趙千影，汪棟材，吳海濱，林基偉，宋曉容

（深圳市中醫(yī)院，廣東 深圳 518000）

多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）是臨床常見的內(nèi)分泌紊亂疾病，多發(fā)于育齡期及青春期女性[1]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國PCOS發(fā)病率為5%～10%，且呈上升趨勢。PCOS可在早期影響患者生殖及內(nèi)分泌系統(tǒng)，造成其不孕，后期則易誘發(fā)高胰島素血癥、子宮內(nèi)膜癌、糖尿病、心腦血管疾病等并發(fā)癥[2]?？诜茉兴幨悄壳芭R床治療PCOS的首選方法，可調(diào)節(jié)月經(jīng)周期、增加排卵，以恢復(fù)生育能力，但對部分患者效果并不理想，且易加重胰島素抵抗[3]。菟絲子總黃酮是中藥菟絲子的主要活性成分之一，具有抗癌、抗氧化、提升免疫力、保肝、調(diào)節(jié)生殖系統(tǒng)功能等多種藥理活性[4]。有研究[5]表明，菟絲子總黃酮可增加卵巢質(zhì)量及卵泡數(shù)量、提高雌激素水平、提升卵巢功能，從而對卵巢早衰大鼠產(chǎn)生治療作用，但關(guān)于其對PCOS甲狀腺功能的影響及排卵障礙的治療作用研究尚少，且缺乏對應(yīng)的機制研究。本研究通過建立PCOS大鼠模型，觀察菟絲子總黃酮對PCOS大鼠的治療作用，并探討其相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 7周齡雌性SPF級SD大鼠45只，體質(zhì)量（170±10）g，健康狀況良好，購自北京科宇動物養(yǎng)殖中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2018-0010。飼養(yǎng)于清潔、通風(fēng)環(huán)境，溫度23 ℃左右，濕度60%左右，明暗周期12 h/12 h循環(huán)。本研究過程中處理動物時均符合2006年中華人民共和國科技部頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》，并經(jīng)本院實驗動物倫理委員會批準。

1.2 藥物與試劑 菟絲子總黃酮（陜西昂威生物醫(yī)藥科技有限公司，批號：20090912）；絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）通路激動劑表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）（北京華越洋生物科技有限公司，批號：62253-63-8）；脫氫表雄酮（dehydroepiandrosterone，DHEA）（上海滬震實業(yè)有限公司，批號：DKO124）；促甲狀腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）放射免疫試劑盒（批號：E-EL-R0976c）、游離三碘甲腺原氨酸（free triiodothyronine，F(xiàn)T3）放射免疫試劑盒（批號：E-EL-0079c）、游離甲狀腺素（free thyroxine，F(xiàn)T4）放射免疫試劑盒（批號：E-EL-0122c）均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；三碘甲腺原氨酸（triiodothyronine，T3）放射免疫試劑盒（批號：SP12617）、甲狀腺素（thyroxine，T4）放射免疫試劑盒（批號：SP12618）、促卵泡生長激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）微粒子酶免疫試劑盒（批號：SP12603）、黃體生成激素（luteinizing hormone，LH）微粒子酶免疫試劑盒（批號：SP12626）、雌二醇（estradiol，E2）微粒子酶免疫試劑盒（批號：SP12610）均購自武漢賽培生物科技有限公司；空腹胰島素（fasting serum lisulin，F(xiàn)INS）放射免疫試劑盒（中國臺灣Abnova公司，批號：KA3811）；兔抗大鼠p38 MAPK一抗（批號：ab221012）、兔抗大鼠p-p38 MAPK一抗（批號：ab284564）、兔抗大鼠ERK1/2一抗（批號：ab176640）、兔抗大鼠p-ERK1/2一抗（批號：ab126445）均購自美國Abcam公司。

1.3 主要儀器 CX33顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社）；AIA-1800全自動熒光磁微粒酶免疫分析儀（日本東曹株式會社）；Gel SMART凝膠成像儀[大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）股份公司]。

1.4 造模與分組 35只大鼠建立PCOS模型。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，頸背部皮下注射0.2 mL DHEA大豆油混合液（劑量：DHEA 60 mg/100 g體質(zhì)量），1次/d，持續(xù)20 d，每日早上觀察陰道涂片，若連續(xù)兩個動情周期上皮細胞均未角化，則表明動情周期混亂，PCOS模型構(gòu)建成功[6]。PCOS模型復(fù)制成功31只，采用隨機數(shù)字表法分為PCOS組（11只）、干預(yù)組（10只）、聯(lián)合組（10只）；另取10只正常大鼠注射0.2 mL大豆油，其余方法相同，設(shè)為對照組。

