宋姍姍,楊 洋,陳 陽(yáng),何 靜*

(1西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院產(chǎn)科，西安 710077;2西安市人民醫(yī)院，西安市第四醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心；*通訊作者,E-mail:drhej@126.com)

子癇前期(preeclampsia,PE)在孕婦中發(fā)病率約為4%～6%，是導(dǎo)致母胎死亡的重要因素之一[1]。目前PE發(fā)病機(jī)制尚不明確，相關(guān)研究提示PE為多種因素共同導(dǎo)致的疾病[2]。其中，螺旋動(dòng)脈重鑄不足而導(dǎo)致的胎盤(pán)功能障礙是該疾病的主要病因?qū)W說(shuō)；胎盤(pán)源性因素作用于全身系統(tǒng)，引發(fā)的包括血管內(nèi)皮功能障礙、炎性反應(yīng)激活等一系列病理表現(xiàn)可能為PE發(fā)生的潛在機(jī)制[3]。相關(guān)研究表明，非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)包括lncRNA、miRNA等在PE患者胎盤(pán)組織中差異性表達(dá)[4-6]，這些ncRNA能夠通過(guò)交互調(diào)控，影響下游靶基因，在調(diào)節(jié)細(xì)胞炎性損傷性死亡、內(nèi)皮細(xì)胞及滋養(yǎng)細(xì)胞功能等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

lncRNA-H19被發(fā)現(xiàn)在腫瘤發(fā)生、生殖系統(tǒng)功能調(diào)節(jié)等領(lǐng)域中發(fā)揮重要作用[7]。其中，lncRNA-H19在胎兒生長(zhǎng)受限患者的胎盤(pán)組織中低表達(dá)，并能夠間接調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、侵襲和自噬，從而與胎兒生長(zhǎng)受限發(fā)病相關(guān)[8]。提示lncRNA-H19能夠參與胎盤(pán)功能的建立過(guò)程。在血管內(nèi)皮細(xì)胞模型中，lncRNA-H19能夠通過(guò)發(fā)揮內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)性RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)作用，參與了腹主動(dòng)脈瘤的形成[9]；而lncRNA-H19的沉默能夠加重細(xì)胞焦亡，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生[10]。但lncRNA-H19與PE的相關(guān)性，及其參與PE疾病的初步機(jī)制目前尚不明確。本研究通過(guò)觀察lncRNA-H19與PE相關(guān)性，及其是否能夠參與HUVEC的炎性損傷調(diào)節(jié)過(guò)程，進(jìn)一步探討lncRNA-H19更多的相關(guān)生物學(xué)功能，及其參與PE的部分機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 臨床樣本

收集2021年1月至2021年8月在西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院產(chǎn)科住院行剖宮產(chǎn)分娩的15例PE晚孕患者(PE組)，診斷標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格依據(jù)第九版《婦產(chǎn)科學(xué)》[11]，該組患者除PE外無(wú)其他妊娠期合并癥，孕周(38.3±1.2)周，年齡(30.1±4.2)歲，體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)(26±1.9)kg/m2。同時(shí)收集同期住院分娩的正常孕婦15例作為對(duì)照組，該組患者無(wú)妊娠期合并癥，孕周(38.6±1.2)周，年齡(29.4±4.9)歲，BMI(26.1±2.3)kg/m2。兩組孕婦均為單胎初產(chǎn)婦，入院前均未接受任何治療，既往無(wú)遺傳性、傳染性疾病及代謝性疾病病史；無(wú)慢性病藥物使用、放射線及毒物接觸史，無(wú)家族性遺傳病史。兩組孕婦孕周、年齡、BMI差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員同意并批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào)：XYFY2021LSK-018)，所有患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 主要細(xì)胞、試劑和材料

