魯俊鋒,祖紅梅,王莉林,劉 丹,馬麗娜,鄭素軍,陳新月,胡中杰
母嬰傳播是我國HBV感染的主要傳播途徑,約占全部HBV感染的40%[1]。根據(jù)國內(nèi)外最新的慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)防治指南,對免疫耐受期、高病毒載量的HBV感染孕婦在妊娠晚期均推薦抗病毒干預(yù),但這些患者分娩后肝功能并非依然呈“耐受狀態(tài)”[2-4]。既往有研究發(fā)現(xiàn),部分CHB孕婦分娩后可出現(xiàn)氨基轉(zhuǎn)移酶升高或伴有自發(fā)的HBeAg清除/轉(zhuǎn)換[5-7]。然而,HBV感染免疫耐受期孕婦分娩后臨床指標的變化仍缺少相關(guān)的研究,具體免疫學機制仍不清楚。為此,本研究對HBV感染免疫耐受期孕婦分娩前后的生化、病毒學、血清學等臨床指標以及細胞因子的變化進行分析,探討潛在的免疫學影響因素,為產(chǎn)后抗病毒治療提供理論基礎(chǔ)。
1.1 對象 選擇2015年1月—2017年12月就診于首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院的52例HBV感染免疫耐受期孕婦作為研究對象。納入標準:①既往未接受過抗病毒治療;②妊娠前、妊娠期間至少2次血清ALT和AST在正常范圍;③HBeAg≥500 COI,HBV DNA ≥ 6 lg IU/ml。排除標準:①合并HAV、HCV、HEV等病毒感染者;②合并自身免疫性肝病者;③代償或失代償期肝硬化患者;④妊娠期合并產(chǎn)科并發(fā)癥如先兆子癇、肝內(nèi)膽汁淤積等;⑤妊娠期并發(fā)其他疾病,需服用藥物者。所有患者于妊娠28周給予替比夫定(telbivudine, LdT)抗病毒干預(yù),分別于干預(yù)前(基線)、分娩前2周、分娩后6周進行生化、血清學及病毒學檢測,同步留取相應(yīng)節(jié)點外周靜脈血標本,-80℃保存?zhèn)溆?。本研究?jīng)首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院倫理委員會批準,患者均簽署知情同意書。
1.2 檢測方法 HBV血清學檢測采用羅氏Elecsys HBsAgⅡ試劑盒進行檢測,HBsAg定量檢測下限為0.05 IU/ml,HBeAg>1.0 COI為陽性。HBV DNA檢測采用實時熒光定量PCR系統(tǒng)檢測,檢測下限為20 IU/ml(COBAS Taqman,羅氏診斷公司)。肝功能檢測采用OLYMPUSAU5400生化檢測儀進行檢測,ALT正常值上限(upper limit of normal, ULN)為 40 U/L。細胞因子采用多細胞因子檢測試劑盒(Bio-Plex Pro Assays),包括 IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ和 TNF-α。
1.3 統(tǒng)計學處理 用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。呈正態(tài)分布的計量資料以±s表示,非正態(tài)分布的計量資料以M(P25,P75)表示。不同時間點的ALT、HBV DNA、HBeAg、HBsAg比較采用重復(fù)測量方差分析,組間比較采用 LSD-t檢驗。不同組間細胞因子比較采用獨立樣本t檢驗或2樣本比較秩和檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 基本情況 52例患者均為HBeAg陽性CHB,平均年齡為(29.3±4.3)歲,ALT基線平均水平為(18.4±7.6)U/L,HBsAg基線中位水平為4.6 lg IU/ml,HBeAg基線平均水平為(3.3±0.1)lg COI,HBV DNA 基線中位水平為8.2 lg IU/ml。16例患者的HBV為基因B型,36例患者的HBV為基因C型。
