王姍姍，刁子洋，郭 琨，王雪瑩，侯嘉明，薄祿琪，王 爽，宋銘忻

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物源性人獸共患病黑龍江省重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030）

旋毛蟲病是由旋毛蟲引起的一種嚴(yán)重的人獸共患線蟲病，在食肉哺乳動物之間廣泛傳播，人因食用含活旋毛蟲的豬、犬及其肉制品等而感染[1]。旋毛蟲感染過程中蟲體釋放的抗原作用于TLR4 受體，引起其表達量的變化，進而通過TLR4/MyD88/NF-κB通路的激活引起炎性因子分泌發(fā)生變化[2]。旋毛蟲重度感染者可因心肌炎、腦炎、肺炎等死亡，其中心肌炎是最多見的旋毛蟲致死病因之一[3-4]。研究認(rèn)為，旋毛蟲感染導(dǎo)致的心肌炎有兩種可能，一是旋毛蟲幼蟲從心肌一過性游走導(dǎo)致的直接性心肌炎，一是旋毛蟲所分泌的毒素導(dǎo)致的間接性心肌炎[5]。

熱休克蛋白（Heat shock proteins，HSP）也稱為應(yīng)激蛋白，在寄生蟲感染過程中，宿主機體與蟲體均處于應(yīng)激狀態(tài)，各自產(chǎn)生的HSP 相互抵抗，寄生蟲產(chǎn)生的HSP 參與其分化、致病力及侵入過程[6]。研究發(fā)現(xiàn)，旋毛蟲HSP70 重組蛋白（Ts-Hsp70）通過與細菌脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）相似的路徑刺激和活化樹突狀細胞，且大劑量的Ts-Hsp70 對樹突狀細胞有毒性作用，而LPS 可刺激機體產(chǎn)生一系列反應(yīng)并對心肌產(chǎn)生直接損傷，導(dǎo)致心肌細胞的凋亡[7]，但旋毛蟲HSP70 對心肌細胞功能的影響研究甚少[8]。因此，本研究通過將Ts-Hsp70 體外作用于H9c2 細胞，檢測H9c2細胞損傷標(biāo)志性因子，分析線粒體凋亡通路中相關(guān)凋亡蛋白與抗凋亡蛋白的表達，研究旋毛蟲致宿主心肌炎發(fā)生的機制，解析旋毛蟲感染與宿主心肌細胞凋亡的關(guān)系，研究結(jié)果將對研究旋毛蟲的發(fā)病機制和提供防治對策具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 蟲種、細胞系及主要試劑旋毛形線蟲（Trichinella spiralis）分離自黑龍江遜克豬，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院獸醫(yī)寄生蟲學(xué)教研室保種；大鼠心肌細胞H9c2 由內(nèi)蒙古大學(xué)提供。Ts-Hsp70 由本實驗室表達并保存。

LPS 購自北京博奧拓達科技有限公司；CCK-8 細胞活性檢測試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒及活性氧（Reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒，均購自大連美侖生物公司；乳酸脫氫酶（Lactic dehydrogenase，LDH）檢測試劑盒及肌酸激酶（Creatinekinase，CK）檢測試劑盒，購自南京建成生物科技有限公司；SYBR Premix ExTaqⅡ購自寶生物工程（大連）有限公司；鼠源GAPDH 多克隆抗體（PcAb）、鼠源Bax PcAb、鼠源Bcl-2 PcAb、鼠源Cytochrome C PcAb、鼠源Pro-Caspase-9 PcAb、鼠源cl-Caspase-9 PcAb、鼠源Pro-Caspase-3 PcAb、鼠源cl-Caspase-3 PcAb、羊抗鼠IgG-HRP（二抗），均購自中國Abmart公司。

1.2 Ts-Hsp70 刺激H9c2 細胞最適濃度的優(yōu)化取對數(shù)生長期的H9c2 細胞鋪于96 孔板，待細胞貼壁后分別加入5 μg/mL、10 μg/mL、15 μg/mL、25 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL 的Ts-Hsp70，以10 μg/mL LPS 刺激的H9c2 細胞作為陽性對照，以不做處理的細胞為空白對照。于5% CO2、37 ℃孵育12 h 后棄上清，按每孔培養(yǎng)基總體積的10%加入CCK-8 溶液，孵育4 h 后，經(jīng)酶標(biāo)儀檢測OD450nm值，利用CCK-8 試劑盒檢測細胞得相對活性，篩送Ts-Hsp70 最適濃度。以上實驗重復(fù)3 次。