1.5 實驗給藥 確認建模成功次日，聯(lián)合組大鼠灌胃菟絲子總黃酮生理鹽水懸濁液（200 mg/kg）[7]，2 h后尾靜脈注射EGF PBS溶液（10 μg/kg）[8]；干預(yù)組大鼠灌胃菟絲子總黃酮生理鹽水懸濁液（200 mg/kg），2 h后尾靜脈注射等量PBS；對照組、PCOS組大鼠灌胃等體積生理鹽水，2 h后尾靜脈注射等量PBS，1次/d，持續(xù)21 d。

1.6 觀察指標(biāo) 末次干預(yù)后，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠，腹主動脈采血，4 ℃下3 000 r/min離心10 min（離心半徑8 cm），將獲取血清分成兩份，4 ℃冰箱保存，分別用于甲狀腺激素檢測及血糖指標(biāo)檢測；采血后頸椎脫臼處死大鼠，開腹取其雙側(cè)卵巢，切取部分卵巢組織，一半固定于4%多聚甲醛24 h，脫水、透明、浸蠟、包埋，切為4 μm連續(xù)病理切片，用于HE染色，另一半投入液氮中保存，用于蛋白檢測。

1.6.1 血清甲狀腺激素水平 取4 ℃保存血清，采用放射免疫分析法檢測血清TSH、FT3、FT4、T3、T4水平，根據(jù)試劑盒說明書設(shè)計實驗步驟，計算血清TSH、FT3、FT4、T3、T4水平。

1.6.2 血清性激素水平 取4 ℃保存血清，采用微粒子酶免疫分析法及全自動熒光磁微粒酶免疫分析儀檢測FSH、LH、E2水平。

1.6.3 血清FINS、HOMA-IR 取4 ℃保存血清，經(jīng)血糖儀檢測空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）、放射免疫試劑盒檢測FINS，計算胰島素抵抗指數(shù)（homeostasis model assessment for insulin resistance，HOMA-IR）。HOMA-IR=FBG×FINS/22.5。

1.6.4 HE染色觀察卵巢組織病理學(xué)改變及排卵情況 取卵巢組織切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，移入蘇木精溶液浸泡8 min，自來水沖洗，鹽酸酒精分化液分化，自來水沖洗，促藍液反藍，移入伊紅溶液染色2 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，滴加中性樹脂封片，光鏡下觀察卵巢組織病理變化，記錄排卵數(shù)、囊樣擴張卵泡數(shù)。排卵率=有排卵大鼠數(shù)/該組大鼠數(shù)×100%。平均排卵數(shù)=黃體總數(shù)/該組大鼠數(shù)×100%。囊性擴張卵泡率=囊樣擴張卵泡總數(shù)/該組大鼠數(shù)×100%。

1.6.5 Western blotting法檢測卵巢組織p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白相對表達量 取液氮中保存的卵巢組織，剪碎并充分研磨，勻漿后加入RIPA液裂解細胞，移至離心管內(nèi)，低溫離心機9 000 r/min離心15 min（離心半徑10 cm），經(jīng)BCA試劑盒定量蛋白。取40 μg蛋白樣本，以1∶4的體積比混合上樣緩沖液，80 V電壓下行凝膠電泳分離，濕法轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，TBST清洗，混合工作濃度1∶500的兔抗大鼠p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2一抗，4 ℃搖床孵育過夜，TBST清洗，加入二抗（1∶2 000）混勻，室溫孵育40 min，ECL發(fā)光，暗盒顯影，采用凝膠成像分析儀分析蛋白條帶灰度值，p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白相對表達量分別為p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值。計算p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 通過SPSS 23.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以（）表示，多樣本資料比較用單因素方差分析，以LSD-t行兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清甲狀腺激素指標(biāo)比較 與對照組比較，PCOS組大鼠血清TSH水平明顯升高（P＜0.05），F(xiàn)T3、FT4、T3、T4水平均明顯降低（P＜0.05）；與PCOS組比較，干預(yù)組大鼠血清TSH水平明顯降低（P＜0.05），F(xiàn)T3、FT4、T3、T4水平均明顯升高（P＜0.05）；與干預(yù)組比較，聯(lián)合組大鼠血清TSH水平明顯升高（P＜0.05），F(xiàn)T3、FT4、T3、T4水平均明顯降低（P＜0.05）。（見表1）

