張玉明，亢德強(qiáng)，徐臣年，唐賽男，羅明華，李 婕，喬 銳*

(1聯(lián)勤保障部隊(duì)第967醫(yī)院心腎內(nèi)科，大連 116021；2武警四川省總隊(duì)醫(yī)院泌尿外科；3北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院干部病房一科；*通訊作者,E-mail:2981703671@qq.com)

流行病學(xué)研究揭示了重癥監(jiān)護(hù)患者急性腎損傷和膿毒癥之間不可避免的聯(lián)系。繼發(fā)于膿毒性損傷的腎功能障礙的發(fā)生通常會(huì)對(duì)住院患者的預(yù)后產(chǎn)生極其不利的影響[1,2]。不幸的是，除了持續(xù)腎臟替代療法或腎臟移植之外，還沒(méi)有有效的方法應(yīng)用于治療膿毒癥誘導(dǎo)的腎損傷的臨床試驗(yàn)[3]。膿毒癥誘導(dǎo)的腎損傷的病理生理機(jī)制是復(fù)雜的，尚未完全闡明。越來(lái)越多的證據(jù)表明，膿毒癥引起的促炎因子和抗炎因子水平的變化會(huì)導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致急性腎損傷[4,5]。此外，來(lái)自實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃团R床研究的數(shù)據(jù)也支持氧化應(yīng)激和活性氧增加在膿毒癥誘導(dǎo)的急性腎損傷進(jìn)展中的關(guān)鍵作用。

黃芪甲苷(astragaloside Ⅳ,AS-Ⅳ)是從中藥黃芪中提取出的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎癥、降低血糖等多重藥理作用[6]。值得注意的是，黃芪甲苷在多種損傷因素所致的腎臟疾病尤其是對(duì)糖尿病腎病的保護(hù)作用被越來(lái)越廣泛地報(bào)道[7-9]。然而黃芪甲苷能否減輕膿毒癥小鼠急性腎損傷及其治療機(jī)制尚未完全清楚，因此，本研究通過(guò)構(gòu)建膿毒癥小鼠模型，以初步觀察黃芪甲苷對(duì)膿毒癥小鼠急性腎損傷的保護(hù)作用，并探討其潛在的分子機(jī)制，為其在腎病防治中的進(jìn)一步應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

無(wú)特定病原體(SPF)雄性C57BL/6J小鼠40只，8周齡。黃芪甲苷(astragaloside Ⅳ,AS-Ⅳ)購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione,GSH)檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)Roche公司。超氧化物陰離子熒光檢測(cè)探針購(gòu)于美國(guó)ThermoFisher公司。SIRT1抗體和β-actin抗體購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology公司。多功能酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)Thermo公司，倒置顯微鏡購(gòu)于日本Olympus公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及處理 C57BL/6J小鼠被隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組(sham)、黃芪甲苷組(sham+AS-Ⅳ)、模型組(CLP)和模型+黃芪甲苷處理組(CLP+AS-Ⅳ)。應(yīng)用盲腸結(jié)扎穿孔手術(shù)建立膿毒癥模型。所有動(dòng)物在手術(shù)前12 h禁食，可自由飲水。通過(guò)腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉小鼠。在腹部中線切開(kāi)1 cm以暴露盲腸。用絲縫線在回盲瓣下方的底部將盲腸緊緊結(jié)扎，用20G的穿刺針在盲腸上扎穿兩次后，輕輕擠出少量糞便。此后，將盲腸放回腹膜腔，用無(wú)菌縫線縫合腹部。sham組小鼠進(jìn)行與CLP組相同的剖腹手術(shù)，但不結(jié)扎和穿刺盲腸。sham+AS-Ⅳ組和CLP+AS-Ⅳ組小鼠術(shù)后腹腔注射黃芪甲苷(100 mg/kg)治療，sham組和CLP組小鼠術(shù)后給予腹腔注射等體積生理鹽水處理。術(shù)后處理24 h采集血、尿等樣本并處死小鼠。

