黃興裕，吳秀華

(1.贛南師范大學(xué)體育學(xué)院，江西 贛州 341000；2.贛南師范大學(xué)科技學(xué)院，江西 贛州 341000)

8-羥基脫氧鳥苷(8-hydrox-2 deoxyguanosine，8-OHdG)是活性氧攻擊DNA分子中的鳥嘌呤堿基第8位碳原子而產(chǎn)生的一種氧化性加合物，它是機(jī)體DNA損傷的敏感標(biāo)志物。8-羥基鳥嘌呤DNA糖苷酶1(8-oxoguanine DNA glycosylase 1,OGG1)是哺乳動物的主要DNA糖基化酶之一，它是反映機(jī)體DNA堿基修復(fù)能力的重要指標(biāo)。如果體內(nèi)修復(fù)系統(tǒng)正常，OGG1可切除8-OHdG,并將正常鳥嘌呤添加到該部位，那么被切除的8-OHdG將被釋放入血。因此，研究中常將8-OHdG和OGG1作為機(jī)體DNA堿基損傷和修復(fù)程度的檢測指標(biāo)。[1]

氧化應(yīng)激(Oxidative Stress，OS)是指自由基的產(chǎn)生與抗氧化保護(hù)之間的不平衡狀態(tài)，由此將給機(jī)體帶來一系列的氧化損傷，包括DNA損傷、脂質(zhì)氧化和蛋白質(zhì)氧化等。[2]在人的正常衰老過程中，體內(nèi)活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)的累積將不斷增加，且抗氧化成分(如抗氧化酶活性)將逐漸下降，由此將導(dǎo)致機(jī)體的氧化應(yīng)激水平和氧化損傷日趨嚴(yán)重。[3]有研究指出，年齡增長和OS水平提高而引起DNA堿基損傷主要有兩方面的表現(xiàn)：一是堿基損傷的增加，如8-OHdG生成增多；二是修復(fù)能力的下降，如OGG1的活性下降。[4]

體育運動一直被認(rèn)為是影響機(jī)體氧化應(yīng)激和DNA堿基損傷的重要因素之一。然而，運動對機(jī)體產(chǎn)生的氧化損傷的具體效應(yīng)往往取決于運動的類型、方式、持續(xù)時間和強度等要素。[5-6]實驗研究表明，進(jìn)行規(guī)律的中低強度運動對降低8-OHdG的產(chǎn)生和提高OGG1的活性具有顯著意義。[7-8]太極拳作為我國一項重要的傳統(tǒng)體育項目，屬于中等強度類型的運動。[9]相關(guān)文獻(xiàn)表明，太極拳運動對降低女大學(xué)生[10]、中年女性[11]和Ⅱ型糖尿病患者[12]的機(jī)體氧化應(yīng)激水平有積極作用。我們先前的研究證實，習(xí)練太極拳可有效提高久坐女大學(xué)生的血漿OGG1活性。[13]鑒于此，本研究通過對血漿8-OHdG和OGG1等指標(biāo)的測試，研究習(xí)練太極拳后久坐老年人DNA堿基損傷、修復(fù)及氧化應(yīng)激水平的變化，旨在為太極拳干預(yù)改善機(jī)體DNA損傷及其修復(fù)提供實驗證據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

本研究以60～70歲老年人為實驗對象，招募的納入和排除標(biāo)準(zhǔn)如下。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)未曾有太極拳練習(xí)經(jīng)歷者；(2)近三個月參與體育鍛煉的時間≤1h/周者；(3)不抽煙、不喝酒、未有外源性激素使用史者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)正使用具有抗氧化特性的保健品或藥品者；(2)心血管和呼吸道疾病、糖尿病、及癌癥病史者；(3)血壓控制不佳的高血壓患者；(4)當(dāng)前膝痛者；(5)患有退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病者，如帕金森病、中風(fēng)和癡呆；(6)近一年下肢出現(xiàn)骨折者。招募時對符合標(biāo)準(zhǔn)的對象進(jìn)行即刻的相關(guān)健康指標(biāo)測試。最終，本研究共招募到10名(5男5女)老年人志愿者，其血壓與全血計數(shù)指標(biāo)均處正常參考值范圍(如表1所示)。運動干預(yù)前，10名志愿者均簽署了實驗知情同意書。研究中要求所有對象在實驗全程保持慣有的飲食行為和日?；顒拥壬罘绞?。

