ℃過夜；第2天從冰箱里拿出片子自然復(fù)溫30～60 min，PBS沖洗后加二抗，放入37 ℃孵箱孵育30 min，用DAB顯色液在顯微鏡下觀察顯色，顯色完成后用蘇木精染液染色4 min，鹽酸酒精分化，沖水返藍25 min，走上行梯度酒精脫水，中性樹膠封片。

1.5.4 Masson染色 脫水、封片均同HE染色，用試劑盒中的Masson復(fù)合染色液染色5 min，0.125%醋酸水溶液稍加清洗后放入5%磷鎢酸染液中染色5 min，用0.125%醋酸水溶液清洗2次，每次3 min，在用亮綠染液染色5 min后0.125%醋酸水溶液清洗2次，脫水并封片。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Fisher確切概率法統(tǒng)計分析不同固定方法下組織脫片率的差異，P<0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同固定方式對脫片的影響

在實驗過程中，兩種固定液都能很好地對陰道組織起固定作用，同種固定液固定24 h和48 h脫片無顯著差異(見表1)；不同的固定方式和固定時間對脫片的發(fā)生并沒有統(tǒng)計學(xué)意義(Fisher確切概率法，P小鼠=0.893和P大鼠=0.429，見表1)，但中性緩沖福爾馬林固定后組織較韌，更易剝離各層組織，而丙酮固定的組織易碎，組織不完整。

表1 不同固定方式對脫片的影響 (例)

2.2 各種染色結(jié)果

通過對鋪片進行HE染色、Masson染色、嗜銀染色和用于標(biāo)記顯示血管的CD31免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，HE染色能顯示陰道肌層的大體結(jié)構(gòu)，用于常見的形態(tài)學(xué)研究；Masson染色能很好地顯示膠原纖維和肌纖維，膠原纖維呈藍色或綠色，肌纖維呈紅色；嗜銀染色可用于神經(jīng)纖維的染色，暗黑色的組織即神經(jīng)纖維的走形；CD31是血管內(nèi)皮的標(biāo)志物，常用于血管的標(biāo)記(見圖2)。

在染色過程中，不同的固定方式和時間對HE染色、Masson染色和嗜銀染色的結(jié)果并沒有大的影響，這3種染色均能充分反映陰道組織鋪片的大體形態(tài)、膠原纖維和肌纖維的分布，以及神經(jīng)纖維的分布。但在免疫組化染色中，在同一實驗條件下，用DAB顯色液顯色相同的時間，用中性緩沖福爾馬林固定的組織要比丙酮固定的組織更容易染色，但中性緩沖福爾馬林24 h和48 h染色結(jié)果沒有差異(見圖2)。

3 討論

陰道正常生理功能的維持，除肌纖維、筋膜和韌帶組織外，還需要營養(yǎng)肌纖維的血管、調(diào)控肌纖維的神經(jīng)組織和陰道自身的應(yīng)激反應(yīng)功能[4,5]。在本研究中，通過對比丙酮和中性緩沖福爾馬林兩種固定劑對組織固定效果、組織質(zhì)地及剝離難易程度的影響，來尋找制作鋪片最理想的固定劑和實驗條件。通過實驗發(fā)現(xiàn)，兩種固定液都能很好地對陰道組織起固定作用，這與宋巖彪等[6]的研究結(jié)果相一致。丙酮是一種易揮發(fā)液體，可使蛋白質(zhì)沉淀，滲透力強，因此更適用于像陰道這種較韌組織的固定[7]，但不適用于固定細胞微絲骨架[8]，對糖原等黏多糖物質(zhì)也無固定作用[9]，因此相比于中性緩沖福爾馬林有較大的局限性。在是否容易脫片、細胞形態(tài)等方面無顯著差別，而且同種固定液固定24 h和48 h無顯著差別，因此建議固定滿24 h即可，時間短可能會影響固定效果，但超過24 h后繼續(xù)延長固定時間將無意義。在對組織質(zhì)地影響方面，經(jīng)中性緩沖福爾馬林固定后的組織相對較韌，更易剝離各層組織，而丙酮固定的組織易碎，組織不完整。從實驗結(jié)果來看，不同的固定方法對HE染色結(jié)果影響不大，但楊群等[4]認為含有甲醛的固定液會使組織結(jié)構(gòu)更清晰，在HE染色方面要優(yōu)于丙酮和95%乙醇。免疫組化染色對固定液的要求更高，相比于丙酮，中性緩沖福爾馬林固定使抗體更容易結(jié)合，這可能與這兩種固定劑對抗原的作用不同有關(guān)[10]，王璇等[11]通過對比不同的固定劑用于免疫組化染色后也認為含有甲醛的固定液優(yōu)于其他固定液，這可能是因為甲醛可使蛋白質(zhì)分子之間發(fā)生交聯(lián)，易于抗原與抗體結(jié)合。因此，筆者認為對于固定劑的選擇可以因人、因?qū)嶒炇业臈l件來定，但中性緩沖福爾馬林在制作鋪片上更有優(yōu)勢，對于抗原修復(fù)時擔(dān)心掉片的實驗者，建議使用丙酮固定，因為丙酮保存抗原的免疫活性較好[12]。

綜上所述，用中性緩沖福爾馬林固定至少24 h后即可在顯微鏡下完整剝離出用于顯示陰道神經(jīng)與血管的肌層組織，可以對其進行各種組織形態(tài)學(xué)的染色，這將為后期研究由陰道神經(jīng)血管引起的相關(guān)病變提供重要方法，成為研究陰道疾病的新技術(shù)。