1.2.2 腎功能指標(biāo)測(cè)定 使用酶標(biāo)儀收集血樣以測(cè)量血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)和血清肌酐(serum creatinine，SCr)水平。根據(jù)各個(gè)ELISA試劑盒提供的說(shuō)明，收集尿樣以測(cè)量腎損傷分子-1(kidney injury molecule-1，KIM-1)和尿白蛋白/肌酐(urinary albumin/creatinine，UAlb/Cr)的表達(dá)水平。

1.2.3 腎臟組織染色 小鼠腎臟經(jīng)多聚甲醛固定和石蠟包埋后切成3 μm厚的切片。然后進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色以觀察腎組織的形態(tài)學(xué)變化。用倒置顯微鏡捕捉每個(gè)切片中隨機(jī)選擇的5個(gè)高倍視野。使用以下參數(shù)對(duì)腎組織的損傷量化進(jìn)行分級(jí)：細(xì)胞水腫、細(xì)胞凋亡、壞死細(xì)胞增多、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和出血。采用半定量量表對(duì)腎臟損傷進(jìn)行評(píng)分，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.4 SIRT1,腎組織促炎因子及凋亡指標(biāo)表達(dá)測(cè)定 使用TRIzol試劑從腎組織中提取總RNA。此后，使用高容量cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按照說(shuō)明書(shū)的方案合成cDNA。CFX96 RT-PCR系統(tǒng)用于qRT-PCR程序。靶基因的相對(duì)水平用2-ΔΔCt方法計(jì)算。引物序列見(jiàn)表1。

表1 相關(guān)引物序列

1.2.5 腎組織MDA含量、SOD和GSH活性測(cè)定 根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，采用ELISA方法測(cè)定腎組織中MDA含量、SOD和GSH活性，使用SpectraMax M5裝置對(duì)結(jié)果進(jìn)行分光光度分析。

1.2.6 腎組織ROS生成測(cè)定 腎臟在液氮中快速冷凍，并切成3 μm厚的切片。冷凍組織切片在黑暗潮濕的小室中用二氫乙錠(ethidium dihydrochloride，DHE)反應(yīng)混合物染色。使用Olympus FV1000激光共聚焦顯微鏡檢查每個(gè)樣品。使用ImageJ軟件測(cè)定切片中二氫乙錠的熒光強(qiáng)度，以評(píng)估腎組織中ROS的產(chǎn)生。

1.2.7 腎組織細(xì)胞凋亡檢測(cè) 小鼠腎臟經(jīng)多聚甲醛固定和石蠟包埋后切成3 μm厚的切片。經(jīng)脫蠟水化和PBS液浸洗后，用Proteinase K進(jìn)行細(xì)胞通透處理。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)制備TUNEL反應(yīng)混合液，滴加于標(biāo)本上，加蓋玻片在37 ℃暗濕盒中反應(yīng)1 h。PBS洗滌后加入DAPI染色液1 ∶2 000室溫孵育5 min。使用Olympus FV1000激光共聚焦顯微鏡觀察每個(gè)樣品，其中藍(lán)色熒光表示總細(xì)胞核，綠色熒光表示凋亡細(xì)胞核，以發(fā)綠色熒光細(xì)胞數(shù)占藍(lán)色熒光細(xì)胞數(shù)的百分比(%)表示細(xì)胞的凋亡率。

1.2.8 SIRT1蛋白表達(dá)及脫乙酰酶活性檢測(cè) 從腎組織中提取總蛋白，并使用BCA試劑盒進(jìn)行定量。通過(guò)SDS-PAGE分離蛋白樣品，然后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上。在室溫下用5%脫脂牛奶封閉2 h后，將膜在SIRT1(1 ∶1 000)、和β-actin(1 ∶5 000)的一抗中4 ℃孵育過(guò)夜。經(jīng)漂洗后再將膜與相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗一起孵育，并使用Image Lab分析蛋白條帶。

SIRT1脫乙酰酶活性根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)通過(guò)熒光測(cè)定法進(jìn)行測(cè)量。向每個(gè)孔中加入顯色劑Ⅱ后，將反應(yīng)混合物在37 ℃下使用SpectraMax M5儀器讀取熒光，激發(fā)波長(zhǎng)為360 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為460 nm。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 黃芪甲苷顯著減輕膿毒癥小鼠腎功能損傷