表1 實驗對象基本信息和全血計數(shù)指標(biāo)值(n=10,X±S)

1.2 太極拳習(xí)練方案

本研究采取單組實驗的方案，安排全部實驗參與者進(jìn)行5次/周(周一至周五)、持續(xù)16周的太極拳鍛煉。其中，第1～2周為太極拳教學(xué)階段，由教學(xué)經(jīng)驗豐富的太極拳老師開展24式簡化太極拳教學(xué)，確保10次課將全部24個動作教授完，且志愿者能在教師帶領(lǐng)下較好地完成全套動作。第3～16周為實驗的第二階段，該階段執(zhí)行7遍/次太極拳伴樂(李德印口令)練習(xí)的整體方案：1～5遍和6～7遍均為連續(xù)性練習(xí)，兩組練習(xí)間隔約15分鐘，用于機(jī)體恢復(fù)和動作技術(shù)的糾錯。為此，連同10分鐘以牽拉為主的準(zhǔn)備活動和5分鐘的放松活動一起，本研究相關(guān)的太極拳干預(yù)的每次練習(xí)時長約為70分鐘。

1.3 測試指標(biāo)與方法

本研究主要測試的指標(biāo)包括血漿8-OHdG、血漿OGG1及氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)。實驗中分別于實驗前(0W)、第8周(8W)、第12周(12W)和第16周(16W)共進(jìn)行四次測試。血液采集于早晨7∶00—8∶30完成，自肘正中靜脈處取全血3 ml至肝素抗凝管，經(jīng)3000 rpm離心5 min后將血漿分離并于-80 ℃冰箱冷凍保存待測。

1.3.1 8-OHdG和OGG1的測試

采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)分別對血漿8-OHdG濃度和OGG1活力進(jìn)行檢測，以反映機(jī)體DNA的損傷程度及其修復(fù)能力。實驗試劑購自美國圣克魯茲生物技術(shù)有限公司(Santa Cruz Biotechnology,Inc.USA)。樣品測定時按試劑使用說明嚴(yán)格操作，主要包括室溫放置試劑(40 min)并搖勻、稀釋標(biāo)準(zhǔn)液、加樣(40 μl)、配液、洗滌、顯色、終止等一系列步驟。之后通過酶標(biāo)儀(華東電子DG5033A)于450 m處測定OD值，對照制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品含量。

1.3.2 氧化應(yīng)激指標(biāo)

本研究選取的氧化應(yīng)激指標(biāo)有：血漿超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)和羥自由基抑制能力(OH·-IC)。指標(biāo)的測試試劑全部購自南京建成生物工程研究所，測試時按試劑說明嚴(yán)格規(guī)范操作，測試方法為分光光度計法(分光光度計：UNICO7200,USA)。另外，測試時(含8-OHdG和OGG1)每個樣本均設(shè)置雙孔，即每個樣品測兩次，后取均值作為最終樣品指標(biāo)值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 研究結(jié)果

2.1 習(xí)練太極拳對老年人血漿8-OHdG與OGG1的影響

如表2所示，血漿8-OHdG濃度在實驗干預(yù)中表現(xiàn)出先增加后下降的整體趨勢，其中在第8周達(dá)最大值。第16周(8.1194 ng/ml)與干預(yù)前(8.1209 ng/ml)無顯著差異(P>0.05)，但第8周和第12周明顯高于干預(yù)前(P<0.05)。血漿OGG1的活性在運動干預(yù)后的第8、第12和第16周均有顯著提高(P<0.05)。同時，從表2和圖1可見，除第16周外(P=0.591)，血漿8-OHdG與OGG1在干預(yù)前(P=0.000)、第8周(P=0.002)和第12周(P=0.029)均呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.975、0.851和0.685。