1.3 Ts-Hsp70 刺激H9c2 細胞后 的LDH 含 量 測定取對數(shù)生長期的H9c2 細胞以1×105個/孔鋪于24孔板中培養(yǎng)至貼壁后，加入1.2 確定的最適濃度的Ts-Hsp70，于5%CO2、37 ℃孵育6 h、12 h、18 h 后取細胞培養(yǎng)上清液，經(jīng)酶標(biāo)儀檢測OD450nm值，利用LDH 試劑盒檢測各組細胞的LDH 含量，以上試驗重復(fù)3 次。試驗以LPS 刺激的H9c2 細胞為陽性對照，以不做處理的細胞為空白對照。

1.4 Ts-Hsp70 刺激H9c2 細胞后的CK 含量測定取1.3 中共孵育后各時間點細胞培養(yǎng)上清液加入比色皿中，采用CK 試劑盒檢測各組細胞的CK 含量，以上試驗重復(fù)3 次。

1.5 Ts-Hsp70 刺 激H9c2 細 胞 后釋放ROS 的 檢測于1.3 中共孵育后各時間點細胞培養(yǎng)孔中分別加入無血清培養(yǎng)液稀釋后的熒光探針（DCFH-DA）（1∶1 000，終濃度為10 mol/L），孵育30 min后，用無血清培養(yǎng)基洗滌3 次，經(jīng)熒光顯微鏡檢測熒光信號，分析Ts-Hsp70 刺激H9c2 細胞后對其ROS 釋放的影響，以上試驗重復(fù)3 次。試驗設(shè)在檢測前30 min 時加入無血清培養(yǎng)液稀釋后的Rosup（1∶1 000，終濃度為50 μg/mL）作為陽性對照，以不做處理的細胞為空白對照。

1.6 Ts-Hsp70 刺激H9c2 細胞后細胞凋亡基因Bax、Bcl-2 轉(zhuǎn)錄及表達水平的檢測取對數(shù)生長期的H9c2 細胞鋪于12 孔板中培養(yǎng)，按照1.3 中方法加入Ts-Hsp70 后，分別于共孵育6 h、12 h、18 h 時收獲H9c2 細胞，利用TRIzol 試劑提取細胞中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后作為模板，采用表1 中的引物，經(jīng)熒光定量PCR（qPCR）分別檢測H9c2 細胞中Bax、Bcl-2 mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平，采用2-ΔΔCt方法[9]分析檢測結(jié)果，以上試驗重復(fù)3 次。試驗同樣以LPS刺激的H9c2 細胞為陽性對照，以不做處理的細胞為空白對照。另外，分別以鼠源Bax、Bcl-2 的PcAb（1∶500）為一抗，羊抗鼠IgG-HRP（1∶5 000）為二抗，經(jīng)western blot 檢測凋亡基因Bax、Bcl-2 的表達水平。

表1 熒光定量PCR引物序列Table 1 Sequence of qPCR primers

1.7 Ts-Hsp70 刺激H9c2 細胞后凋亡相關(guān)蛋白表達水平的檢測取對數(shù)生長期的H9c2 細胞鋪于6 孔板中培養(yǎng)，按照1.3 方法加入Ts-Hsp70 后于共孵育6 h、12 h、18 h 時分別加入適量的RIPA 蛋白裂解液，通過BCA 蛋白定量試劑盒測定各組上清液蛋白濃度，根據(jù)測量結(jié)果，將各組蛋白稀釋至同一濃度后分別加入5×SDS-PAGE 上樣緩沖液，煮沸8 min 后經(jīng)SDSPAGE 檢測，用5%脫脂乳封閉2 h 后分別以鼠源Cytochrome C、Pro-Caspase-9（Pro-CASP-9）、cl-Caspase-9（cl-CASP-9）、Pro-Caspase-3（Pro-CASP-3）及cl-Caspase-3（cl-CASP-9）（1∶500）的PcAb 為一抗，羊抗鼠IgG-HRP（1∶5 000）為二抗，以ECL 發(fā)光試劑顯影，進行western blot 檢測，利用Image-J 軟件檢測條帶灰度值，分析凋亡相關(guān)蛋白表達水平。試驗同樣設(shè)LPS刺激的H9c2 細胞為陽性對照，以不做處理的細胞為空白對照。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析所有的數(shù)據(jù)均采用SPSS軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，并通過Graphpad Prism 7.0 軟件對數(shù)據(jù)作圖，所有數(shù)值均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（即-x±s）表示，兩組數(shù)據(jù)之間比較使用獨立樣本t檢驗；實驗數(shù)據(jù)均值比較采用單因素方差分析（*代表P＜0.05 表示差異顯著，**代表P＜0.01 表示差異極顯著）。

