張 新，王秋霞，李文霞，袁夢淇，趙小天,4，楊曉柯，劉興友，李永鋒*，仇華吉*

（1.河南科技學(xué)院動物科技學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150069；3.新鄉(xiāng)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；4.天津農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 300384）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由ASF 病毒（ASFV）感染引起的一種急性、高度傳染性、致死性動物傳染病[1]，臨床上以高熱、皮膚發(fā)紺和臟器廣泛性出血為主要特征[2]。世界動物衛(wèi)生組織（WOAH）將ASF 列為法定報告動物疫病，我國將其列為一類動物疫病[3]。ASFV 可感染所有品種和年齡的家豬和野豬，持續(xù)感染的野豬和軟蜱是家豬感染ASFV 的重要傳染源。迄今為止，ASF 已被報告存在于33 個國家。2020 年1 月至2022 年1 月間，ASFV 感染超過100萬頭家豬和2.8 萬頭野豬，損失的動物超過160 萬頭（通過INs 和FURs 報告的數(shù)據(jù)），其中有6 個國家首次報告ASF 疫情，同時有10 個國家報告其擴(kuò)散到新的區(qū)域，表明ASF 在新的國家和染疫國家的新地區(qū)持續(xù)蔓延（https://www.oie.int/en/document/asf_situation_report_3/）。我國自2018 年8 月在遼寧沈陽暴發(fā)首例ASF 以來，疫情不斷擴(kuò)散，并呈現(xiàn)全國蔓延態(tài)勢[4]。因目前尚無安全有效的ASF 疫苗，導(dǎo)致疫情控制難度增加，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)只能大規(guī)模撲殺，給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重?fù)p失。

ASFV 為雙股線狀DNA 病毒，是非洲豬瘟相關(guān)病毒科（Asfarviridae）非洲豬瘟病毒屬（Asfivirus）的成員，也是目前已知的唯一蟲媒DNA 病毒[5]。ASFV 病毒粒子直徑175 nm～215 nm，具有二十面體立體對稱結(jié)構(gòu)，由內(nèi)到外主要由5 部分組成：含病毒基因組DNA 的擬核、內(nèi)核芯殼、內(nèi)膜、衣殼和囊膜[6]。ASFV 基因組長度為170 kb～194 kb，有150～167 個開放閱讀框，編碼50 多種結(jié)構(gòu)蛋白和100 多種非結(jié)構(gòu)蛋白。ASFV 是一種大型的胞內(nèi)復(fù)制病毒，易感細(xì)胞為單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，能夠破壞宿主的免疫系統(tǒng)。

自20 世紀(jì)60 年代開始，大量學(xué)者開展了ASF 疫苗的相關(guān)研究。目前，滅活疫苗、亞單位疫苗和DNA 疫苗均不能對豬提供有效的免疫保護(hù)，至今仍無商品化疫苗。ASF 滅活疫苗因缺乏刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng)的能力，所以不能對免疫豬提供保護(hù)[7]，反而觀察到抗體依賴性增強(qiáng)（Antibody-dependent enhancement，ADE）作用[8]。弱毒疫苗免疫豬通常能抵抗同源病毒的攻擊，而對異源病毒的攻擊產(chǎn)生的抵抗作用有限甚至無保護(hù)作用[9]，且其安全性不能得到保證。目前鑒定出的ASFV 保護(hù)性抗原較少，雖然ASF 亞單位疫苗和DNA 疫苗能夠誘導(dǎo)豬產(chǎn)生免疫反應(yīng)，但僅能提供有限的免疫保護(hù)。病毒載體疫苗由于毒力基因的缺失，或使病毒無法復(fù)制，安全性較高，是ASF 疫苗研發(fā)的重要方向。本綜述對ASF 各類病毒載體疫苗的抗原選擇、載體類型、免疫程序和保護(hù)效力等方面進(jìn)行綜合比較分析，以期為研制安全高效的ASF 病毒載體疫苗提供一定的理論支持和借鑒。