HUVEC細(xì)胞購(gòu)自ATCC中國(guó)細(xì)胞庫(kù)。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、青霉素-鏈霉素(美國(guó)Gibco公司)；H2O2(美國(guó)Sigma公司)；F12K培養(yǎng)基、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)(中國(guó)武漢普諾賽科技有限公司)；PrimeScript RT reagent kit、SYBR Premix Extaq RT-PCR kit(日本TaKaRa公司)；Lipofectamine2000(美國(guó)ThermoFisher公司)；siRNA-H19質(zhì)粒(即lncRNA-H19抑制劑)及其陰性對(duì)照物(siRNA-H19 NC)(中國(guó)廣州吉賽生物科技股份有限公司)；TRIzol(美國(guó)Invitrogen公司)；PCR引物序列(中國(guó)北京擎科生物有限公司)；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、IL-18、IL-1β ELISA檢測(cè)試劑盒(中國(guó)上海碧云天公司)；p-ERK、p-JNK、p-p38、β-actin單克隆抗體、HRP標(biāo)記二抗(中國(guó)武漢博士德生物工程有限公司)；PVDF膜(美國(guó)Millipore公司)；ECL底物液(中國(guó)北京普利萊基因技術(shù)有限公司)；Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染試劑盒(美國(guó)BD公司)。

1.3 方法

1.3.1 血清及胎盤(pán)標(biāo)本收集 入院后在接受藥物及手術(shù)治療前，分次采集、收集納入的兩組患者晨起空腹肘靜脈血共計(jì)5 ml。所有血漿樣本均在采集后置促凝管中，4 ℃靜置過(guò)夜后2 000 r/min離心5 min，吸取上層血清至EP管中，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

于胎盤(pán)娩出后迅速收集兩組患者胎盤(pán)組織標(biāo)本，取1 cm3大小組織若干塊，PBS液中迅速漂洗后，置入液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將HUVEC細(xì)胞取出后解凍，接種于含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC細(xì)胞，用RPMI-1640培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，按每孔2×105個(gè)細(xì)胞量，均勻地接種于6孔板中，37 ℃、5%CO2飽和濕度條件培養(yǎng)過(guò)夜；待細(xì)胞生長(zhǎng)密度至80%左右時(shí)按照Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)要求轉(zhuǎn)染siRNA-H19及其對(duì)照物(siRNA-H19 NC)，轉(zhuǎn)染后6 h于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率(羧基熒光素酶FAM標(biāo)記對(duì)照)。轉(zhuǎn)染后進(jìn)行H2O2培養(yǎng)液干預(yù)，根據(jù)文獻(xiàn)[12]報(bào)道，干預(yù)濃度為300 μmol/L。實(shí)驗(yàn)分組：NC組(陰性對(duì)照)、H2O2組(H2O2干預(yù)培養(yǎng))、H2O2+H19抑制對(duì)照組(siRNA-H19陰性對(duì)照物轉(zhuǎn)染細(xì)胞+H2O2干預(yù)培養(yǎng))、H2O2+H19抑制組(siRNA-H19轉(zhuǎn)染細(xì)胞+H2O2干預(yù)培養(yǎng))。

1.3.3 qRT-PCR檢測(cè)lncRNA-H19 mRNA水平表達(dá) Trizol法分別提取血清標(biāo)本、胎盤(pán)組織中以及HUVEC細(xì)胞中總RNA；檢測(cè)RNA質(zhì)量后，按照PrimeScript RT reagent kit、SYBR Premix Extaq RT-PCR kit說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，40個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參，進(jìn)行PCR反應(yīng)。每次檢測(cè)設(shè)定3個(gè)復(fù)孔，每個(gè)樣本重復(fù)3次。根據(jù)PCR擴(kuò)增曲線，使用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因lncRNA-H19 mRNA水平的表達(dá)情況。

表1 目的基因引物序列

1.3.4 IL-1β、IL-18、p-ERK、p-JNK、p-p38表達(dá)水平的檢測(cè) 轉(zhuǎn)染48 h后，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟，檢測(cè)4組HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β、IL-18表達(dá)量，記錄酶標(biāo)儀測(cè)量的OD450值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

轉(zhuǎn)染48 h后，使用RIPA裂解液分別提取4組HUVEC細(xì)胞中總蛋白。檢測(cè)蛋白濃度后，Western blot檢測(cè)p-ERK、p-JNK、p-p38蛋白水平表達(dá)：配膠后十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)；將目的條帶電轉(zhuǎn)至PVDF膜；一抗4 ℃孵育過(guò)夜(抗體濃度：p-ERK 1 ∶1 000、p-JNK 1 ∶1 500、p-p38 1 ∶1 000、β-actin內(nèi)參1 ∶500)；HRP標(biāo)記二抗(1 ∶10 000)室溫孵育2 h；ECL顯影、定影，BandScan分析膠片灰度值。

