楊武斌，唐金鳳，米本中

(1重慶市高新區(qū)人民醫(yī)院臨床藥學辦公室，重慶 400039；2重慶市人口和計劃生育科學技術(shù)研究院,國家衛(wèi)生健康委出生缺陷與生殖健康重點實驗室；3重慶市中藥研究院實驗動物研究所；*通訊作者,E-mail:919733824@qq.com)

肝纖維化是一種慢性肝損傷疾病，是指在病毒、酒精、藥物等刺激因素下所致的肝細胞外基質(zhì)(extra cellular matrix，ECM)過度沉積，是各種慢性肝病共同的病理學基礎[1]。持續(xù)的慢性肝損傷，會導致肝星狀細胞變得更具增殖性，并轉(zhuǎn)分化為成肌纖維母細胞。在肝纖維化形成的過程中，肝臟轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是調(diào)節(jié)ECM生成與沉積最重要的細胞因子之一，其可促使肝星狀細胞活化，并能促進Ⅰ型膠原蛋白(collagen type Ⅰ，Col Ⅰ)的表達，具有明顯的促肝纖維化作用，被認為是肝纖維化形成的關(guān)鍵因子[2,3]?；罨母涡菭罴毎氖湛s力增加歸因于細胞骨架蛋白和α平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的表達，故α-SMA的表達被用作肝星狀細胞激活的標志物[4]。早期肝纖維化是一個動態(tài)的病變過程，在適當干預條件下是可以逆轉(zhuǎn)的。目前，如何逆轉(zhuǎn)早期肝纖維化的病理過程已成為臨床工作和實驗研究的熱點。根據(jù)肝纖維化的臨床癥狀及體征表現(xiàn)，中醫(yī)將其歸屬于“脅痛”“積聚”等范疇。柴胡疏肝散(Chaihu Shugan powder，CSGS)是疏肝理氣法的代表方，具有疏肝理氣之功效，主治肝氣郁滯證[5,6]。本研究模擬肝纖維化的中醫(yī)肝郁血瘀病機，通過CCl4構(gòu)建大鼠肝纖維化模型，研究柴胡疏肝散對大鼠肝纖維化程度和相關(guān)細胞因子變化的影響，初步探討柴胡疏肝散對四氯化碳誘導的早期肝纖維化模型大鼠的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級SD大鼠60只，體質(zhì)量200～250 g，由重慶市中藥研究院實驗動物研究所提供，生產(chǎn)許可證號:SCXK(渝)2017-0003。在重慶市中藥研究院實驗動物研究所常規(guī)條件喂養(yǎng)(12 h光-暗循環(huán)，室溫22 ℃，濕度30%～40%)。

1.2 柴胡疏肝散水煎劑的制備

柴胡疏肝散(CSGS)包含的所有中藥材均購自重慶市帛霖藥業(yè)有限公司，經(jīng)重慶市中藥研究院米本中副研究員鑒定符合2020年版《中華人民共和國藥典》質(zhì)量規(guī)定。柴胡10 g，陳皮10 g，白芍6 g，枳殼6 g，川芎10 g，醋香附10 g，炙甘草2 g。稱20倍處方量，將中藥材充分浸泡30 min后，用10倍體積水煎1 h，取上清液，再用10倍體積水煎濃縮至含生藥2 g/ml，約540 ml。

1.3 試劑和儀器

FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒(天根生化科技有限公司)；SYBR Green master mix(美國KAPA Biosystems)；TRIzol Reagent(美國Life Technologies公司)；腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素1β(IL-1β)、白細胞介素6(IL-6)ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司)。PCR儀(美國Bio-Rad公司)；Vortex混合儀(上海啟前電子科技有限公司)；超凈工作臺(北京半導體設備一廠)。