1 基于病毒載體的ASF 疫苗

病毒載體疫苗是一類通過重組DNA 技術(shù)，將病毒改造成弱毒疫苗后作為載體來表達(dá)其他病原抗原性基因的新型疫苗。病毒載體疫苗具有弱毒疫苗和滅活疫苗的優(yōu)勢，能夠同時表達(dá)自身抗原蛋白和外源抗原蛋白。目前對于ASF病毒載體疫苗的研究，主要選用腺病毒（Adenoviruses，AdV）、痘病毒（Poxviruses）、桿狀病毒（Baculoviruses）等載體表達(dá)ASFV 抗原基因，以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答[10]。研究人員將表達(dá)ASFV 8個蛋白（B602L、B646L、CP204L、E183L、E199L、EP153R、F317L和MGF505-5R）的重組AdV 免疫豬，再用重組痘病毒加強(qiáng)免疫后利用104HAD50CSFV OUR/T88/1 株攻毒，豬全部存活[11]。評價表達(dá)ASFV 35 種抗原的重組AdV 免疫效果的結(jié)果顯示，雖然免疫后的豬不能抵御強(qiáng)毒株的攻擊，但在抗體陽性動物的組織中檢測出較低的病毒滴度，這表明重組AdV 誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)有助于抑制ASFV 的復(fù)制[12]。部分研究表明，病毒載體疫苗可以誘導(dǎo)豬產(chǎn)生強(qiáng)烈的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，可對ASFV 強(qiáng)毒株的攻擊提供一定的免疫保護(hù)（表1）。

表1 表達(dá)不同ASFV抗原的病毒載體疫苗誘導(dǎo)的免疫保護(hù)效力

2 ASFV 的抗原選擇

2.1 p54蛋白p54蛋白是由ASFVE183L基因編碼的結(jié)構(gòu)蛋白，位于病毒衣殼的內(nèi)部，約25 ku，含有一段跨膜區(qū)域，主要集中在衍生的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜處。該蛋白出現(xiàn)在病毒復(fù)制早期[13]，參與病毒粒子組裝，以及病毒粘附宿主細(xì)胞過程，是ASFV 的主要免疫原性蛋白[14]。此外，p54 蛋白在病毒衣殼的運(yùn)輸和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮重要作用[15]。在病毒內(nèi)化過程中，p54 蛋白通過獨(dú)特的半胱氨酸形成以二硫鍵連接的同型二聚體，與細(xì)胞質(zhì)中8 ku 的微管馬達(dá)動力蛋白輕鏈（DLC8）直接結(jié)合，使病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制位點(diǎn)[16]。在ASFV 早期感染階段，p54 蛋白能激活Caspase-9 和Caspase-3，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。同時，p54 蛋白與Bcl-2 家族凋亡蛋白Bim-3 競爭結(jié)合DLC8，將Bim-3 從DLC8 上解離，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17]。在病毒復(fù)制過程中，p54 蛋白通過招募宿主內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，將其轉(zhuǎn)化為ASFV 囊膜的前體，其中p54 蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)發(fā)揮重要作用。E183L基因的缺失會影響ASFV 的穩(wěn)定性。通過氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，p54蛋白為ASFV 的特異性蛋白，不與其他病毒蛋白氨基酸序列重疊，具有良好免疫原性，可以刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，能夠用于病毒感染的血清學(xué)診斷的靶標(biāo)[18]。所以在研制ASF 載體疫苗過程中，可以將E183L基因作為重要的候選基因。

2.2 p30 蛋白由CP204L基因編碼的p30 蛋白是ASFV 的主要結(jié)構(gòu)蛋白，具有高度保守的線性表位區(qū)域，蛋白大小為23.6 ku。p30 屬于病毒的早期蛋白，位于病毒包膜的內(nèi)膜，能夠促進(jìn)病毒的內(nèi)化[19]，在病毒侵入宿主細(xì)胞的過程中起重要作用。有研究表明，p30 蛋白在病毒DNA 合成開始之前產(chǎn)生，可在ASFV感染宿主細(xì)胞4 h 后檢測到該蛋白的表達(dá)，隨后持續(xù)存在于整個病毒復(fù)制周期[20]，是一種理想的血清學(xué)診斷抗原。同時，p30 蛋白包含優(yōu)勢抗原決定簇，具有良好的免疫原性，能夠誘導(dǎo)宿主較強(qiáng)的免疫應(yīng)答[21]。