2.2 分娩前后生化、病毒學及血清學指標的變化 52例患者LdT干預(yù)前、分娩前ALT水平均在正常值范圍,分娩后ALT≥2倍ULN者占28.8%(15/52),ULN< ALT< 2倍 ULN者占26.9%(14/52),ALT水平正常者占44.2%(23/52)。由于妊娠晚期LdT抗病毒治療,分娩前HBV DNA水平較LdT干預(yù)前顯著降低,平均降幅達(3.68±0.79) Ig IU/ml,但分娩后6周HBV DNA水平明顯高于分娩前(P均<0.05);LdT干預(yù)前、分娩前、分娩后HBeAg和HBsAg水平均無明顯變化。52例患者中,35例分娩后即刻停用LdT,17例分娩后6周停用LdT,中位ALT水平分別為32.8(21.45,70.25)U/L 和37.2(26.5,86.4)U/L,在分娩后無明顯差異(Z=0.664,P=0.507);分娩后即刻停藥的患者,71.4%(25/35)HBV DNA水平在分娩后6周完全恢復(fù)至LdT干預(yù)前水平。見表1。
表1 52例患者LdT干預(yù)前、分娩前、分娩后生化、血清學、病毒學指標變化(±s)Table 1 Changes of biochemical, serological and virological markers levles in 52 patients before LdT intervention, ante partum and post partum (±s)
表1 52例患者LdT干預(yù)前、分娩前、分娩后生化、血清學、病毒學指標變化(±s)Table 1 Changes of biochemical, serological and virological markers levles in 52 patients before LdT intervention, ante partum and post partum (±s)
注:*. M(P25,P75)
指標 LdT干預(yù)前 分娩前 分娩后 F時間 P值A(chǔ)LT (U/L) 18.44±7.59 17.95±8.20 33.2 (22.85, 75.80)* 44.470 0.000 HBV DNA (Ig IU/ml) 8.08±0.39 4.40±0.98 6.77±1.73 108.410 0.000 HBeAg (Ig COI) 3.30±0.05 3.28±0.18 3.26±0.21 0.560 0.509 HBsAg (Ig IU/ml) 4.50±0.26 4.47±0.28 4.48+0.28 0.840 0.373
2.3 分娩前后細胞因子水平的變化 對52例患者在LdT干預(yù)前、分娩前、分娩后細胞因子水平進行檢測,結(jié)果顯示,IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α在分娩前后均呈動態(tài)變化,其中,IL-2中位水平在分娩前與LdT干預(yù)前無明顯變化,分娩后明顯低于分娩前(P<0.05);TNF-α中位水平在分娩前明顯低于LdT干預(yù)前(P<0.05),分娩后較分娩前無明顯變化;余細胞因子水平在分娩前后的變化差異均無統(tǒng)計學意義。見圖1。
圖1 52例患者LdT干預(yù)前、分娩前、分娩后細胞因子水平的變化Figure 1 Changes of cytokine levels in 52 patients before LdT intervention, ante partum and post partum
2.4 分娩后ALT≥2倍ULN組和ALT<2倍ULN組間細胞因子水平比較 根據(jù)分娩后ALT水平的不同,分為ALT≥2倍ULN組和ALT<2倍ULN組,對2組之間細胞因子水平進行比較,結(jié)果顯示,在LdT干預(yù)前,ALT≥2倍ULN組IFN-γ中位水平明顯低于ALT<2倍ULN組,(Z=2.284,P=0.022),而IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α在2組之間差異均無統(tǒng)計學意義(表2);分娩后,ALT≥2倍ULN組患者中位IFN-γ水平明顯高于ALT<2倍ULN組,差異有統(tǒng)計學意義(Z=2.223,P=0.026),余細胞因子水平在2組間差異無統(tǒng)計學意義(表3)。
表2 LdT干預(yù)前ALT≥ 2倍ULN組與ALT<2倍ULN組細胞因子水平比較(pg/ml)Table 2 Cytokine levels between ALT ≥ 2 times ULN group and ALT < 2 times ULN group before LdT intervention (pg/ml)
