蔣海艷 ，龐貴尹，郭曉強(qiáng)，陳聯(lián)梅，康泰然

(成都大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，成都 610106)

山桐子(IdesiapolycarpaMaxim.)，又名椅桐、水冬瓜、油葡萄等，含油率高，是一種被稱為“空中油庫(kù)”的可再生能源。我國(guó)已廣泛種植山桐子，其主要分布在陜西、甘肅、河南三省的南部和中南二省、華東六省、華南二省及西南三省等省區(qū)。在四川省主要分布在川北、川西、川南盆周山區(qū)，其次是川東地區(qū)。山桐子耐高溫、忌積水、喜光、產(chǎn)果量高，樹(shù)齡100年左右仍可產(chǎn)果[1]，生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，果實(shí)產(chǎn)出率高，富含不飽和脂肪酸，其中亞油酸含量較高，其次含有少量維生素E、甾醇、酚類等功能性成分[2]。

共軛亞油酸(conjugated linoleic acid, CLA)是亞油酸(linoleic acid, LA)的位置異構(gòu)體和幾何異構(gòu)體的共軛雙鍵混合物，其中兩種異構(gòu)體(9c, 11t-和10t, 12c-)具有生物活性[3]。共軛亞油酸具有預(yù)防和治療許多疾病的功能，對(duì)肥胖、癌癥、動(dòng)脈粥樣硬化、炎癥等方面的疾病具有一定的積極作用[4-7]。天然共軛亞油酸主要來(lái)自反芻動(dòng)物，如肉類、牛奶和乳制品，雖然分布廣泛，但是含量極少，不足以達(dá)到40～42 mg/kg(體重)的推薦攝入量[8]。共軛亞油酸作為“21世紀(jì)新型營(yíng)養(yǎng)素”，廣泛應(yīng)用于保健食品、新型食品防腐劑、食品添加劑等方面[9]?，F(xiàn)有研究如共軛亞油酸減肥制劑或軟膠囊可抑制脂肪細(xì)胞熱量、調(diào)整新陳代謝等，共軛亞油酸乳制品可用于提高乳制品的功能性，共軛亞油酸作為家禽、牲畜飼料的添加劑可用于生產(chǎn)出共軛亞油酸含量高的功能性產(chǎn)品，展示出了共軛亞油酸的重要應(yīng)用價(jià)值[10-12]。因此，開(kāi)展以山桐子油為原料制備共軛亞油酸新工藝的研究在食品及食品添加劑和食品保健品等領(lǐng)域均具有重要的意義。

目前主要以紅花籽油、大豆油等草本植物油為原料制備共軛亞油酸[13]。我國(guó)已出臺(tái)支持木本油料發(fā)展的相關(guān)政策[14]，山桐子油作為木本植物油市場(chǎng)潛力巨大。然而，關(guān)于山桐子油的基礎(chǔ)研究較少。我們以山桐子油為原料，探索制備共軛亞油酸的新工藝。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上結(jié)合響應(yīng)面分析技術(shù)對(duì)制備共軛亞油酸工藝進(jìn)行優(yōu)化，應(yīng)用微波輔助加熱，以NaOH為堿，丙二醇為溶劑，使山桐子油中的亞油酸異構(gòu)化為共軛亞油酸。采用紅外分光光度法和紫外分光光度法對(duì)制備的共軛亞油酸進(jìn)行定性及定量分析，確定最佳工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山桐子油：購(gòu)于漢中市勉縣；共軛亞油酸(純度≥99%)：美國(guó)NU-CHEK公司；溴化鉀：光譜純；1,2-丙二醇、氫氧化鈉、正己烷、鹽酸、石油醚、乙醇：均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

VGT-2227QTD型超聲清洗儀 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；DHJF-8002低溫恒溫?cái)嚢璺磻?yīng)浴 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；MCR-3常壓微波化學(xué)反應(yīng)器 上海貝倫儀器設(shè)備有限公司；UV-5200紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；UV-2300紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；C92930紅外光譜儀 美國(guó)Perkin-Elmer公司；SYP-24B型壓片機(jī) 新諾儀器設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 超聲輔助山桐子油皂化并制備混合脂肪酸

按料液比1∶6 (g/mL)取山桐子油和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的氫氧化鈉乙醇溶液于燒瓶中，充氬氣保護(hù)，在60 ℃、功率500 W的超聲條件下反應(yīng)25 min后得皂化液，冷卻后真空旋干乙醇，加適量水溶解，用1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至2～3。加石油醚萃取，水洗有機(jī)層至中性，提取濾液，加無(wú)水Na2SO4吸水干燥并過(guò)濾，旋干溶劑，得富含亞油酸的混合脂肪酸。