2.3 p72 蛋白由B646L基因編碼的p72 蛋白是ASFV 的主要結(jié)構(gòu)蛋白，分子量約為73.2 ku，是病毒粒子二十面體衣殼的重要組成部分，位于病毒粒子的中層或表層，在病毒蛋白中含量最高，約占整個病毒粒子蛋白的32%。p72 蛋白在病毒感染的晚期表達(dá)，該蛋白的表達(dá)常作為病毒復(fù)制的標(biāo)志[22]。p72 參與ASFV 的吸附和侵入過程，能夠抑制病毒與細(xì)胞結(jié)合，針對p72 的抗體可以阻斷病毒與巨噬細(xì)胞的結(jié)合，但產(chǎn)生的抗體卻不足以抵抗ASFV 的攻擊，并不能起到有效的免疫保護(hù)作用[23]。p72 蛋白在宿主細(xì)胞內(nèi)合成后分布于細(xì)胞質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的囊泡中，隨后在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上形成核衣殼。不同病毒株之間的p72 蛋白均有相同的保守序列，且氨基酸序列同源性為97.8%～100%，穩(wěn)定性較強(qiáng)，極少發(fā)生變異[24]。對其三維結(jié)構(gòu)的研究顯示，p72 含有4 個主要抗原暴露表位（ER），分別為ER1、ER2、ER3 和ER4，這4 個抗原暴露表位可能參與受體的結(jié)合和中和性抗體的結(jié)合，是ASFV 的主要保護(hù)性抗原。相對于早期蛋白p30 和p54，晚期蛋白p72 具有較好的免疫原性。ASFV 感染豬可產(chǎn)生針對p72 的高水平抗體[25]，因此p72可以作為檢測抗原，在精準(zhǔn)檢測中發(fā)揮重要功能。此外，由于p72 良好的免疫原性，在疫苗研制方面也是一個優(yōu)勢蛋白。將表達(dá)ASFV p72 蛋白的重組AdV 免疫小鼠后，可誘導(dǎo)其產(chǎn)生特異性抗體以及分泌特異性IFN-γ。

2.4 CD2v 蛋白ASFV CD2v 蛋 白 由EP402R基 因 編碼，與宿主T 細(xì)胞表面黏附因子CD2 的結(jié)構(gòu)與功能類似。CD2v 蛋白約為41 ku，是由信號肽、兩個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)、酸性結(jié)構(gòu)域和富含亮氨酸的結(jié)構(gòu)域組裝而成的一種跨膜糖蛋白，屬于宿主免疫調(diào)控相關(guān)蛋白，存在于病毒粒子的囊膜中，具有較強(qiáng)的免疫原性，為ASFV 的重要保護(hù)性抗原[26]，主要在ASFV 感染的后期表達(dá)。CD2v 主要在病毒毒力、免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)、紅細(xì)胞吸附以及在組織趨向性、免疫逃避等方面發(fā)揮作用。

CD2v 是ASFV 的血凝素，免疫CD2v 的豬可產(chǎn)生血凝抑制及單核細(xì)胞感染抑制抗體，對同種血清型的ASFV 具有較高保護(hù)作用[27]，因此CD2v 的表達(dá)對于亞單位疫苗產(chǎn)生的部分保護(hù)也是必需的。在弱毒疫苗研發(fā)過程中，EP402R基因缺失株對豬無致病性，且可以保護(hù)豬抵抗強(qiáng)毒株的攻擊[28-29]。綜上所述，CD2v 蛋白是開發(fā)ASF 疫苗的重要候選靶標(biāo)。