1.4 方法

1.4.1 動物分組及造模 將60只SD大鼠隨機分為正常組、模型組、秋水仙堿組(陽性對照，0.2 mg/kg)、柴胡疏肝散低劑量組(CSGS-L組，3.5 g/kg)、柴胡疏肝散中劑量組(CSGS-M組，6.3 g/kg)、柴胡疏肝散高劑量組(CSGS-H組，12.6 g/kg)，每組10只。除正常組外，各組大鼠腹腔注射40% CCl4橄欖油溶液(1 ml/kg)，2次/周，共10周，建立肝纖維化模型[7]；正常組以等容量橄欖油腹腔注射代替。CSGS給藥組于造模同時灌胃給藥，正常組和模型組給予等量蒸餾水，每天1次。肝纖維化模型復制成功的評判標準：生化指標方面表現(xiàn)為血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總膽紅素(TBIL)、TNF-α、IL-1β和IL-6含量明顯升高；肝組織中TGF-β1、Col Ⅰ、α-SMA mRNA表達顯著升高；病理學變化表現(xiàn)為肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，有炎性細胞浸潤，并出現(xiàn)大量纖維增生[8,9]。第10周結(jié)束實驗，將全部大鼠禁食不禁水16 h，次日腹主動脈采血，取肝組織標本。

1.4.2 大鼠一般情況觀察 對實驗大鼠的外觀體征、行為活動、體質(zhì)量變化進行觀察記錄。

1.4.3 大鼠血清AST、ALT、TBIL檢測 第10周末，使用戊巴比妥鈉麻醉各組大鼠后，采集腹主動脈血液，每只大鼠約4 ml，室溫靜置1 h，以3 000 r/min離心10 min，分離血清，-20 ℃下保存。全自動生化分析儀檢測ALT、AST和TBIL的含量。

1.4.4 大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量測定 取“1.4.3”項下大鼠保存血清樣品，嚴格按照ELISA試劑盒說明書檢測TNF-α、IL-1β以及IL-6的含量水平。

1.4.5 HE染色法觀察肝組織病理學改變 大鼠的肝組織置于4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)脫水。脫水后的肝組織用石蠟包埋機包埋成肝組織蠟塊。然后將肝組織蠟塊切成4 μm的切片。石蠟切片進行常規(guī)脫蠟、水化，蒸餾水洗滌，蘇木素染色16 min，自來水洗去浮色，伊紅室溫染色15 s，梯度酒精脫水，二甲苯透明30 min。中性樹膠封片，顯微鏡下觀察顯色結(jié)果并拍照。

1.4.6 qRT-PCR檢測測定TGF-β1、Col Ⅰ、α-SMA mRNA的表達 按TRIzol試劑盒說明書提取大鼠肝組織總RNA，測定RNA的濃度及純度。按照FastKing cDNA試劑盒說明合成cDNA第一條鏈。qRT-PCR擴增目的基因，反應條件：95 ℃預變性15 min；94 ℃變性20 s，60 ℃退火/延伸34 s，共40個循環(huán)。β-actin作為內(nèi)參，結(jié)果采用2-ΔΔCt法進行相對定量分析。引物序列見表1。

表1 qPCR引物序列

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況

正常組大鼠狀態(tài)良好，活動靈敏，皮毛光澤，飲食和排便正常，體質(zhì)量增長正常。模型組大鼠精神萎靡，活動遲緩，皮毛無光澤，體質(zhì)量較造模前略增加，死亡1只。與模型組比較，柴胡疏肝散各組和秋水仙堿組狀況均有改善。造模第6周開始，模型組大鼠體質(zhì)量較正常組降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，柴胡疏肝散低、中、高劑量組和秋水仙堿組大鼠較模型組增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01，見表2)。

表2 各組大鼠不同時點體質(zhì)量比較 (g)

2.2 柴胡疏肝散對早期肝纖維化大鼠肝功能的影響

模型組大鼠肝細胞產(chǎn)生大量ALT、AST、TBIL，肝細胞嚴重受損，TBIL顯著升高，以上各指標與正常組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，見圖1)，說明大鼠肝臟攝取和排泄功能出現(xiàn)障礙，提示造模成功。與模型組相比，柴胡疏肝散低、中、高劑量組血清ALT、AST、TBIL均有不同程度的下降(P<0.05或P<0.01)，其中柴胡疏肝散高劑量組改善程度最明顯。柴胡疏肝散高劑量組與秋水仙堿組血清ALT、AST、TBIL含量相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見圖1)。