1.3.5 HUVEC細(xì)胞成管能力檢測(cè) 轉(zhuǎn)染48 h后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC細(xì)胞，用F12K培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，按每孔2×105個(gè)細(xì)胞量，接種到6孔板中，37 ℃、5%CO2飽和濕度條件培養(yǎng)過(guò)夜；實(shí)驗(yàn)分組同1.3.2中細(xì)胞分組。培養(yǎng)48 h后，使用0.25%胰酶消化HUVEC，用無(wú)血清培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，按照每孔1×105/個(gè)細(xì)胞，均勻接種到預(yù)鋪有基質(zhì)膠的24孔板中，37 ℃、5%CO2過(guò)夜培養(yǎng)；培養(yǎng)8～12 h后拍照觀察，檢測(cè)量化指標(biāo)為總分支長(zhǎng)度及管腔數(shù)，使用ImageJ軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，后續(xù)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HUVEC細(xì)胞凋亡 實(shí)驗(yàn)分組同1.3.2中細(xì)胞分組，將HUVEC細(xì)胞消化后，使用PBS液重懸成為單細(xì)胞懸液，無(wú)水乙醇固定細(xì)胞后，按照Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟，給每組細(xì)胞樣本中加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC及5 μl PI，混勻后避光，反應(yīng)15 min后上樣至流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。使用Expo32 ADC Analysis系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)分析細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果；應(yīng)用凋亡指數(shù)B2+B4作為量化指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 HUVEC細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)

轉(zhuǎn)染后6 h于熒光顯微鏡下觀察HUVEC細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率超過(guò)90%(見(jiàn)圖1)。

圖1 HUVEC細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率 (×200，F(xiàn)MA標(biāo)記)Figure 1 Transfection efficiency of HUVEC cells (×200, FMA mark)

2.2 血清標(biāo)本、胎盤(pán)組織及HUVEC細(xì)胞中l(wèi)ncRNA-H19表達(dá)情況

qRT-PCR結(jié)果顯示，與正常組相比，PE組孕婦血清及胎盤(pán)組織中l(wèi)ncRNA-H19的表達(dá)降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見(jiàn)表2)。

表2 血清、胎盤(pán)組織中l(wèi)ncRNA-H19表達(dá)水平

表3 lncRNA-H19在HUVEC中mRNA水平表達(dá)情況

2.3 各組上清液中IL-1β、IL-18及細(xì)胞中p-ERK、p-JNK、p-p38的表達(dá)情況

ELISA結(jié)果顯示：H2O2組、H2O2+H19抑制對(duì)照組、H2O2+H19抑制組HUVEC上清液中IL-1β、IL-18水平均高于NC組(P<0.05，見(jiàn)表4)；與H2O2組、H2O2+H19抑制對(duì)照組相比，H2O2+H19抑制組上清液中IL-1β、IL-18表達(dá)水平均進(jìn)一步增高(P<0.05，見(jiàn)表4)。

Western blot結(jié)果顯示：H2O2組、H2O2+H19抑制對(duì)照組、H2O2+H19抑制組HUVEC細(xì)胞中p-ERK、p-JNK、p-p38蛋白水平表達(dá)均高于NC組(見(jiàn)表4，圖2)；與H2O2組和H2O2+H19抑制對(duì)照組相比，H2O2+H19抑制組HUVEC細(xì)胞中p-ERK、p-JNK、p-p38表達(dá)水平均增高(見(jiàn)表4，見(jiàn)圖2)。

表4 HUVEC上清液中IL-1β、IL-18表達(dá)水平(n=3,pg/ml)

2.4 各組HUVEC細(xì)胞管樣形成總分支長(zhǎng)度及管腔數(shù)情況

管樣形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NC組相比，H2O2組、H2O2+H19抑制對(duì)照組、H2O2+H19抑制組HUVEC細(xì)胞的總分支長(zhǎng)度及管腔數(shù)均降低(P<0.05，見(jiàn)圖3，表5)；與H2O2組、H2O2+H19抑制對(duì)照組相比，H2O2+H19抑制組HUVEC細(xì)胞的總分支長(zhǎng)度及管腔數(shù)均進(jìn)一步降低(P<0.05，見(jiàn)圖3，表5)。