2.5 pEP153R 蛋白pEP153R 蛋 白 是 由ASFVEP153R基因編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白，也稱為C型亮氨酸樣蛋白，編碼153 個氨基酸殘基，分子量為18.3 ku，其含有中央跨膜區(qū)，C 型凝集素樣結(jié)構(gòu)和細(xì)胞附著序列，蛋白中存在多個N-糖基化、磷酸化和豆蔻?；稽c(diǎn)，在病毒感染的早期和晚期轉(zhuǎn)錄。病毒感染細(xì)胞后，其參與感染細(xì)胞與紅細(xì)胞的吸附。有研究發(fā)現(xiàn)，pEP153R 蛋白是通過抑制MHC-I 分子從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到細(xì)胞膜的胞外分泌過程，從而抑制MHC-I 分子的表達(dá)[30]。同時pEP153R 可抑制ASFV 感染細(xì)胞的死亡及Caspase-3 的活性，從而抑制ASFV 引起的細(xì)胞凋亡。EP153R基因缺失株免疫豬再用105HAD50ASFV（I Lisbon 60）攻毒后豬全部存活[31]。

3 病毒載體類型

3.1 AdV 載體AdV 是一類線性雙鏈DNA 病毒，無包膜，呈二十面體對稱結(jié)構(gòu)。目前利用AdV 作為病毒載體較為廣泛，是一種將外源基因?qū)雱游矬w內(nèi)并實(shí)現(xiàn)表達(dá)的媒介，其在基因治療、基因免疫等方面應(yīng)用開發(fā)得較早?；贏dV 載體的安全性高、宿主范圍廣泛、病毒顆粒相對穩(wěn)定，可攜帶較長的外源基因，遞送和表達(dá)外源基因能力強(qiáng)，其構(gòu)建及其包裝易于操作等優(yōu)點(diǎn)[32]，因此其常作為載體用于疫苗的研發(fā)。另外，AdV 能快速有效增殖，易于制備高滴度的病毒。AdV 載體在攜帶外源基因進(jìn)入宿主細(xì)胞后只能瞬時表達(dá)，不會將基因整合到宿主細(xì)胞基因組中[33]，同時表達(dá)產(chǎn)物具有天然蛋白的活性，能夠刺激機(jī)體對外源蛋白產(chǎn)生強(qiáng)烈的特異性免疫反應(yīng)[34]?；贏dV 載體在抗原遞送及安全性等方面的優(yōu)勢，在構(gòu)建ASF 載體疫苗方面具有很大的潛力，已有很多研究團(tuán)隊開展了相關(guān)研究。

將ASFV 的p32、p54、p72 和多聚蛋白pp62 編碼基因分別插入AdV 載體，利用兩種佐劑采取雞尾酒式免疫豬，能夠快速誘導(dǎo)針對ASFV 抗原的特異性抗體和CTL 反應(yīng)[35]。此外，又將ASFVA151R、B119L、B602L、EP402RΔPRR、B438L、K205R和A104R基因分別插入到AdV 載體中，輔以佐劑以雞尾酒療法對豬免疫，構(gòu)建的重組AdV 能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的抗原特異性IgG 反應(yīng)和IFN-γ 的分泌[36]，但是以上免疫豬均未進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。謝靈志構(gòu)建了表達(dá)ASFV EP153R、CD2v、p54 和p72 蛋白的重組AdV，以CTLA4 部分序列為先導(dǎo)序列作為佐劑來增強(qiáng)免疫效果，均能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性抗體，且CTLA4 為佐劑的重組AdV 免疫組能誘導(dǎo)更好的體液免疫反應(yīng)[37]。雖然用AdV 載體表達(dá)ASFV 抗原可以誘導(dǎo)豬產(chǎn)生良好的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，但是對抗原的選擇、不同的免疫程序所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)、保護(hù)效力的高低，還需要進(jìn)一步評估。

3.2 痘病毒載體痘病毒是一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜的雙鏈DNA 病毒，基因組約180 kb～300 kb，病毒粒子呈磚形或橢圓形，是研究最早的病毒疫苗載體之一。目前主要的痘病毒載體包括痘苗病毒、牛痘苗病毒、雞痘病毒、豬痘病毒和羊痘病毒等。痘病毒載體的宿主范圍廣，因而適用于多種類型病毒基因的表達(dá)，對外源基因插入耐受性強(qiáng)，能夠插入較長的外源基因片段且表達(dá)水平較高。此外，痘病毒安全性好，不會整合到宿主基因組，增殖滴度高、穩(wěn)定性強(qiáng)，可通過多種途徑接種，且能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，接種后保護(hù)期持續(xù)時間較長。