表2 不同時間點血漿8-OHdG與OGG1比較及其相關(guān)關(guān)系表

圖1 本研究各時間點8-OHdG與OGG1相關(guān)關(guān)系散點圖

2.2 習(xí)練太極拳對老年人氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

久坐老年人在接受太極拳運動干預(yù)后，血漿SOD活性持續(xù)增加，且干預(yù)后(8W/12W/16W)活性均明顯高于干預(yù)前(P<0.05)。相反，血漿MDA的濃度逐次下降，且較干預(yù)前差異顯著(P<0.05)(見表3)。與干預(yù)前相比，血漿GPX活性在第8和第12周明顯下降(P<0.05)，第16周時出現(xiàn)反彈且略高于干預(yù)前，但未見統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。表2數(shù)據(jù)還顯示，太極拳練習(xí)后羥自由基抑制能力(OH·-IC)自第8周起便持續(xù)升高(P<0.05)；血漿GSH濃度在第8周和第12周明顯提高(P<0.05)，但干預(yù)結(jié)束時差異不顯著(P>0.05)。

表3 不同時間點血漿氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)變化表

3 分析討論

運動將給人體健康帶來益處的觀點已被廣為接受。由于運動會增加活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)，因此運動也通常被認(rèn)為將會引起機(jī)體的氧化應(yīng)激。人體呼吸過程中約有2 %～5 %的氧氣將會轉(zhuǎn)變成ROS[14]，因此，運動時因氧耗增加而引起機(jī)體氧化應(yīng)激的現(xiàn)象是不可避免的。然而，運動所引起的ROS的增加或氧化應(yīng)激并非總是有害的,它們對機(jī)體可能造成的氧化損傷更多地取決于諸如運動類型、運動方式、持續(xù)時間、以及運動強度等因素。[15]一般而言，進(jìn)行一次急性運動將導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激和DNA損傷，而進(jìn)行中強度運動則可降低氧化應(yīng)激和DNA損傷，進(jìn)行適宜漸進(jìn)的運動有助于人體產(chǎn)生相對的抗氧化作用。[16-17]

GPX主要負(fù)責(zé)過氧化氫(H2O2)和其他過氧化物的清除，它需要GSH作為底物才能發(fā)揮其生理作用[20]。本研究實驗中，老年人血漿GPX活性變化分別為157.25 U/ml(0W)、117.28 U/ml(8W)、143.02 U/ml(12W)和177.33 U/ml(16W)，在干預(yù)前和干預(yù)結(jié)束時相比無顯著差異(P>0.05)，而第8周和第12周則明顯更低(P<0.05)。其中，血漿GPX在干預(yù)前后變化不明顯的結(jié)果與前人對女大學(xué)生[13]、中年女性[11]及絕經(jīng)前后女性[21]的太極拳研究結(jié)果相一致。提示：太極拳對習(xí)練者血漿GPX的活性改變沒有影響。Jenkins等研究指出：高濃度的H2O2對GPX具有更直接刺激和誘導(dǎo)作用，而低濃度的H2O2則更利于過氧化氫酶(CAT)的動員。[20]因此，本研究實驗期間第8周和第12周血漿GPX活性的下降及其底物GSH的升高，可能與太極拳運動強度較低以及太極拳運動時機(jī)體內(nèi)較低H2O2濃度有關(guān)。在H2O2低濃度狀態(tài)下，機(jī)體主要通過CAT抵抗H2O2的毒性，但遺憾的是本研究未能對CAT進(jìn)行檢測。