1.3.2 尿素包合法純化亞油酸工藝

將體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇與尿素按照體積質(zhì)量比11∶1(mL/g)加入燒瓶中，用磁力攪拌器緩慢攪拌升溫至65 ℃，待尿素全部溶解后，按尿素和混合脂肪酸的質(zhì)量比2∶1(g/g)加入混合脂肪酸，水浴回流40 min，冷卻至室溫后轉(zhuǎn)入-5 ℃下包合10 h，取出反應(yīng)物，并迅速減壓抽濾，分離出濾液和尿素結(jié)晶物，將濾液旋干除去乙醇，加入適量水溶解，并用1 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH約為2～3，加入石油醚萃取，水洗至中性，用Na2SO4脫水后旋干溶劑，得到分離后的亞油酸。

1.3.3 微波輔助堿異構(gòu)化法制備共軛亞油酸

參考文獻(xiàn)[15-16]中的方法，略作修改。將NaOH與丙二醇按一定質(zhì)量比加入圓底燒瓶中，于60 ℃下完全溶解，再加入一定質(zhì)量的亞油酸混勻后，放置于特定溫度的微波反應(yīng)器中異構(gòu)化反應(yīng)一定時(shí)間，冷卻至室溫，加入溫水放置于60 ℃溫度下使其完全溶解后，用1 mol/L鹽酸調(diào)pH值為2。用正己烷萃取3次，并水洗有機(jī)相至中性，加Na2SO4干燥，旋干溶劑，稱其質(zhì)量，得共軛亞油酸產(chǎn)物。

式中：m1為L(zhǎng)A的質(zhì)量，mg；m2為共軛亞油酸產(chǎn)物的質(zhì)量，mg；c1為亞油酸的純度；c2為共軛亞油酸的純度。

1.3.3.1 單因素試驗(yàn)

在丙二醇和LA的質(zhì)量比4∶1、LA和NaOH的質(zhì)量比2∶1、反應(yīng)溫度160 ℃、反應(yīng)時(shí)間2 min的基礎(chǔ)上，分別考察丙二醇和LA的質(zhì)量比、LA和NaOH的質(zhì)量比、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間4個(gè)因素對(duì)共軛亞油酸的產(chǎn)率和純度的影響[17-19]。

1.3.3.2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)[20-21]

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取對(duì)響應(yīng)值有顯著影響的因素即丙二醇和LA的質(zhì)量比、LA和NaOH的質(zhì)量比、反應(yīng)溫度為考察因素，以共軛亞油酸純度為響應(yīng)值，結(jié)合Design Expert 11中的Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，見(jiàn)表1。

1.3.4 共軛亞油酸純度的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[22]中的方法，略作修改。

1.3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

稱取共軛亞油酸標(biāo)準(zhǔn)品用氬氣吹掃至恒重26.8 mg，用正己烷定容至50 mL容量瓶中，配成536 μg/mL的儲(chǔ)備液。稀釋成12.864，10.72，8.576，7.504，6.432，5.36，4.288，2.144 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在234 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光值，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程式。

1.3.4.2 紫外特征吸收峰的確定

將共軛亞油酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液通過(guò)紫外分光光度儀在200～300 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，從而確定共軛亞油酸的特征吸收峰所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)。

1.3.4.3 樣品的測(cè)定

稱取10～30 mg樣品于50 mL容量瓶中，用正己烷定容至刻度線，并稀釋一定倍數(shù)至吸光值在0.2～0.8范圍內(nèi)。按照1.3.4.1的方法測(cè)得樣品溶液中共軛亞油酸的吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算共軛亞油酸的質(zhì)量濃度，從而計(jì)算出樣品溶液中共軛亞油酸的純度。

1.3.5 紅外光譜監(jiān)測(cè)共軛異構(gòu)體

分別稱取150 mg溴化鉀在高溫?zé)粝卵心?，用紅外壓片機(jī)制備溴化鉀鹽窗，分別滴入1滴共軛亞油酸標(biāo)準(zhǔn)品、制備的亞油酸、制備的共軛亞油酸，再分別放于紅外光譜儀下進(jìn)行紅外監(jiān)測(cè)，得到相應(yīng)的紅外光譜圖，判斷亞油酸在1000～900 cm-1處的特征吸收帶是否發(fā)生了裂分，從而監(jiān)測(cè)共軛異構(gòu)體的存在[23-24]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)平行測(cè)定3次，計(jì)算平均值。將測(cè)得的數(shù)據(jù)采用Origin 2018軟件分析并作圖，運(yùn)用Design Expert 11.0進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 丙二醇和LA的質(zhì)量比對(duì)共軛亞油酸的產(chǎn)率和純度的影響