有研究將篩選出的47 種ASFV 抗原整合到重組痘苗病毒載體中，進(jìn)行豬的免疫和攻毒試驗(yàn)，結(jié)果顯示，雖然重組痘苗病毒免疫后不能保護(hù)豬免受強(qiáng)毒株的攻擊，但是能夠誘導(dǎo)豬產(chǎn)生ASFV 特異性體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，血液和淋巴組織中的病毒基因組水平與對照組相比顯著降低[38]。選擇的抗原可能是該類重組病毒載體不能提供足夠保護(hù)的重要原因。將表達(dá)3 種ASFV 抗原（B646L、EP153R、EP402R）的重組痘苗病毒免疫豬后，能夠誘導(dǎo)其T 淋巴細(xì)胞增殖和IFN-γ 分泌，卻未能誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答[39]。細(xì)胞免疫反應(yīng)是ASF 疫苗誘導(dǎo)免疫保護(hù)的重要指標(biāo)，該重組病毒可能對豬有一定的保護(hù)效果，但該研究未進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。后期將評估痘病毒載體在豬中的安全性，并將表達(dá)的抗原優(yōu)化處理，以便在誘導(dǎo)豬產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng)的基礎(chǔ)上，同時誘導(dǎo)其產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，才能有望提高疫苗的保護(hù)效果。

3.3 桿狀病毒載體桿狀病毒是一類有囊膜的雙鏈環(huán)狀DNA 病毒，基因組為80 kb～180 kb，編碼90～180個病毒蛋白。病毒為一端較大一端較小的長桿狀，主要感染無脊椎動物，對人和哺乳動物無感染性。隨著對桿狀病毒研究的不斷深入，桿狀病毒的應(yīng)用也越來越廣泛。該病毒本身并不能在哺乳動物細(xì)胞中復(fù)制，也不會在這類細(xì)胞中增殖和擴(kuò)散，表明以桿狀病毒為載體的疫苗安全性好，通過對病毒基因組修飾改造，在適當(dāng)?shù)膯幼幼饔孟?，桿狀病毒可以作為外源蛋白的表達(dá)載體。桿狀病毒作為病毒載體也具有很多明顯優(yōu)勢：病毒外源基因容量大，基因組上有多個限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，可以攜帶較大的外源基因或多個外源基因，操作簡便，構(gòu)建效率高；外源蛋白的生物活性近似于天然蛋白；病毒部分基因的啟動子屬于強(qiáng)啟動子，能夠高效表達(dá)外源目的蛋白[40]。目前已有報道，利用重組桿狀病毒制備的疫苗可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對多種抗原較高的體液免疫及細(xì)胞免疫反應(yīng)。

研究顯示，將表達(dá)ASFV p30、p54 和psHA 融合蛋白的重組桿狀病毒經(jīng)肌肉接種豬3 次，能誘導(dǎo)其特異性T 細(xì)胞反應(yīng)，并能對強(qiáng)毒的攻擊提供部分保護(hù)[41]。另一項(xiàng)研究證實(shí)，用表達(dá)p22、p30、p54和p72蛋白的重組桿狀病毒經(jīng)肌肉接種豬3 次，能延緩強(qiáng)毒攻擊引起的臨床癥狀和病毒血癥[23]。以上結(jié)果表明p22、p30、p54 和p72 可 作 為ASFV 候 選 保 護(hù) 性 抗原，在今后構(gòu)建的病毒載體疫苗表達(dá)這些抗原，有望提高載體疫苗的保護(hù)效率。