與sham組相比，CLP組小鼠的BUN、Scr、KIM-1、UAlb/Cr水平均明顯升高(P<0.05)；與CLP組相比，CLP+AS-Ⅳ組小鼠的BUN、Scr、KIM-1、UAlb/Cr均顯著降低(P<0.05)；而與sham組相比，sham+AS-Ⅳ小鼠上述腎功能指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)圖1)，提示黃芪甲苷能夠減輕膿毒癥小鼠腎功能損傷。

與sham組相比，*P<0.05；與CLP組相比，#P<0.05圖1 各組小鼠的腎功能比較Figure 1 Comparison of renal function between groups

2.2 黃芪甲苷顯著減輕膿毒癥小鼠腎組織結(jié)構(gòu)損傷

sham組和sham+AS-Ⅳ組小鼠腎組織結(jié)構(gòu)無(wú)明顯改變，無(wú)腎小球腫脹、壞死及腎小管內(nèi)鑄型形成(P>0.05)；CLP組小鼠腎組織可見(jiàn)明顯的腎組織結(jié)構(gòu)改變，如腎小球腫脹、壞死及腎小管內(nèi)鑄型形成，腎組織損傷評(píng)分顯著升高(P<0.05)；與CLP組相比，CLP+AS-Ⅳ組小鼠腎組織結(jié)構(gòu)改變明顯得到減輕，腎組織損傷評(píng)分顯著降低(P<0.05，見(jiàn)圖2)。提示黃芪甲苷顯著減輕膿毒癥小鼠腎組織結(jié)構(gòu)損傷。

圖2 各組小鼠的腎組織結(jié)構(gòu)變化比較 (HE染色)Figure 2 Comparison of changes of renal tissue structure between groups (HE staining)

2.3 黃芪甲苷顯著減輕膿毒癥小鼠腎組織炎癥反應(yīng)及凋亡水平

與sham組相比，CLP組小鼠腎組織中SIRT1表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α以及凋亡指標(biāo)Bax、Caspase-3的mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與CLP組相比，CLP+AS-Ⅳ組小鼠腎組織中SIRT1表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α以及凋亡指標(biāo)Bax、Caspase-3的mRNA表達(dá)明顯減少(P<0.05)；而與sham組相比，sham+AS-Ⅳ組小鼠上述SIRT1、促炎因子以及凋亡指標(biāo)的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)圖3)。提示黃芪甲苷可減輕膿毒癥小鼠腎組織炎癥反應(yīng)及凋亡水平。

與sham組相比，*P<0.05；與CLP組相比，#P<0.05圖3 各組小鼠腎組織炎癥反應(yīng)水平比較Figure 3 Comparison of inflammatory response levels in renal tissue between groups

2.4 黃芪甲苷顯著減輕膿毒癥小鼠腎組織氧化應(yīng)激損傷

與sham組相比，CLP組小鼠腎組織中ROS生成量和MDA含量顯著增加，SOD和GSH的含量顯著減低(P<0.05)；與CLP組相比，CLP+AS-Ⅳ組小鼠腎組織中ROS生成量和MDA含量顯著降低，SOD和GSH的含量顯著升高(P<0.05)；而與sham組相比，sham+AS-Ⅳ組小鼠上述氧化應(yīng)激指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)圖4)。提示黃芪甲苷可減輕膿毒癥小鼠腎組織氧化應(yīng)激損傷。

與sham組相比，*P<0.05；與CLP組相比，#P<0.05圖4 各組小鼠腎組織氧化應(yīng)激水平比較Figure 4 Comparison of renal oxidative stress level between groups

2.5 黃芪甲苷顯著降低膿毒癥小鼠腎組織細(xì)胞凋亡率

與sham組相比，CLP組小鼠腎組織細(xì)胞凋亡率明顯上升(P<0.05)；與CLP組相比，CLP+AS-Ⅳ組小鼠腎組織細(xì)胞凋亡率明顯下降(P<0.05)；而與sham組相比，sham+AS-Ⅳ小鼠腎組織細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)圖5)。提示黃芪甲苷顯著降低膿毒癥小鼠腎組織細(xì)胞凋亡率。