與正常組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01圖1 柴胡疏肝散對早期肝纖維化大鼠血清ALT、AST和TBIL含量的影響Figure 1 Effect of Chaihu Shugan powder on serum ALT, AST and TBIL levels in rats with early liver fibrosis

2.3 柴胡疏肝散對大鼠血清中早期肝纖維化炎癥因子的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β含量均顯著升高(P<0.01，見表3)，提示造模成功。與模型組比較，秋水仙堿組和柴胡疏肝散低、中、高劑量組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β含量均顯著降低(P<0.01)。與柴胡疏肝散低劑量組相比，柴胡疏肝散高劑量組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β含量均顯著降低(P<0.05)，柴胡疏肝散中劑量組大鼠血清中TNF-α、IL-1β含量均顯著降低(P<0.05)。與柴胡疏肝散中劑量組相比，柴胡疏肝散高劑量組大鼠血清中TNF-α、IL-1β含量均顯著降低(P<0.05)。柴胡疏肝散高劑量組與秋水仙堿組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表3)。

2.4 柴胡疏肝散對早期肝纖維化模型大鼠肝組織病理學的影響

HE染色顯示，正常組大鼠肝細胞結(jié)構(gòu)正常，肝細胞大小均勻，未見變性壞死。模型組肝小葉被破壞，肝細胞不同程度的水腫、結(jié)構(gòu)紊亂、明顯腫脹變形，有點狀、片狀壞死及炎性細胞浸潤，提示造模成功。秋水仙堿組較模型組肝組織結(jié)構(gòu)稍正常，細胞壞死和炎癥細胞浸潤減輕。與模型組比較，柴胡疏肝散低、中、高劑量組大鼠肝組織病理損傷均得到不同程度的改善，肝索排列較整齊，肝小葉基本恢復正常，炎性因子減少，細胞壞死減輕，其中以柴胡疏肝散高劑量組的大鼠治療效果最佳。秋水仙堿組與柴胡疏肝散高劑量組相比，肝小葉破壞和炎性因子浸潤仍然存在，僅表現(xiàn)為破壞程度和數(shù)量減少，二者程度相當(見圖2)。

表3 柴胡疏肝散對早期肝纖維化大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β含量的影響

圖2 HE染色觀察各組大鼠肝組織病理改變Figure 2 Pathological changes of liver tissue in each group by HE staining

2.5 柴胡疏肝散對肝組織TGF-β1、Col Ⅰ、α-SMA mRNA表達的影響

qRT-PCR結(jié)果分析顯示，與正常組比較，模型組TGF-β1、Col Ⅰ、α-SMA mRNA的表達顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01，見圖3)，提示造模成功。與模型組比較，秋水仙堿組TGF-β1、Col Ⅰ、α-SMA mRNA的表達顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，柴胡疏肝散各劑量組TGF-β1、Col Ⅰ、α-SMA mRNA的表達均顯著降低(P<0.05或P<0.01)，其中柴胡疏肝散高劑量組降低程度最為明顯。柴胡疏肝散高劑量組與秋水仙堿組肝組織TGF-β1、Col Ⅰ、α-SMA mRNA表達水平相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見圖3)。

與正常組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01圖3 柴胡疏肝散對肝組織TGF-β1、Col Ⅰ、α-SMA mRNA表達的影響Figure 3 Effect of Chaihu Shugan powder on TGF-β1, Col Ⅰ, α-SMA mRNA expression in liver tissue

3 討論

肝臟是人體解毒器官，有害物質(zhì)沉積于肝臟或免疫反應均可造成肝細胞損傷、肝組織變性，引起肝內(nèi)結(jié)締組織增生等一系列代償反應而形成肝纖維化。根據(jù)其病理學特點，正常的肝細胞之間有一些纖維組織，纖維組織特別少，如果纖維組織增加，則稱為肝纖維化，即為肝硬化發(fā)生的早期可逆階段。與早期肝硬化相比，晚期肝纖維化中肝組織假小葉及結(jié)節(jié)形成，已發(fā)展成肝硬化，為非可逆階段。因此，有效治療早期肝硬化即肝纖維化是阻止其向肝硬化甚至肝癌發(fā)展的重要手段。

