李 莉， 江皓男， 古扎努爾·阿吾提， 王家坡， 陸 蕓， 劉 娜， 郭曉青

(同濟大學附屬第一婦嬰保健院婦科,上海 201204)

膠質瘤相關癌基因同源物(glioma-associated oncogene homolog 1, GLI1)GLI1最初被鑒定為惡性神經膠質瘤中的擴增基因，是Hedgehog(Hh)信號通路轉導的轉錄靶標[6-7]。研究表明，GLI1在共濟失調毛細血管擴張突變基因ATM(ataxia-tela-ngiectasia mutated, ATM)介導的DNA損傷反應(DNA damage response, DDR)信號、細胞凋亡、腫瘤耐藥中起著至關重要的作用，從而導致癌細胞存活和進展[8]。本研究前期通過String數據庫驗證GLI1與DNA損傷修復途徑相關蛋白(BRCA1、BRCA2等)具有相互作用，并且進一步通過GEPIA數據庫驗證GLI1與BRCA1、BRCA2、ATM、H2AFX、DDB1、E2F1、CHEK1、XRCC5等DNA損傷修復途徑相關蛋白具有密切相關性。GANT61是GLI1的靶向抑制劑，能阻斷GLI1與DNA的序列結合[9-10]。對GLI1及其靶向抑制劑GANT61在卵巢癌細胞PARP抑制劑敏感性中的作用卻鮮有報道。本研究旨在探討GLI1及其靶向抑制劑GANT61對卵巢癌細胞PARP抑制劑敏感性的影響，并分析其作用機制。

1 材料與方法

1.1 標本收集及細胞系

1.2 細胞、試劑及儀器

正常卵巢細胞株IOSE80和卵巢癌細胞株HEY、A2780、SK-OV-3、ES-2購自中科院上海生命科學研究院細胞庫。DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、PBS購自以色列BI公司；胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司；RIPA全蛋白裂解液購自上海威奧生物科技有限公司；CCK8試劑購自蘇州新賽美生物科技有限公司；AnnexinⅤ-PE/7AAD凋亡試劑購自美國BD公司；結晶紫購自上海碧云天生物技術有限公司；Edu-555細胞增殖檢測試劑盒購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司；GANT61抑制劑和olaparib購自美國MCE公司；抗體GLI1、β-actin購自中國Proteintech公司；抗體γ-H2AX購自武漢賽維爾生物科技有限公司；熒光倒置顯微鏡購自日本Olympus公司；流式細胞儀購自美國BD公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 Western印跡法 收集組織或細胞系以及處理的細胞后，使用包含蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑和PMSF的RIPA全蛋白裂解液冰上(4 ℃)裂解組織和細胞30 min,隨后4 ℃離心(離心半徑13.5 cm，12 000 r/min，30 min)，提取上清液后使用BCA蛋白質測定法測定蛋白質濃度。然后將樣品在10%、12.5%的SDS-PAGE中分離并轉移至PVDF膜。隨后洗膜(TBST洗膜3次，每次10 min)。室溫下在3%BSA封閉液中封閉1 h，洗膜。然后根據marker剪下目的蛋白所在的蛋白位置。然后與β-actin、GLI1、γ-H2AX的一抗一起4 ℃孵育過夜。孵育過夜回收一抗，洗膜，然后與兔或小鼠二抗在室溫下孵育1 h，洗膜，最后利用顯影儀進行ECL顯色，并利用Image J系統(tǒng)對圖像進行處理與分析。

1.3.2 CCK8檢測細胞活力 取ES2對數生長期細胞制成單細胞懸液，100 μL的3 000個細胞每孔接種于96孔培養(yǎng)板中放置培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，將細胞分4組處理細胞(對照組、GANT61、olaparib、GANT61和olaparib聯合組)，分別加入GANT61、olaparib不同處理藥物濃度，置常規(guī)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，每孔加入CCK8試劑10 μL，37 ℃孵育2 h;酶標儀檢測波長450 nm處吸光度值(A450)，求其平均值，并計算細胞抑制率，抑制率(%)=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%，并繪制細胞生長抑制曲線。

1.3.3 平板克隆 將細胞以每孔3 000個細胞接種到12孔板中。第2天將細胞分4組，每組3個復孔。細胞在不同的處理組下(對照組、GANT61 16 μmol/L、olaparib 16 μmol/L、GANT61和olaparib聯合組)處理7 d后，棄掉原有培養(yǎng)基，用PBS洗滌，然后用4%的多聚甲醛固定15 min,固定后再同PBS洗滌3次，最后用結晶紫將菌落染色30 min。