3.4 新城疫病毒載體新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）在分類上屬于副黏病毒科（Paramyxoviridae）禽腮腺炎病毒亞科（Avulavirinae）正腮腺炎病毒屬（Orthoavulavirus），為單股負(fù)鏈RNA 病毒，基因組全長約15 kb。病毒粒子多呈球形，有囊膜，直徑約為100 nm～250 nm，主要編碼6 種結(jié)構(gòu)蛋白：基質(zhì)蛋白、磷蛋白、核衣殼蛋白、大分子蛋白、血凝素-神經(jīng)氨酸酶和融合蛋白[42]。隨著反向遺傳學(xué)技術(shù)的發(fā)展，NDV 被開發(fā)成一種安全有效的病毒載體來遞呈外源蛋白，具有極為突出的優(yōu)點(diǎn)：NDV 遺傳相對穩(wěn)定，并且只有一個血清型，病毒株之間發(fā)生重組及毒力返強(qiáng)的可能性極小；生物安全性良好，NDV基因組復(fù)制在細(xì)胞漿內(nèi)完成，不會整合到宿主基因組中；NDV載體疫苗免疫方法簡單，可以通過多種途徑免疫，例如滴鼻、點(diǎn)眼和飲水等方式；能夠引起有效的黏膜免疫、細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)，顯示出優(yōu)良的免疫原性；此外，構(gòu)建好的載體疫苗可利用于雞胚生產(chǎn)，生產(chǎn)成本低廉，便于規(guī)模化生產(chǎn)。

研究表明，表達(dá)ASFV p72 蛋白的重組NDV 在雞胚中復(fù)制良好，以108EID50重組病毒經(jīng)肌肉注射途徑接種小鼠，每隔2 周共免疫4 次，結(jié)果顯示，該重組病毒在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了高滴度的p72 特異性IgG 抗體，并誘導(dǎo)其T 細(xì)胞的增殖和IFN-γ、IL-4 的分泌[43]。該重組病毒可同時誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，但當(dāng)時ASF尚未在我國出現(xiàn)，因此未對豬進(jìn)行免疫和攻毒試驗(yàn)，該重組病毒能否在豬體內(nèi)產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)還有待進(jìn)一步研究。

3.5 偽狂犬病病毒載體偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）屬于皰疹病毒科（Herpesviridae）α皰疹病毒亞科（Alphaherpesvirinae）水痘病毒屬（Varicellovirus），為線性雙鏈DNA 病毒。在形態(tài)上呈球形或橢球形，成熟病毒粒子直徑約160 nm，主要由脂質(zhì)雙層衣殼、皮層、囊膜及核仁構(gòu)成，基因組全長約150 kb。研究者發(fā)現(xiàn)，一些已知的毒力基因缺失、突變或替代后，能夠顯著降低PRV 的毒力而不影響PRV 的復(fù)制，表明PRV 可以成為外源基因插入表達(dá)的重要載體。PRV作為載體，宿主范圍廣泛，安全性好；外源基因容量大，可同時插入多個外源基因，不影響病毒的復(fù)制和免疫原性；PRV所表達(dá)的外源蛋白可以正常翻譯后加工、修飾，表達(dá)產(chǎn)物具有天然蛋白質(zhì)的活性，并且保留了其相應(yīng)的功能，可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生持續(xù)時間較長的體液與細(xì)胞免疫反應(yīng)。

有研究者在gE和gI雙基因缺失PRV 株的基礎(chǔ)上構(gòu)建出表達(dá)ASFV p72、p54、p30、CD2v 和pEP153R蛋白的5 種不同重組PRV，均與親本病毒具有相似的生長特性，免疫小鼠后無死亡情況，具有很好的安全性[44]。以PRV 為載體表達(dá)ASFV CD2v蛋白，構(gòu)建的重組病毒具有良好的遺傳穩(wěn)定性和復(fù)制能力[45]。表明PRV 可作為表達(dá)ASFV 抗原的候選病毒載體，但目前的研究均未進(jìn)行豬的免疫或攻毒試驗(yàn)。此外，PRV為豬源病毒，免疫豬后是否會影響免疫效果也未知。

4 存在的問題與展望

ASF 作為一種“百年老病”，給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴(yán)重的損失和威脅。防控ASF最有效的措施是控制傳染源、切斷傳播途徑和保護(hù)易感動物。但是隨著經(jīng)濟(jì)全球化的快速發(fā)展，跨地域的人員和貿(mào)易交流越來越頻繁，養(yǎng)殖密度高、模式多樣，部分從業(yè)人員生物安全意識淡薄，給ASF的防控和根除帶來了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。所以研發(fā)出安全有效的ASF 疫苗，保障生豬供應(yīng)，是我國生豬養(yǎng)殖急需解決的問題。