DNA氧化損傷廣泛存在，它是產(chǎn)生對人體健康傷害最大的氧化損傷和衰老現(xiàn)象的主要原因，與人的預(yù)期壽命呈顯著負(fù)相關(guān)。[1,22]ROS極易攻擊DNA堿基，人體每天每個正常細(xì)胞約有10，000個堿基被氧化修飾[23]，而8-OHdG是最普遍和常見的DNA堿基氧化損傷產(chǎn)物[24]。有報道指出，含有8-OHdG受損的DNA在其隨后的復(fù)制中可能出現(xiàn)點突變的現(xiàn)象[25]。多項研究表明，運動將引起血漿8-OHdG水平的改變。Goto等研究發(fā)現(xiàn)，年輕男性進(jìn)行12周高強度運動后血漿8-OHdG水平升高，而如果進(jìn)行中強度運動則趨向下降。[7]一項針對老年人的研究表明，血漿8-OHdG水平在進(jìn)行10個月有氧運動后，較干預(yù)前有顯著提高。[26]而動物實驗表明，中強度耐力組的大鼠骨骼肌8-OHdG水平明顯低于安靜對照組。[4]此外，我們先前的研究則發(fā)現(xiàn)，12周太極拳運動有助于大學(xué)女生血漿8-OHdG的小幅度升高。[13]造成過往研究結(jié)果不甚一致的原因可能與對象的年齡、運動方式和模式以及運動干預(yù)周期的長短有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，老年人血漿8-OHdG在第8周和第12周有顯著提高(P<0.05)，而實驗結(jié)束時則與干預(yù)前相差無幾(P>0.05)。由于8-OHdG與OGG1關(guān)系極為密切，隨后將結(jié)合OGG1討論其變化的內(nèi)在機(jī)制。

正常情況下，機(jī)體DNA修復(fù)的能力和效率將隨人體衰老而下降。[27]如果DNA損傷未能得到及時修復(fù)而日漸積累，可能導(dǎo)致誘變、細(xì)胞毒性和細(xì)胞死亡，進(jìn)而加速致病進(jìn)程(尤其是癌癥)。[28]因此，DNA的氧化修復(fù)能力對維持人體基因穩(wěn)定和健康具有重要意義。堿基切除修復(fù)是專門用于受損堿基修復(fù)的一種重要的DNA修復(fù)機(jī)制。修復(fù)時，糖基化酶將通過三個主要步驟進(jìn)行堿基的切除：首先，水解由堿基與糖磷酸骨架形成的N-糖苷鍵以生成一個無堿基位點(AP位點)；其次，AP核酸內(nèi)切酶將含有AP位點的核苷酸DNA片段切除；最后，DNA聚合酶-β和DNA連接酶最終將缺口填補。[29]OGG1是哺乳動物三種主要的糖基化酶之一，對8-OHdG的識別和切除具有特異性。[30]有急性運動試驗表明，一次有氧運動(馬拉松跑)后，人體骨骼肌的OGG1活性顯著提高。[8]另外，一項長達(dá)2個月的動物干預(yù)研究表明，與對照組相比，有規(guī)律的跑臺運動有助于老齡大鼠肝臟細(xì)胞核OGG1活性的提高。[31]本研究實驗結(jié)果顯示，老年人在太極拳練習(xí)第8周后，其血漿OGG1活性便明顯地提高。這與先前一項關(guān)于年輕女性太極拳鍛煉的研究結(jié)果相一致。[13]為此，我們推測，太極拳鍛煉后血漿OGG1活性的提高，很可能是機(jī)體對高ROS引起氧化損傷的一種有益的適應(yīng)性反應(yīng)。