與sham組相比，*P<0.05；與CLP組相比，#P<0.05圖5 TUNEL染色檢測(cè)各組小鼠腎組織凋亡率Figure 5 Apoptosis level in renal tissue in each group by TUNEL staining

2.6 黃芪甲苷顯著促進(jìn)膿毒癥小鼠腎組織SIRT1信號(hào)表達(dá)及凋亡水平

與sham組相比，CLP組小鼠腎組織中SIRT1蛋白的表達(dá)及去乙酰化活性均顯著降低(P<0.05)，Bax、Caspase-3表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)；與CLP組相比，CLP+AS-Ⅳ組小鼠腎組織中SIRT1蛋白的表達(dá)及去乙?；钚跃@著增加(P<0.05)，Bax、Caspase-3表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；而與sham組相比，sham+AS-Ⅳ組小鼠腎組織中SIRT1蛋白的表達(dá)及去乙?；钚?、Bax、Caspase-3表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)圖6)。提示黃芪甲苷能夠促進(jìn)膿毒癥小鼠腎組織SIRT1信號(hào)表達(dá)及凋亡水平。

與sham組相比，*P<0.05；與CLP組相比，#P<0.05圖6 蛋白免疫印跡檢測(cè)各組小鼠腎組織SIRT1信號(hào)表達(dá)Figure 6 SIRT1 signal expression in renal tissue in each group by Western blot

3 討論

急性腎損傷是一種復(fù)雜的臨床綜合征，其定義為血清肌酐水平的快速增加和腎臟排泄功能的突然喪失，被視為與重癥患者死亡率升高相關(guān)的主要公共衛(wèi)生問(wèn)題[10,11]。盡管腎臟替代療法取得了技術(shù)進(jìn)步，但大多數(shù)患者仍然存在不良結(jié)果和嚴(yán)重的腎功能損害[3]。據(jù)報(bào)道，膿毒癥是危重患者急性腎損傷的重要誘因。比較研究表明，膿毒癥誘導(dǎo)的急性腎損傷患者其腎功能變化更明顯，腎臟組織學(xué)變化更劇烈，且總死亡率更高[12]。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)有效的治療策略來(lái)緩解并改善這種嚴(yán)重臨床并發(fā)癥的預(yù)后。

近年來(lái)多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，一種來(lái)源于豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的黃酮類(lèi)化合物黃芪甲苷，在腎臟相關(guān)疾病中發(fā)揮了重要的保護(hù)作用[13,14]。然而，黃芪甲苷能否減輕膿毒癥急性腎損傷及其潛在分子機(jī)制還有待進(jìn)一步探究。在本研究中，我們同樣發(fā)現(xiàn)，與CLP組相比，CLP+AS-Ⅳ組小鼠的BUN、Scr、KIM-1、UAlb/Cr均顯著降低，且CLP+AS-Ⅳ組小鼠腎組織結(jié)構(gòu)改變明顯得到緩解。以上結(jié)果提示，黃芪甲苷對(duì)抑制膿毒癥引起的急性腎損傷具有巨大的治療潛力。

目前，膿毒癥誘導(dǎo)的急性腎損傷機(jī)制是復(fù)雜的。來(lái)自實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃团R床研究的證據(jù)表明，炎癥在膿毒癥誘導(dǎo)的急性腎損傷中起著至關(guān)重要的作用[4]。全身性膿毒癥發(fā)生后，炎癥細(xì)胞因子和白細(xì)胞活性的增加導(dǎo)致腎臟進(jìn)一步的促炎反應(yīng)，從而導(dǎo)致微循環(huán)障礙、內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和功能障礙性腎小管-腎小球反饋，最終導(dǎo)致腎臟損傷[15]。因此，減輕炎癥反應(yīng)將是治療膿毒癥誘導(dǎo)的急性腎損傷的一個(gè)關(guān)鍵策略[16]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)與sham組相比，CLP組小鼠腎組織中促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-Α以及凋亡相關(guān)指標(biāo)Bax、Caspase-3的mRNA表達(dá)顯著升高；與CLP組相比，CLP+AS-Ⅳ組小鼠腎組織中上述促炎因子和凋亡相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)明顯減少，這表明黃芪甲苷可以通過(guò)其抗炎作用保護(hù)膿毒癥誘導(dǎo)的急性腎損傷。