ASF 疫苗的研究已接近60 年，各國科學(xué)家對多種疫苗進(jìn)行了研發(fā)嘗試，但是ASFV 基因組結(jié)構(gòu)龐大且復(fù)雜，編碼蛋白眾多且易變異，同時ASFV 具有較為完備的免疫逃避機(jī)制，病毒致病機(jī)理尚不清楚，所以至今仍無商業(yè)化的疫苗。載體疫苗能夠誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生多種免疫應(yīng)答，一些載體自身具有佐劑的性質(zhì)，能夠增強(qiáng)疫苗的免疫效果。病毒載體來源豐富，還可以開發(fā)多價疫苗，起到一針防多病的作用。將編碼免疫原的病毒載體進(jìn)行疫苗標(biāo)記，在接種疫苗后利用配套的檢測方法可以區(qū)分自然感染動物和疫苗接種動物?；跅U狀病毒、AdV 和痘病毒等載體的研究，表明病毒載體疫苗可誘導(dǎo)產(chǎn)生有效的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，對ASFV 強(qiáng)毒株的攻擊提供一定的免疫保護(hù)。然而，盡管很多病毒載體疫苗的研制已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，但是在臨床應(yīng)用方面還存在一些缺陷，在ASFV 攻擊后這些疫苗的保護(hù)作用有限，其對宿主存在著潛在的安全隱患，某些情況下會增強(qiáng)病毒的感染能力和臨床癥狀，還可能受母源抗體的干擾，以及中和抗體可能會影響免疫效果等。但是隨著生物技術(shù)的進(jìn)步，病毒載體疫苗以不可比擬的優(yōu)勢，將會得到更加深入的研究和廣泛的應(yīng)用。

未來針對病毒載體的ASF 疫苗需要解決的幾個關(guān)鍵問題：（1）在目前研究中發(fā)現(xiàn)，部分ASFV 蛋白所誘導(dǎo)產(chǎn)生的非中和抗體可能存在著增強(qiáng)疾病感染的風(fēng)險（ADE 效應(yīng)），引起嚴(yán)重的機(jī)體病理反應(yīng)，因此在構(gòu)建ASF 病毒載體疫苗時應(yīng)考慮缺失該類蛋白；（2）加強(qiáng)對ASFV 的生物學(xué)特性的研究，采用生物信息學(xué)方法，以ASFV 全基因組序列為基礎(chǔ)，分析功能未知的基因，分析鑒定病毒蛋白的結(jié)構(gòu)和抗原表位，根據(jù)其細(xì)胞定位、疏水性、抗原性的預(yù)測結(jié)果，初步篩選出候選抗原蛋白編碼基因[46]。利用反向疫苗學(xué)研究策略，對候選抗原分別克隆表達(dá)和表達(dá)蛋白的免疫保護(hù)性測定，為疫苗研究提供有效的候選抗原；（3）疫苗的免疫原性依賴于抗原蛋白有效的轉(zhuǎn)錄和翻譯，可以通過優(yōu)化篩選出的抗原基因，從而提高抗原基因的表達(dá)，增強(qiáng)載體疫苗的免疫原性；（4）目前表達(dá)ASFV 抗原基因的載體有很多，使用合適的載體遞呈這些抗原，是目前研制載體疫苗的重要問題。此外，優(yōu)化已有的實(shí)驗(yàn)性疫苗，搭配新型佐劑，探究疫苗的免疫劑量、免疫程序和免疫途徑等，從而增強(qiáng)疫苗的免疫效果。

ASF 防控任重而道遠(yuǎn)，在研制出有效的商品化疫苗之前，科學(xué)的ASF 常態(tài)化生物安全防控手段同樣至關(guān)重要。隨著新技術(shù)的不斷發(fā)展，以及對ASFV基因組研究的不斷深入，基于病毒載體的ASF 疫苗有望成為防控ASF 的有力手段。