由圖1可知，隨著丙二醇質(zhì)量的增加，共軛亞油酸的純度和產(chǎn)率先升高后降低，在丙二醇和LA的質(zhì)量比為4∶1時(shí)達(dá)到最大值。這可能是由于丙二醇用量過(guò)少時(shí)，與反應(yīng)物接觸不充分，反應(yīng)不徹底，但當(dāng)丙二醇用量過(guò)度時(shí)，降低了反應(yīng)體系間的濃度，從而降低了分子間相互接觸。因此，選擇丙二醇和LA的質(zhì)量比4∶1較為合適。

圖1 丙二醇和LA的質(zhì)量比對(duì)共軛亞油酸的產(chǎn)率和純度的影響

2.1.2 LA和NaOH的質(zhì)量比對(duì)共軛亞油酸的產(chǎn)率和純度的影響

由圖2可知，隨著LA和NaOH的質(zhì)量比的增大，共軛亞油酸的純度和產(chǎn)率先升高后降低，在2∶1時(shí)達(dá)到最大值。這可能是由于NaOH用量少時(shí)，不能使反應(yīng)物充分皂化，反應(yīng)不徹底，而過(guò)度增加NaOH用量會(huì)造成反應(yīng)過(guò)程中起泡性高，色澤偏黃。因此，選擇 LA和NaOH的質(zhì)量比2∶1較為合適。

圖2 LA和NaOH的質(zhì)量比對(duì)共軛亞油酸的產(chǎn)率和純度的影響

2.1.3 反應(yīng)溫度對(duì)共軛亞油酸的產(chǎn)率和純度的影響

由圖3可知，共軛亞油酸的純度和產(chǎn)率隨著反應(yīng)溫度的升高而先升高后降低，在160 ℃時(shí)達(dá)到最大值。這可能是由于隨著反應(yīng)溫度的升高，亞油酸逐漸共軛化，在一定溫度下完全反應(yīng)，而過(guò)高溫度會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物的破壞甚至生成其他副產(chǎn)物。因此，選擇160 ℃作為后續(xù)反應(yīng)條件。

圖3 反應(yīng)溫度對(duì)共軛亞油酸的產(chǎn)率和純度的影響

2.1.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)共軛亞油酸的產(chǎn)率和純度的影響

由圖4可知，共軛亞油酸的純度和產(chǎn)率隨著反應(yīng)時(shí)間的增加而先升高，在2 min時(shí)達(dá)到最大值，而繼續(xù)增加反應(yīng)時(shí)間，亞油酸共軛化速率變慢甚至略有降低。這可能是由于適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)時(shí)間能增加分子間的相互接觸而使反應(yīng)徹底，但長(zhǎng)時(shí)間高溫反應(yīng)，易破壞產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。因此，選擇2 min較為合適。

圖4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)共軛亞油酸的產(chǎn)率和純度的影響

續(xù) 表

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)合單因素試驗(yàn)，綜合考慮，選取具有明顯響應(yīng)效果的丙二醇和LA的質(zhì)量比(A)、LA和NaOH的質(zhì)量比(B)和反應(yīng)溫度(C)3個(gè)因素進(jìn)行三因素三水平試驗(yàn)，進(jìn)行Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析，從而確定共軛亞油酸制備工藝的最佳條件。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.2.2 擬合模型的建立及方差分析

利用Design Expert 11.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析，建立二次響應(yīng)模型，根據(jù)表3的顯著性分析，得到以共軛亞油酸的純度為響應(yīng)值(Y)的二次多元回歸方程：Y=97.09+10.01A+9.32B+6.10C-25.23AB-9.8AC-6.75BC-20.32A2-20.23B2-11.61C2。該模型差異極顯著(P<0.0001)，失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05)，R2=0.9976。表明該模型擬合度良好，可利用該回歸方程分析各因素對(duì)共軛亞油酸純度的影響。同時(shí)結(jié)合F值，分析判斷各因素對(duì)共軛亞油酸純度的影響關(guān)系為A>B>C。而交互因素對(duì)共軛亞油酸純度的影響為AB>AC>BC。