由過(guò)量ROS引發(fā)的氧化應(yīng)激水平升高是急性腎損傷進(jìn)展的另一個(gè)重要機(jī)制。持續(xù)增強(qiáng)的氧化應(yīng)激過(guò)度消耗內(nèi)源性抗氧化酶，導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化、蛋白質(zhì)和DNA氧化，最終導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞以及腎組織的損傷[17,18]。在我們的研究中，與sham組相比，CLP組小鼠腎組織中ROS生成量和MDA含量顯著增加，SOD和GSH的含量顯著減低，與先前的研究結(jié)果相一致。大量研究發(fā)現(xiàn)，抑制氧化應(yīng)激是緩解膿毒癥誘導(dǎo)的急性腎損傷的重要方法。我們的結(jié)果還觀察到，與CLP組相比，CLP+AS-Ⅳ組小鼠腎組織中ROS生成量和MDA含量顯著降低，SOD和GSH的含量顯著升高。這表明黃芪甲苷不僅可以抑制過(guò)量ROS的產(chǎn)生，還可以恢復(fù)抗氧化系統(tǒng)的功能，突出了其在減輕膿毒癥小鼠腎組織氧化損傷方面的潛力。

當(dāng)遇到諸如敗血癥、局部缺血和毒物等損傷時(shí)，腎組織中會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞死亡，并嚴(yán)重影響腎臟功能。細(xì)胞凋亡是一種主要的細(xì)胞死亡類(lèi)型，可因由多種途徑介導(dǎo)的炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)所導(dǎo)致，極大地加劇了腎臟損傷和功能障礙[19,20]。本研究發(fā)現(xiàn)，與sham組相比，CLP組小鼠腎組織細(xì)胞凋亡率明顯上升(P<0.05)；與CLP組相比，CLP+AS-Ⅳ組小鼠腎組織細(xì)胞凋亡率明顯下降，這些觀察結(jié)果表明黃芪甲苷在預(yù)防膿毒癥誘導(dǎo)的急性腎損傷細(xì)胞凋亡中可能發(fā)揮了重要的保護(hù)作用。

SIRT1是一種NAD+(煙酰胺腺苷二核苷酸)依賴(lài)的脫乙?；?，因其在減輕氧化應(yīng)激和炎癥中的作用而被視為膿毒癥誘導(dǎo)的急性腎損傷的主要調(diào)節(jié)分子之一[21]。SIRT1的作用主要依賴(lài)于其下游靶標(biāo)的去乙?；鏵oxo1和NF-κB[22]。一方面，SIRT1對(duì)foxo1的去乙酰作用增加了抗氧化劑的合成，并提高了細(xì)胞抗氧化能力[23]。另一方面，SIRT1可以使NF-κB亞單位p65去乙?；?，以抑制炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，并降低細(xì)胞炎癥反應(yīng)[24]。因此，SIRT1表達(dá)或活性的降低與氧化應(yīng)激和炎癥的增加密切相關(guān)。本研究觀察到，與sham組相比，CLP組小鼠腎組織中SIRT1蛋白的表達(dá)及去乙?；钚跃@著降低，Bax、Caspase-3的表達(dá)增多；與CLP組相比，CLP+AS-Ⅳ組小鼠腎組織中SIRT1蛋白的表達(dá)及去乙?；钚跃@著增加，同時(shí)伴有凋亡相關(guān)指標(biāo)Bax、Caspase-3的表達(dá)減少，這表明黃芪甲苷可能通過(guò)激活SIRT1及其相關(guān)的下游信號(hào)分子來(lái)介導(dǎo)其減輕膿毒癥急性腎損傷的作用。

綜上所述，在CLP誘導(dǎo)的膿毒癥模型中，黃芪甲苷對(duì)膿毒癥誘導(dǎo)的急性腎損傷具有有益的作用，這由膿毒癥小鼠腎功能改善和腎組織學(xué)損傷減輕所證實(shí)。而黃芪甲苷發(fā)揮上述保護(hù)作用可能是通過(guò)激活SIRT1信號(hào)，進(jìn)而抑制了膿毒癥小鼠腎組織中的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)的。