NC組 H2O2組 H2O2+H19抑制對(duì)照組 H2O2+H19抑制組圖3 各組HUVEC血管形成情況 (×200)Figure 3 Angiogenesis ability of HUVECs in each group (×200)

表5 各組HUVEC管樣形成情況 (n=3)

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組HUVEC凋亡情況

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與NC組相比，H2O2組、H2O2+H19抑制對(duì)照組、H2O2+H19抑制組HUVEC細(xì)胞的凋亡率均增高(P<0.05，見(jiàn)圖4)；與H2O2組、H2O2+H19抑制對(duì)照組相比，H2O2+H19抑制組HUVEC的凋亡率增高(P<0.05，見(jiàn)圖4)。

圖4 各組HUVEC細(xì)胞凋亡率Figure 4 Apoptosis rate of HUVECs in each group

3 討論

PE是以高血壓、蛋白尿等多系統(tǒng)器官功能紊亂為主要表現(xiàn)的全身性疾病，是妊娠期導(dǎo)致孕產(chǎn)婦及胎兒不良結(jié)局的常見(jiàn)疾病[1]。眾所周知，胎盤(pán)功能異常與PE發(fā)病具有直接相關(guān)性[13]；PE時(shí)，由于胎盤(pán)淺著床，導(dǎo)致胎盤(pán)血流灌注異常，誘發(fā)氧化-抗氧化過(guò)程失調(diào)，出現(xiàn)母胎界面的氧化應(yīng)激損傷[14]；伴隨著胎盤(pán)的分泌效應(yīng)，始于胎盤(pán)的炎癥性改變也導(dǎo)致了PE患者從“局部”到“全身”的廣泛的全身性內(nèi)皮功能障礙，進(jìn)而出現(xiàn)多系統(tǒng)臨床癥狀。

正常的血管內(nèi)皮細(xì)胞功能在胎盤(pán)建立以妊娠維系等過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用，如出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、炎癥性反應(yīng)、內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激發(fā)生等，不僅會(huì)成為復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、PE等疾病的直接誘因[15]，也會(huì)導(dǎo)致PE中后期母體全身多系統(tǒng)并發(fā)癥的出現(xiàn)。而lncRNA-miRNA構(gòu)成的網(wǎng)路系統(tǒng)能夠參與上述病理生理過(guò)程，并且已經(jīng)在PE病因?qū)W研究中得到了明確[16,17]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)與正常孕婦相比，lncRNA-H19在PE患者血清及胎盤(pán)組織中均表達(dá)降低，提示從局部胎盤(pán)組織到母體全身循環(huán)系統(tǒng)，lncRNA-H19均存在差異性表達(dá)，lncRNA-H19可能與胎盤(pán)功能障礙、血管內(nèi)皮損傷等PE相關(guān)的病理過(guò)程存在相關(guān)性。我們?cè)赑E胎盤(pán)中發(fā)現(xiàn)的lncRNA-H19表達(dá)趨勢(shì)與張嫘等[8]在胎兒生長(zhǎng)受限胎盤(pán)組織中檢測(cè)到的表達(dá)趨勢(shì)一致。

雖然lncRNA能夠在轉(zhuǎn)錄水平以及表觀遺傳層面均發(fā)揮生理作用，但卻無(wú)法直接編碼功能性蛋白，其大多通過(guò)發(fā)揮ceRNA等作用方式調(diào)控miRNA從而實(shí)現(xiàn)其功用[18]。在人微血管內(nèi)皮細(xì)胞中，抑制lncRNA-H19表達(dá)條件下，導(dǎo)致miR-181a高表達(dá)，而miR-181a則進(jìn)一步通過(guò)降低絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)信號(hào)通路和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)通路激活，減少血管內(nèi)VEGF合成，進(jìn)而影響細(xì)胞成管能力[9]，提示lncRNA-H19能夠?qū)ρ仔酝樊a(chǎn)生影響。因H2O2能夠通過(guò)其強(qiáng)氧化作用誘發(fā)細(xì)胞炎性死亡，故本研究中，我們構(gòu)建了H2O2誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，驗(yàn)證了H2O2干預(yù)后HUVEC中p-ERK、p-JNK、p-p38及上清液中IL-1β、IL-18表達(dá)均增高；而在該細(xì)胞模型中抑制lncRNA-H19表達(dá)后，HUVEC中p-ERK、p-JNK、p-p38在蛋白水平進(jìn)一步增高，而培養(yǎng)上清中IL-1β、IL-18表達(dá)也呈相同趨勢(shì)；細(xì)胞功能驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)H2O2+H19抑制時(shí)，HUVEC管腔形成能力下降,凋亡率增高；綜上提示降調(diào)節(jié)lncRNA-H19表達(dá)能夠影響炎癥通路從而增強(qiáng)H2O2對(duì)HUVEC的炎性損傷。