表1 各組大鼠血清甲狀腺激素指標(biāo)比較（）

表1 各組大鼠血清甲狀腺激素指標(biāo)比較（）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與PCOS組比較，bP＜0.05；與干預(yù)組比較，cP＜0.05

2.2 各組大鼠血清性激素水平比較 與對照組比較，PCOS組大鼠血清LH水平明顯升高（P＜0.05），F(xiàn)SH、E2水平均明顯降低（P＜0.05）；與PCOS組比較，干預(yù)組大鼠血清LH水平明顯降低（P＜0.05），F(xiàn)SH、E2水平均明顯升高（P＜0.05）；與干預(yù)組比較，聯(lián)合組大鼠血清LH水平明顯升高（P＜0.05），F(xiàn)SH、E2水平均明顯降低（P＜0.05）。（見表2）

表2 各組大鼠血清性激素水平比較（）

表2 各組大鼠血清性激素水平比較（）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與PCOS組比較，bP＜0.05；與干預(yù)組比較，cP＜0.05

2.3 各組大鼠胰島素抵抗指標(biāo)比較 與對照組比較，PCOS組大鼠FINS、HOMA-IR水平均明顯升高（P＜0.05）；與PCOS組比較，干預(yù)組大鼠FINS、HOMA-IR水平均明顯降低（P＜0.05）；與干預(yù)組比較，聯(lián)合組大鼠FINS、HOMA-IR水平均明顯升高（P＜0.05）。（見表3）

表3 各組大鼠胰島素抵抗指標(biāo)比較（）

表3 各組大鼠胰島素抵抗指標(biāo)比較（）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與PCOS組比較，bP＜0.05；與干預(yù)組比較，cP＜0.05

2.4 各組大鼠卵巢組織病理改變情況 對照組大鼠卵巢組織中可觀察到處于不同發(fā)育階段的卵泡，黃體數(shù)量較多，卵泡囊性擴張極少；PCOS組大鼠卵巢結(jié)構(gòu)紊亂，可觀察到較多卵泡囊性擴張，竇前卵泡、閉鎖卵泡數(shù)量增加，發(fā)育期卵泡與黃體數(shù)量明顯減少；與PCOS組比較，干預(yù)組、聯(lián)合組大鼠卵巢結(jié)構(gòu)有所改善，可觀察到卵泡囊性擴張，以及一定數(shù)量的發(fā)育期卵泡及黃體，竇前卵泡、閉鎖卵泡數(shù)量有所減少，其中干預(yù)組改善效果優(yōu)于聯(lián)合組。（見圖1）

2.5 各組大鼠排卵情況比較 與對照組比較，PCOS組大鼠排卵率明顯降低（P＜0.05），平均排卵數(shù)明顯減少（P＜0.05），囊性擴張卵泡率明顯升高（P＜0.05）；與PCOS組比較，干預(yù)組大鼠排卵率明顯升高（P＜0.05），平均排卵數(shù)明顯增加（P＜0.05），囊性擴張卵泡率明顯降低（P＜0.05）；與干預(yù)組比較，聯(lián)合組大鼠排卵率明顯降低（P＜0.05），平均排卵數(shù)明顯減少（P＜0.05），囊性擴張卵泡率升高（P＜0.05）。（見表4）

表4 各組大鼠排卵情況比較（）

表4 各組大鼠排卵情況比較（）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與PCOS組比較，bP＜0.05；與干預(yù)組比較，cP＜0.05

2.6 各組大鼠卵巢組織p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2比較 與對照組比較，PCOS組大鼠卵巢組織p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2明顯升高（P＜0.05）；與PCOS組比較，干預(yù)組大鼠卵巢組織p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2明顯降低（P＜0.05）；與干預(yù)組比較，聯(lián)合組大鼠卵巢組織p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2明顯升高（P＜0.05）。（見表5、圖2）

表5 各組大鼠卵巢組織p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2 比較（）

表5 各組大鼠卵巢組織p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2 比較（）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與PCOS組比較，bP＜0.05；與干預(yù)組比較，cP＜0.05