1.3.4 EdU細胞增殖實驗 以每孔8×104細胞密度接種到24孔板中，細胞接種24 h后將不同處理的藥物處理細胞24 h,24 h處理后每孔加入10 μmol/L EdU在37 ℃下孵育2 h，然后在室溫下用4%多聚甲醛固定15 min。然后3%BSA洗滌細胞3次，每次3 min,接著用0.3% Triton X-100處理15 min和500 μL Apollo?混合物避光處理30 min，然后加入DAPI處理20 min以標記細胞核。EdU染色的細胞(帶有紅色熒光)與DAPI染色的細胞(帶有藍色熒光)的比率用于評估細胞增殖。使用熒光顯微鏡以200倍放大率隨機拍攝6個視野并用Image J軟件分析圖像。

1.3.5 流式細胞儀測凋亡 通過AnnexinⅤ-PE/7AAD雙染色法評估不同處理組處理72 h后凋亡的細胞。然后根據制造商的說明書用AnnexinⅤ-PE和7-AAD-FITC染色細胞15 min。使用流式細胞儀進行檢測，對細胞進行設門，AnnexinⅤ-PE和7AAD作為對照，AnnexinⅤ-PE+和7AAD-作為早期凋亡，AnnexinⅤ-PE+和7AAD+作為晚期凋亡。數據結果FlowJo V軟件分析。

1.3.6 免疫熒光 以每孔8×104細胞密度接種到24孔板中，細胞接種24 h后將不同處理的藥物處理細胞24 h，然后在室溫下用4%多聚甲醛固定20 min，用0.3% Triton X-100透化15 min，然后用免疫熒光封閉液封閉30 min。用PBS沖洗細胞并在4 ℃下在含有一抗兔單克隆抗體γ-H2AX的稀釋緩沖液中孵育過夜。用PBS洗滌細胞3次。然后，將細胞與山羊抗兔IgG的Alexa Fluor片段孵育1 h，并使用DAPI進行細胞核復染。最后，使用熒光顯微鏡以200倍放大率觀察細胞。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 GLI1在卵巢癌組織和卵巢癌細胞系中高表達

通過蛋白質印跡分析以確定GLI1在正常卵巢上皮和上皮性卵巢癌組織中的表達情況，收集8例因其他子宮良性疾病手術切除的正常卵巢上皮組織和27例上皮性卵巢癌組織，結果顯示，與正常卵巢上皮組織相比，GLI1在上皮性卵巢癌組織中的蛋白表達水平顯著上調(P<0.01)，見圖1A、B。此外，與正常卵巢上皮細胞IOSE80相比，GLI1在卵巢癌細胞系中的蛋白表達水平顯著升高(P<0.01)，見圖1C、D。其中，ES2細胞相較于其它卵巢癌細胞GLI1表達水平較高。因此，選用ES2細胞做進一步細胞生物學功能實驗研究。

圖1 GLI1在上皮性卵巢癌組織和細胞系的表達情況Fig.1 Expression of GLI1 in epithelial ovarian cancer tissues and cell linesA、B： Western印跡法檢測正常卵巢上皮和上皮性卵巢癌組織中GLI1的表達情況(部分典型病例)，其中N代表正常卵巢上皮組織，T代表癌組織；C、D： Western印跡法檢測正常卵巢細胞IOSE80和卵巢癌細胞株GLI1表達情況；與IOSE80細胞相比，*P<0.05

2.2 GANT61抑制卵巢癌細胞生長和促進細胞凋亡

為了評估GLI1抑制對卵巢癌細胞存活能力的影響，首先使用梯度濃度GANT61(GLI1抑制劑)處理ES2細胞72 h，通過CCK8檢測細胞活力。CCK8結果表明，隨著GANT61濃度的遞增，GANT61對ES2細胞的細胞生長抑制能力逐漸增加，表明GANT61以濃度依賴性方式抑制細胞活性，見圖2A。與CCK8實驗結果一致，平板克隆實驗結果顯示，隨著GANT61濃度梯度增加，ES2細胞克隆形成數量逐漸減少，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2B、C。增殖和凋亡是評估腫瘤細胞存活能力的兩大因素。因此，接下來評估GNAT61對卵巢癌細胞凋亡的影響。通過AnnexinⅤ/7AAD雙染實驗研究發(fā)現，在GANT61處理ES2細胞72 h后，細胞凋亡率隨著GANT61濃度的增加而逐漸增加(P<0.05)，見圖2D、E。以上結果表明GLI1抑制劑GANT61能抑制卵巢癌細胞生長和促進卵巢癌細胞凋亡。

圖2 GANT61對卵巢癌細胞增殖和凋亡情況Fig.2 The effect of GANT61 on the proliferation and apoptosis of ovarian cancer cellsA: CCK8法檢測GANT61單藥處理72 h后對卵巢癌細胞ES2增殖率的影響；B、C: 平板克隆實驗檢測不同濃度GANT61單藥處理7 d后對卵巢癌細胞ES2克隆形成的影響；D、E: 流式細胞術檢測不同濃度GANT61單藥處理72 h后對卵巢癌細胞ES2凋亡率影響；與未處理組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.3 GANT61聯合olaparib顯著抑制卵巢癌細胞的生長和誘導細胞凋亡