目前化學合成藥物對于肝纖維化的治療效果并不理想，反而有引起藥源性疾病的風險。越來越多的學者開始對傳統(tǒng)中草藥進行研究，以期找到更好的治療肝纖維化藥物。臨床以秋水仙堿治療肝纖維化，但其具有較大的細胞毒性，常見的不良反應包括：消化道反應、骨髓毒性反應，嚴重時可導致骨髓抑制、腎臟衰竭等致命性并發(fā)癥。近年來，中醫(yī)藥治療肝病已成為研究熱點，柴胡疏肝散作為經(jīng)典方劑，以其多靶點、多途徑、整體調(diào)控的作用特點在肝纖維化治療中具有獨特的優(yōu)勢[10]。經(jīng)查閱文獻柴胡疏肝散在臨床使用中尚未見不良反應事件的明確報道[11,12]，但是因其在臨床廣泛治療眾多疾病，對于其方證的把握務需準確，才能保證其療效和安全性，從而逐步擴大本方新的治療領(lǐng)域和范圍[13]。本研究是以秋水仙堿為陽性對照，通過大鼠肝纖維化模型對柴胡疏肝散改善肝損傷和肝纖維化的作用進行了探索。

CCl4是一種選擇性肝毒性物質(zhì)，在肝臟中可引起毒性三氯甲基(CCL3)自由基，引起炎癥反應，能激活肝星狀細胞產(chǎn)生ECM，導致肝纖維化[14]。本研究模型組大鼠的肝結(jié)構(gòu)被破壞，出現(xiàn)炎性細胞浸潤，說明大鼠肝纖維化模型建立成功。AST、ALT和TBIL是臨床應用最廣泛的檢測肝功能的生化指標。當外部刺激因素導致肝細胞變性或者壞死時，肝細胞膜通透性增加甚至破裂，ALT和AST分別從胞漿和線粒體內(nèi)迅速釋放出來，血清中ALT和AST隨之顯著升高。此外，肝細胞變性或者壞死時會導致膽紅素代謝發(fā)生紊亂，血清中TBIL也會相應升高。因此，上述這些指標血清水平的高低能直接反應肝損傷程度。本研究模型組與正常組相比，大鼠血清中AST、ALT和TBIL水平均顯著升高，表明CCl4誘導的模型大鼠的肝功能明顯受損；而柴胡疏肝散干預后，大鼠血清中上述肝損傷指標水平均顯著降低，說明柴胡疏肝散可明顯改善肝纖維化大鼠肝功能。

炎癥途徑在肝纖維化的發(fā)生及發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6可以直接促進HSC的激活，參與和促進了肝纖維化的進程[15,16]。本研究顯示，與正常組相較，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量均顯著升高，表明CCl4誘導的模型大鼠出現(xiàn)了明顯的肝纖維化，提示模型建立成功；而給予秋水仙堿和柴胡疏肝散干預后，可顯著降低大鼠血清中炎癥因子含量，提示柴胡疏肝散可顯著減少大鼠肝臟炎癥浸潤，降低肝纖維化程度。

TGF-β1是目前公認的最強促纖維化因子之一，也是肝星狀細胞激活過程的最重要因子，在肝纖維化形成中發(fā)揮重要的作用[2]。在形成肝纖維化的過程中，α-SMA和Col Ⅰ的表達也逐漸增加。本研究模型組大鼠肝組織中Col Ⅰ、TGF-β1和α-SMA mRNA表達明顯增加，肝組織中膠原纖維增生，柴胡疏肝散干預后，Col Ⅰ、TGF-β1和α-SMA表達顯著降低，提示柴胡疏肝散可能通過降低TGF-β1和α-SMA的表達減少肝星狀細胞的活化，從而減輕肝纖維化。柴胡疏肝散還可能通過減少Col Ⅰ，降低細胞外基質(zhì)積累，減輕膠原聚集。

綜上所述，本研究表明，柴胡疏肝散具有改善CCl4誘導的大鼠早期肝纖維化的作用，其機制可能與抑制Col Ⅰ、TGF-β1和α-SMA的表達、降低炎癥因子的釋放有關(guān)。肝纖維化疾病的病因復雜、致病因素多。柴胡疏肝散抗肝纖維化的作用機制尚不明確，故還需要更深入的研究加以證實。