表3 CLA純度的響應(yīng)面模型方差分析結(jié)果

2.2.3 響應(yīng)面分析

利用Design Expert 11.0軟件模擬得到相應(yīng)的三維響應(yīng)面圖和等高線圖，能夠直觀地評(píng)價(jià)各因素之間相互作用對(duì)共軛亞油酸純度的影響。各三維圖均呈現(xiàn)下凹的趨勢(shì)，共軛亞油酸的純度隨著丙二醇和LA的質(zhì)量比、LA和NaOH的質(zhì)量比、反應(yīng)溫度的增大而先升高后降低，說(shuō)明具有極大值,見(jiàn)圖5。根據(jù)三維響應(yīng)面原理，三維圖向下凹的趨勢(shì)越明顯，等高線呈橢圓形，交互作用越顯著，即丙二醇和LA的質(zhì)量比、LA和NaOH的質(zhì)量比對(duì)共軛亞油酸純度的影響極顯著，其次是反應(yīng)溫度。

圖5 各因素交互作用對(duì)CLA純度影響的響應(yīng)面圖和等高線圖

2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)Box-Behnken模型所預(yù)測(cè)的最佳異構(gòu)化工藝條件為丙二醇和LA的質(zhì)量比4.058∶1、LA和NaOH的質(zhì)量比2.227∶1、反應(yīng)溫度163.310 ℃。綜合考慮試驗(yàn)的實(shí)際操作性，確定共軛亞油酸的異構(gòu)化工藝條件為丙二醇和LA的質(zhì)量比4∶1、LA和NaOH的質(zhì)量比2∶1、反應(yīng)溫度163 ℃。以最佳工藝條件進(jìn)行6次平行試驗(yàn)并計(jì)算平均值，得到共軛亞油酸的純度為(93.78±1.86)%，產(chǎn)率為(89.15±1.28)%。預(yù)測(cè)值與實(shí)際值的偏差均小于5%，表明此優(yōu)化工藝可行。

2.3 共軛亞油酸的測(cè)定

2.3.1 紫外特征吸收峰的確定

由圖6可知，共軛亞油酸標(biāo)準(zhǔn)品在234 nm處有紫外特征吸收峰。因此，確定在234 nm波長(zhǎng)處對(duì)共軛亞油酸進(jìn)行定性和定量分析。

圖6 CLA標(biāo)準(zhǔn)品的紫外光譜圖

2.3.2 共軛亞油酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

由圖7可知，以吸光值為縱坐標(biāo)(Y)，共軛亞油酸標(biāo)準(zhǔn)品的不同濃度為橫坐標(biāo)(X)，得到線性回歸方程為Y=0.0925X+0.0998，R2=0.9996，線性良好，可作為共軛亞油酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖7 CLA標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.3 共軛異構(gòu)體的監(jiān)測(cè)

由圖8可知，反應(yīng)物亞油酸在234 nm處無(wú)特征吸收峰，而共軛亞油酸產(chǎn)物在234 nm處有明顯特征吸收峰，與共軛亞油酸標(biāo)準(zhǔn)品的紫外特征吸收峰一致，表明亞油酸發(fā)生了異構(gòu)化，產(chǎn)生了共軛亞油酸產(chǎn)物。另外，由圖9可知，亞油酸在1000～900 cm-1處的特征吸收帶發(fā)生了裂分，在981 cm-1和948 cm-1處出現(xiàn)兩個(gè)明顯的特征吸收帶，表明有共軛反式異構(gòu)體的存在，而共軛亞油酸產(chǎn)物與共軛亞油酸標(biāo)準(zhǔn)品的紅外光譜圖基本一致，證實(shí)了共軛亞油酸產(chǎn)物的存在。

圖8 LA和CLA產(chǎn)物的紫外光譜圖

圖9 LA、CLA標(biāo)準(zhǔn)品和CLA產(chǎn)物的紅外光譜圖

3 結(jié)論

本研究以山桐子油制備的亞油酸為原料，NaOH為堿，丙二醇為溶劑，在微波加熱下進(jìn)行異構(gòu)化，利用紫外分光光度法，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上結(jié)合響應(yīng)面法得到最佳工藝條件為丙二醇和LA的質(zhì)量比4∶1、LA和NaOH的質(zhì)量比2∶1、反應(yīng)溫度163 ℃，得到共軛亞油酸的純度為(93.78±1.86)%，產(chǎn)率為(89.15±1.28)%。結(jié)合紅外光譜圖和紫外光譜圖，確定亞油酸被異構(gòu)化，產(chǎn)生共軛雙鍵異構(gòu)體。

共軛亞油酸廣泛運(yùn)用于食品、藥品、化妝品等行業(yè)，在食品保健方面尤為突出，經(jīng)濟(jì)效益顯著。山桐子作為共軛亞油酸的新型制備原料，產(chǎn)量大，成本低廉，可用于工業(yè)化生產(chǎn)，具有一定的開(kāi)發(fā)價(jià)值。