所謂免疫耐受期是指HBsAg、HBeAg陽性,HBV DNA高載量,血清ALT和AST在正常值范圍,肝組織學檢查炎癥不明顯[2]。免疫耐受期患者不是抗病毒治療的適宜人群[2]。妊娠晚期抗病毒治療的目的是降低HBV母嬰傳播風險,并非針對HBV感染的孕婦本人進行治療。然而,這些孕婦產(chǎn)后并非依然處于“免疫耐受”狀態(tài)。從既往文獻報道看,HBV感染孕婦產(chǎn)后可出現(xiàn)2種情況,一是產(chǎn)后較高比例的患者出現(xiàn)不同程度的氨基轉(zhuǎn)移酶升高或伴有自發(fā)的HBeAg清除/轉(zhuǎn)換[5-9];二是產(chǎn)后出現(xiàn)肝炎發(fā)作的患者,采用以IFN為基礎(chǔ)方案抗病毒治療療效顯著好于一般CHB人群[10]。本研究中入組患者HBeAg≥500 COI且HBV DNA≥6 lgIU/ml,明顯為機體免疫耐受狀態(tài),產(chǎn)后6周觀察到ALT≥2倍ULN者占28.8%,產(chǎn)后即刻停藥組與產(chǎn)后6周停藥組分娩后ALT水平無明顯差異。這些臨床現(xiàn)象間接提示產(chǎn)后ALT水平的升高可能與機體免疫功能的變化相關(guān)。
妊娠期是一個具有獨特且復(fù)雜免疫狀態(tài)的階段,在整個胎兒的生長發(fā)育期間,為避免對胎兒的排異反應(yīng),機體免疫功能趨于抗炎內(nèi)環(huán)境,而一旦胎兒發(fā)育完成,機體由抗炎內(nèi)環(huán)境向促炎內(nèi)環(huán)境的轉(zhuǎn)變對促進分娩是必不可少的[11]。在非HBV感染人群中,文獻報道,妊娠期間細胞因子趨于以Th2型為主,而分娩后轉(zhuǎn)換為以Th1類細胞因子為主[12]。本研究中,雖2類細胞因子在分娩前后呈動態(tài)變化趨勢,但總體未顯示出一致變化的規(guī)律性,可能與HBV感染、機體的免疫應(yīng)答均有一定的關(guān)系。既往文獻報道,在HBV感染控制過程中,IFN-γ起到非常重要的作用。首先,IFN-γ可通過多種途徑發(fā)揮重要的作用:①募集和活化T細胞、NK細胞及巨噬細胞來發(fā)揮它們的功能;②誘導(dǎo)T細胞形成抗HBV效應(yīng)細胞;③上調(diào)感染HBV的肝細胞上的主要組織相容性復(fù)合體的表達,促進抗原加工和呈遞;④直接抗病毒的作用[13]。其次,在模擬急性HBV感染的小鼠模型中,NK細胞通過分泌IFN-γ促進CD8+T細胞的抗病毒活性[14];在免疫激活的CHB患者中,NK細胞和CD8+T細胞均可分泌IFN-γ,且與ALT水平的升高呈正相關(guān)[13-16]。HBV特異性CD8+T細胞可通分泌IFN-γ,抑制HBV的復(fù)制,降低肝細胞內(nèi)的cccDNA,使部分患者實現(xiàn)HBV的臨床治愈[15]。因此,IFN-γ在HBV感染過程中免疫激活、抗病毒療效及臨床治愈等多個方面均起到重要的作用。本研究中,根據(jù)分娩后ALT水平的不同對細胞因子進行分析,結(jié)果顯示分娩后ALT≥2倍ULN組患者,在妊娠期間中位IFN-γ水平呈低水平表達,而分娩后呈高水平表達,這些結(jié)果提示分娩前后IFN-γ水平的變化可能與產(chǎn)后ALT水平的升高有關(guān)。然而,本研究不足之處在于,妊娠期間體內(nèi)多種免疫細胞、細胞因子形成復(fù)雜的免疫網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)系統(tǒng),在不同的妊娠階段,呈現(xiàn)不同的免疫狀態(tài),以維持正常妊娠[11-12,17-19]。單個細胞因子變化尚不足以真實、完整地反映機體的免疫功能變化。
結(jié)合本研究團隊前期研究,產(chǎn)后出現(xiàn)ALT升高的患者繼續(xù)采用聚乙二醇IFN為基礎(chǔ)方案抗病毒治療,可獲得較高的HBsAg/HBeAg血清學清除/轉(zhuǎn)換率[10],提示HBV感染免疫耐受期孕婦分娩后若出現(xiàn)ALT水平的升高,可能與機體免疫功能的變化相關(guān),或為產(chǎn)后的進一步抗病毒治療創(chuàng)造合適的時機,須要更進一步的深入研究。