炎性因素為PE病因之一，母胎界面促炎-抗炎免疫失衡、子宮灌注壓降低以及多種炎性通路涉及其中；作為炎性通路之一的MAPKs由細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular regulated kinases, ERK)、P38絲裂原激活蛋白激酶(P38 mitogen-activated protein kinases, P38 MAPK)以及JNK組成；ERK通過(guò)磷酸化(phosphorylated)過(guò)程，成為活化的p-ERK，并由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到核內(nèi)，進(jìn)而介導(dǎo)P38、JNK的轉(zhuǎn)錄活化，參與細(xì)胞增殖與分化、形態(tài)維持、凋亡等多種生物學(xué)過(guò)程[9]。而核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)為另外一條重要的炎性通路，該通路激活能夠促進(jìn)核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族含pyrin結(jié)構(gòu)域蛋白3(NOD-like receptor family, pyrin domain containing protein3,NLRP3)炎癥小體分泌炎性因子IL-1β及IL-18；而在A549細(xì)胞中，ERK的級(jí)聯(lián)磷酸化過(guò)程也能夠激活NF-κB通路[19]。ERK的磷酸化使得MAPKs/NF-κB通路具有部分共同路徑參與體內(nèi)炎癥過(guò)程。而多種lncRNA在循環(huán)系統(tǒng)細(xì)胞中通過(guò)調(diào)節(jié)MAPKs/NF-κB通路參與細(xì)胞炎癥性損傷已得到了驗(yàn)證[20]，其中l(wèi)ncRNA-H19被發(fā)現(xiàn)能夠抑制氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導(dǎo)的NF-κB激活[10]。結(jié)合本研究結(jié)果，提示：PE時(shí)，低表達(dá)的lncRNA-H19可能通過(guò)對(duì)下游miRNA發(fā)揮ceRNA樣作用，進(jìn)一步影響MAPKs通路磷酸水平及NF-κB下游炎性因子的產(chǎn)生，誘發(fā)HUVEC細(xì)胞功能異常、凋亡增加，一方面參與了胎盤(pán)形成異常，另一方面，母體血液中低表達(dá)的lncRNA-H19也可能加重了PE時(shí)母體血管內(nèi)皮損傷及全身炎癥反應(yīng)的進(jìn)展。既往研究[21]多集中于滋養(yǎng)細(xì)胞炎癥性損傷參與PE發(fā)病，而關(guān)于內(nèi)皮細(xì)胞層面的相關(guān)研究尚少；但是，本研究?jī)H進(jìn)行了初步的現(xiàn)象型研究，lncRNA-H19調(diào)控炎性通路參與PE發(fā)病的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。

綜上，lncRNA-H19在PE患者胎盤(pán)組織、血清中具有一致的低表達(dá)趨勢(shì)，明確了其與PE的相關(guān)性；lncRNA-H19可能通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥通路激活，影響了如HUVEC等內(nèi)皮細(xì)胞的炎性損傷過(guò)程；而PE時(shí)，在lncRNA-H19低表達(dá)的情況下，進(jìn)一步增強(qiáng)了炎癥通路的激活，參與了從胎盤(pán)界面到母體循環(huán)的炎性反應(yīng)產(chǎn)生過(guò)程。通過(guò)本研究，為進(jìn)一步探討lncRNA在PE發(fā)病過(guò)程中的具體作用方式，以及其能否具有成為PE疾病標(biāo)志物的潛力等方面提供了一定理論依據(jù)。