為了評估GANT61與olaparib聯合療法在卵巢癌中的抗腫瘤效應，GANT61(16 μmol/L)和olaparib(16 μmol/L)分別以及聯合作用于ES2細胞,通過平板克隆實驗以及EDU實驗檢測腫瘤細胞克隆形成能力和增殖能力。平板克隆實驗結果表明，與GANT61或olaparib單藥處理相比，GANT61與olaparib聯合組能顯著抑制腫瘤細胞克隆形成能力(P<0.001)，見圖3A、B。與上述平板克隆實驗結論一致的是，EdU實驗也表明GANT61聯合olaparib較GANT61和olaparib能顯著抑制腫瘤細胞增殖能力(P<0.001)，圖3C、D。同時，為了檢測GANT61聯合olaparib在卵巢癌細胞中的凋亡誘導能力，通過AnnexinⅤ-PE/7AAD雙染色法檢測凋亡細胞比例。結果顯示，GANT61聯合olaparib誘導的ES2細胞凋亡比例為25.87%±0.82%，分別顯著高于GANT61組(19.46%±0.18%)以及olaparib組(16.87%±0.58%，均P<0.001)，表明GANT61聯合olaparib能顯著誘導卵巢癌細胞凋亡，見圖3E、F。綜上表明，GANT61與olaparib聯合療法能顯著抑制卵巢癌細胞的生長并且誘導卵巢癌細胞凋亡。

圖3 各藥組對卵巢癌細胞增殖和凋亡情況Fig.3 Effects on the proliferation and apoptosis of ovarian cancer cells in the treatment groupsA、B: 平板克隆實驗檢測對照組、GANT61組、olaparib組和olaparib聯合GANT61組處理7 d后對卵巢癌細胞ES2克隆形成的影響；C、D: EdU實驗檢測對照組、GANT61組、olaparib組和olaparib聯合GANT61組處理72 h后對卵巢癌細胞ES2克隆形成的影響；E、F: 流式細胞術檢測對照組、GANT61組、olaparib組和olaparib聯合GANT61組處理72 h后對卵巢癌細胞ES2凋亡率影響；與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與olaparib聯合GANT61組相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001

2.4 GANT61增強olaparib誘導的卵巢癌細胞DNA損傷

目前，γ-H2AX的水平已經成為公認的DSB發(fā)生早期的標志[11-12]。隨后，為了探究GANT61聯合olaparib在卵巢癌細胞中誘導DNA損傷的效應。通過Westorn印跡法發(fā)現，相較于GANT61或olaparib，GANT61聯合olaparib顯著上調了ES2細胞中DNA損傷標志物γ-H2AX的表達。從圖4A中可以看出，用16 μmol/L GANT61單獨處理ES2細胞后，與對照組細胞相比可觀察到γ-H2AX蛋白水平增加。然而，GANT61和olaparib組合處理癌細胞，能觀察γ-H2AX蛋白的表達明顯增加。這說明GANT61可能誘導DNA損傷從而增強olaparib對癌細胞的DNA損傷功能。與上述結論一致的是，通過免疫熒光發(fā)現，GANT61聯合olaparib誘導的γ-H2AX灶點形成(14.50%±3.55%)顯著高于GANT61組(5.50%±1.80%)和olaparib組(4.33%±2.29%，均P<0.05)見圖4B、C。以上結果表明，GANT61能夠增強olaparib誘導的卵巢癌細胞DNA損傷。

圖4 各藥組誘導的卵巢癌細胞DNA損傷的情況Fig.4 The DNA damage induced by the treatment groups in ovarian cancer cellsA: Western印跡法檢測對照組、GANT61組、olaparib組和olaparib聯合GANT61組處理72 h后ES2細胞DNA雙鏈損傷標志物γ-H2AX的表達水平；BC: 免疫熒光檢測對照組、GANT61組、olaparib組和olaparib聯合GANT61組處理72 h后ES2細胞中γ-H2AX灶點形成情況；與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與olaparib聯合GANT61組相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001