3 討 論

PCOS是由下丘腦-垂體-卵巢軸代謝紊亂引起的非器質(zhì)性疾病，臨床表現(xiàn)為月經(jīng)周期紊亂、排卵異常、胰島素抵抗、高雄激素血癥等，以雙側(cè)卵巢纖維化多囊性變，體積增大，膜下出現(xiàn)囊性擴張卵泡為主要病理改變[9]。肥胖、月經(jīng)周期延長、缺乏運動、不良飲食習(xí)慣、母親孕期健康不佳等均是PCOS的危險因素，目前其發(fā)病機制尚未被完全闡明，多認為與胰島素抵抗、下丘腦內(nèi)分泌失調(diào)、甲狀腺功能異常、遺傳及環(huán)境因素等相關(guān)，其中胰島素抵抗機制被更多學(xué)者認可[10]。甲狀腺激素可發(fā)揮胰島素拮抗作用，其水平異?？捎绊懘傩韵偌に鼗钚?，促使卵巢增大，加速PCOS發(fā)病，胰島素抵抗加重可提升黃體生成素及雄激素水平，降低卵泡刺激素活性，從而減少排卵數(shù)量[11-12]。因此，尋找調(diào)節(jié)甲狀腺激素同時降低胰島素抵抗的新型治療手段，對于PCOS治療具有積極意義。

中醫(yī)學(xué)將PCOS歸于“月經(jīng)不調(diào)”“閉經(jīng)”“不孕”等范疇，認為“沖任起于胞宮，隸屬肝腎”。本病主要病機為稟賦不足、后天失養(yǎng)、腎陽不足、肝氣郁結(jié)、逆行犯脾，以致精血不足、血失流暢、任沖不通、天癸不至、胞宮虛寒、無血可下，子宮無法攝精成孕，終而發(fā)病。腎虛是其根本病因，故治療應(yīng)以補腎填精、活血化瘀為主[13]。中藥菟絲子又稱豆寄生，是臨床常用補腎藥材，取自雙子葉寄生植物菟絲子干燥成熟種子，性平，味辛、甘，歸肝經(jīng)、腎經(jīng)、脾經(jīng)，可補腎、固精、止瀉、明目。唐代名家甄權(quán)言其可治虛冷，填精益髓，去腰疼膝冷?，F(xiàn)代中醫(yī)著作《山東中藥》記載，菟絲子可治婦人習(xí)慣性流產(chǎn)[14]。菟絲子總黃酮是菟絲子中黃酮類化合物的總稱，作為一種植物雌激素，可在人體雌激素水平較低時表現(xiàn)類雌激素效應(yīng)，在雌激素水平較高時表現(xiàn)抗雌激素效應(yīng)，發(fā)揮其雌激素平衡作用[15]。有學(xué)者[16]認為，菟絲子總黃酮可修復(fù)子宮內(nèi)雙酚A誘導(dǎo)的小鼠后代卵巢功能障礙，提升促卵泡激素水平，促進排卵。本研究結(jié)果顯示，與PCOS組比較，干預(yù)組大鼠血清TSH、LH、FINS、HOMA-IR水平及囊性擴張卵泡率明顯降低，F(xiàn)T3、FT4、T3、T4、FSH、E2水平及排卵率明顯升高，平均排卵數(shù)明顯增加，提示菟絲子總黃酮可改善PCOS大鼠甲狀腺激素及性激素水平，降低胰島素抵抗，促進排卵。

MAPK/ERK通路是胞外至胞核信息傳遞的重要通路之一，廣泛參與細胞增殖、遷移、分化等過程。p38 MAPK、ERK是該通路重要調(diào)節(jié)因子，均屬于MAPK家族。細胞外刺激激活p38 MAPK后，磷酸化的p38 MAPK可進入細胞核，激活下游酶蛋白引發(fā)酶促反應(yīng)，激活ERK1/2，p-ERK1/2激活下游相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，降低胰島素受體底物活性，從而增加胰島素抵抗[17-18]。YE H等[19]研究認為，抑制MAPK/ERK通路可改善PCOS大鼠卵巢形態(tài)，提升促卵泡激素水平，減輕胰島素抵抗。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，PCOS組大鼠卵巢組織p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2均明顯升高，干預(yù)組大鼠卵巢組織p-p38 MAPK/p38MAPK、-ERK1/2/ERK1/2均明顯降低，且聯(lián)合組大鼠血清TSH、LH、FINS、HOMA-IR水平、囊性擴張卵泡率升高，F(xiàn)T3、FT4、T3、T4、FSH、E2水平、排卵率均明顯降低，平均排卵數(shù)減少，提示MAPK/ERK通路在PCOS中異常激活，菟絲子總黃酮可能通過調(diào)節(jié)該通路對PCOS產(chǎn)生治療作用。

綜上所述，菟絲子總黃酮可改善PCOS大鼠甲狀腺激素及性激素水平，降低胰島素抵抗，促進排卵。其作用機制可能與抑制MAPK/ERK通路有關(guān)。