迄今為止，研究8-OHdG和OGG1相關(guān)性的報道并不多見。Kondo等發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌病人的8-OHdG水平與OGG1的表達(dá)呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，相關(guān)系數(shù)為0.702。[32]通過文獻(xiàn)綜述發(fā)現(xiàn)，目前尚未見有關(guān)老年人安靜時及運動干預(yù)過程中8-OHdG與OGG1相關(guān)性的研究。本實驗結(jié)果表明，老年人血漿8-OHdG與OGG1在干預(yù)前及干預(yù)的第8周和第12周均存在顯著的正相關(guān)(P<0.05)，而干預(yù)結(jié)束時卻未發(fā)現(xiàn)這種相關(guān)關(guān)系(P>0.05)。根據(jù)實驗各時間點測得的8-OHdG與OGG1數(shù)據(jù)可發(fā)現(xiàn)干預(yù)前兩者高度相關(guān)(R=0.975)，這表明對于正常老年人而言，8-OHdG的切除近乎完全取決于機(jī)體OGG1的活性，由于8-OHdG產(chǎn)生和OGG1活性都將隨年齡的增長呈負(fù)性變化，老年人體內(nèi)堿基損傷積累的可能性非常大。因此，如何延緩、甚至提高老年人OGG1的活性顯得尤為重要。此外，太極拳干預(yù)后兩者關(guān)系從第8周的高度相關(guān)(R=0.851)逐漸過渡到了中度相關(guān)(R=0.685)。其中，8-OHdG在第8周達(dá)到峰值(13.86 ng/ml)，至第12周時有所下降(11.25 ng/ml)；而OGG1在第8周和第12周均處較高水平(9.49 ng/ml，9.75 ng/ml)，這些數(shù)據(jù)表明運動時攝氧量增加將致使ROS也增加，進(jìn)而增加堿基的損傷；太極拳運動有助于老年人OGG1活性的提高，進(jìn)而利于機(jī)體受損堿基的切除；太極拳鍛煉提高OGG1活性的效能，除了表現(xiàn)在及時切除運動本身引起的堿基損傷外，還對減少久坐老人可能存在的堿基損傷十分有效。最后，實驗結(jié)束時(第16周)兩者相關(guān)性完全消失，8-OHdG與干預(yù)前相仿(8.12 ng/ml)，而OGG1則仍然保持了較高水平(7.35 ng/ml)。提示：16周太極拳干預(yù)后，高活性的OGG1足以將老年人體內(nèi)含8-OHdG損傷的DNA堿基及時并完全切除，或者說運動所提高的OGG1活性可以滿足甚至超過老年人機(jī)體受損堿基切除的需求。根據(jù)已有研究和理論[33]，太極拳鍛煉時OGG1活性的增強可提高其堿基切除的速率。

太極拳鍛煉提高機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)和減輕氧化損傷的可能機(jī)制主要表現(xiàn)為三方面。第一，根據(jù)毒物興奮效應(yīng)(Hormesis)理論，低劑量的氧化劑有助于抗氧化酶活性的上調(diào)。[34-36]太極拳習(xí)練中產(chǎn)生的ROS雖然有毒，但它同時對細(xì)胞信號傳導(dǎo)和基因表達(dá)調(diào)控有重要作用。[17,36]因此，太極拳運動本身就是一種抗氧化劑。第二，由反復(fù)的運動刺激和運動引起的中低濃度ROS暴露而產(chǎn)生的累積效應(yīng)則是其另一機(jī)制的表現(xiàn)[17,37]，太極拳運動有利提高機(jī)體抵抗氧化應(yīng)激的能力。第三，太極拳改善習(xí)練者心理狀態(tài)是機(jī)體氧化損傷減輕的可能機(jī)理之一。急性和慢性心理應(yīng)激都會導(dǎo)致ROS增加[38]，并引起DNA損傷[39]。而太極拳是一項廣受認(rèn)同的健身和健心運動。本研究發(fā)現(xiàn)，練習(xí)者的抑郁和焦慮水平至16周時均出現(xiàn)了下降的趨勢，這可能是老年人氧化損傷得到改善的原因之一。

本研究存在樣本量略小和缺乏對照組兩方面的局限。另外，研究對象的飲食習(xí)慣問題僅是通過干預(yù)練習(xí)時的反復(fù)告知予以控制，如能結(jié)合血液采集前一周的飲食記錄必然更為嚴(yán)謹(jǐn)。盡管如此，本研究對太極拳干預(yù)老年人氧化應(yīng)激和DNA堿基損傷的影響作出了初步的有益探討。后續(xù)可通過設(shè)計嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾S機(jī)對照試驗，并對DNA鏈損傷等重要指標(biāo)進(jìn)行更進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

持續(xù)16周(5次/周、70分鐘/次)的太極拳練習(xí)可有效改善久坐健康老年人DNA堿基損傷及其修復(fù)能力，且從第8周便可獲得這種效應(yīng)。