3 討 論

卵巢癌是死亡率最高的婦科惡性腫瘤[1]。近年來，隨著PARP抑制劑陸續(xù)獲批進入臨床，靶向療法已成為臨床治療卵巢癌的新興療法。多項大型臨床試驗均表明PARP抑制劑的應用為卵巢癌患者帶來了巨大的臨床獲益[13-17]。但隨著PARP抑制劑的廣泛應用，卵巢癌患者對其耐受的風險亦隨之增加，因此開發(fā)一種新的以聯合療法為核心的治療策略以改善治療反應和克服藥物耐受勢在必行。目前一些臨床前證據表明，PARP抑制劑與靶向藥物聯合治療癌癥具有明顯的抗腫瘤效應，包括共濟失調毛細血管擴張突變基因Rad3相關激酶(ATM-and rad3-related, ATR)、ATM、組蛋白去乙?；?histone deacetylase, HDAC)、蛋白激酶WEE1(wee1 g2 checkpoint kinase)、細胞周期檢測點激酶1/2(checkpoint kinases 1 and 2, CHK1/2)抑制劑[18-21]。以上有效的PARP抑制劑聯合治療的基本原理是靶向藥物通過產生DNA損傷或調節(jié)DNA損傷修復途徑來增強PARP抑制劑的抗腫瘤作用。

PARP抑制劑的作用機制是抑制PARP酶介導的堿基切除修復(base-excision repair, BER)、上調非同源末端連接修復(non-homologous end joining repair, NHEJ)以及PARP酶捕獲[22]。PARP抑制劑抑制PARP酶參與的BER途徑，而基于BER途徑修復的DNA單鏈斷裂(single-strand breakage, SSB)進而被誘導成DNA雙鏈斷裂(double-strand breakage, DSB)。DNA損傷在每個細胞周期中頻繁發(fā)生，HR通路能進行精確修復DSB以保護細胞基因完整性、穩(wěn)定和利于細胞生存。BRCA1和BRCA2是HR修復通路的主要成分。然而，在HR缺陷的癌細胞中，由PARP抑制劑誘導的DSB通過容易出錯的NHEJ進行修復，導致染色體重排、基因組不穩(wěn)定和隨后的細胞死亡[23-24]。

前期生物信息學分析發(fā)現，GLI1與同源重組修復途徑相關蛋白的表達密切相關。Ming等[25]的研究發(fā)現GLI1過表達可上調ATM的磷酸化水平，增強DNA損傷修復能力，這提示GLI1表達或與卵巢癌的PARP抑制劑敏感性相關。本研究發(fā)現，與正常卵巢組織和正常卵巢上皮細胞相比，GLI1在上皮性卵巢癌組織以及卵巢癌細胞系中高表達，與既往研究報道一致[26]。據報道，GLI1異常激活與多種癌癥預后不良相關，例如口腔鱗狀細胞癌、乳腺癌、肺癌和急性髓性白血病等[27-30]。GLI1除了調控腫瘤生長，GLI1還在誘導癌細胞產生化學抗性方面發(fā)揮著突出作用。多項研究報道，GLI1通過誘導多藥耐藥基因MDR1(multidrug resistance 1)的表達促進卵巢癌細胞紫杉醇化療耐藥以及化療后膠質瘤患者的復發(fā)[31-32]。以上報道提示了GLI1在多種癌癥的發(fā)展和進展中具有重要作用，GLI1未來可能成為研究并治療癌癥的潛在的分子標志物。

為了深入探究GLI1在卵巢癌中的作用，通過使用GANT61(GLI1靶向抑制劑)發(fā)現，GANT61以劑量依賴性的方式抑制卵巢癌細胞的存活和增殖并誘導細胞凋亡。與對照組相比，GANT61(16 μmol/L)處理卵巢癌細胞株ES2 72 h后，DNA損傷標志物γ-H2AX 的表達水平上調以及γ-H2AX灶點數量增加。γ-H2AX作為DNA損傷標志物，在細胞出現DNA損傷時被檢測到[33-34]，而當DNA損傷持續(xù)存在時，細胞啟動凋亡程序發(fā)生凋亡[35-36]。在Mazumdar等[9]的研究中，GANT61處理結腸癌細胞48 h可抑制GLI1，誘導細胞DNA損傷和廣泛細胞死亡，并且上調ATM，H2AX和DNA損傷檢查點蛋白1(mediator of DNA damage checkpoint protein 1, MDC1)的磷酸化水平。Mazumdar等[9]的研究和本研究結果提示了可能GANT61抑制GLI1的表達，從而誘導DNA損傷進而促進細胞凋亡，抑制細胞增殖。此外，本研究還發(fā)現GANT61聯合olaparib能夠顯著抑制卵巢癌細胞增殖并誘導其凋亡，GANT61聯合olaparib能夠上調γ-H2AX表達并且誘導更多的γ-H2AX灶點形成，表明GANT61可能通過誘導DNA損傷從而使卵巢癌細胞對PARP抑制劑敏感。然而，GLI1抑制劑是否通過誘導DNA損傷從而導致卵巢癌的PARP抑制劑敏感性則需進一步的研究證實。

綜上，本研究結果表明，與單一療法相比，GLI1抑制劑和PARP抑制劑的聯合療法能有效抑制卵巢癌細胞的存活和增殖并且誘導凋亡。但GLI1抑制劑和PARP抑制劑的聯合治療卵巢癌確切作用機制仍需進一步研究。