2 結(jié) 果

2.1 Ts-Hsp70 刺激H9c2 細胞最適濃度的優(yōu)化結(jié)果H9c2 細胞經(jīng)不同濃度Ts-Hsp70 作用12 h，采用CCK-8 法檢測細胞活性。結(jié)果顯示，與空白對照細胞 相 比，濃 度 為5 μg/mL～25 μg/mL 的Ts-Hsp70 對H9c2 細胞活性均無顯著影響，而40 μg/mL～100 μg/mL的Ts-Hsp70 極顯著降低了H9c2 細胞活性（P＜0.01），且呈濃度依賴性，進一步分析顯示40 μg/mL Ts-Hsp70 對H9c2 細胞活力影響較弱，不利于凋亡基因的檢測，而60 μg/mL Ts-Hsp70 對細胞活力影響適中，細胞活力可達到70%，因此選取60 μg/mL 濃度的Ts-Hsp70用于后續(xù)試驗（圖1）。

圖1 Ts-Hsp70刺激H9c2細胞濃度優(yōu)化Fig.1 Optimization of H9c2 cell concentration stimulated by Ts-HSP70

2.2 Ts-Hsp70 刺激H9c2 細胞后的LDH 含量測定結(jié)果H9c2 細胞經(jīng)60 μg/mL Ts-Hsp70 分別作用6 h、12 h 和18 h 后，采用LDH 試劑盒檢測培養(yǎng)基中LDH含量。結(jié)果顯示，隨著作用時間的延長，LDH 含量總體呈上升趨勢，與空白對照細胞相比，H9c2 細胞在受到Ts-Hsp70 蛋白刺激6 h 后LDH 含量極顯著增加（P＜0.01），在作用12 h 后LDH 含量達到峰值，約為空白對照組的3 倍（P＜0.01），而LPS 陽性對照組中LDH 含量約為空白對照組的4 倍（圖2）。表明Ts-Hsp70 對細胞有毒性作用。

圖2 Ts-Hsp70刺激H9c2細胞后的LDH含量測定結(jié)果Fig.2 Test results of LDH content in H9c2 cells stimulated by Ts-Hsp70

2.3 Ts-Hsp70 刺激H9c2 細胞后的CK 含量測定結(jié)果H9c2 細胞經(jīng)60 μg/mL Ts-Hsp70 分別作用6 h、12 h 和18 h 后，采用CK 試劑盒檢測培養(yǎng)基中CK 含量。結(jié)果顯示，隨著刺激時間的延長，CK 含量總體呈上升趨勢，與空白對照組相比，H9c2 心肌細胞在受到Ts-Hsp70 作用6 h 后CK 含量極顯著增加（P＜0.01），在作用12 h 后CK 含量達到峰值（P＜0.01），約為空白對照組的3.5 倍，LPS 陽性對照組中CK 含量約為空白對照組的4.5 倍（圖3）。表明Ts-Hsp70 對細胞有損傷作用。

圖3 Ts-Hsp70刺激H9c2細胞后的CK含量測定結(jié)果Fig.3 The results of CK content determination after TS-Hsp70 stimulation on H9c2 cells

2.4 Ts-Hsp70 刺激H9c2 細胞后ROS 的檢測結(jié)果H9c2 細胞經(jīng)60 μg/mL Ts-Hsp70 分別作用6 h、12 h 和18 h 后，采用ROS 試劑盒檢測H9c2 細胞中ROS 的釋放量。結(jié)果顯示，與空白對照細胞相比，Ts-Hsp70作用后的H9c2 細胞內(nèi)ROS 的熒光強度隨著作用時間逐漸加強，LPS陽性對照組中熒光最強（圖4）。表明Ts-Hsp70能夠引起H9c2細胞中ROS的含量升高。

圖4 Ts-Hsp70刺激H9c2細胞后釋放ROS的熒光檢測結(jié)果Fig.4 Immunofluorescence detection results of ROS release after TS-Hsp70 stimulation of H9c2 cells

2.5 Ts-Hsp70 刺激H9c2 細胞后細胞凋亡基因Bax、Bcl-2 轉(zhuǎn)錄及表達水平的檢測結(jié)果采用qPCR 和western blot 兩種方法檢測Ts-Hsp70 對H9c2 細胞中Bax 和Bcl-2 產(chǎn)生的影響。結(jié)果顯示，與空白對照細胞相比， Bax 轉(zhuǎn)錄水平隨Ts-Hsp70 作用時間延長而增加，于作用12 h 達到峰值；而Bcl-2 含量隨作用時間延長而減少，在作用12 h 時其轉(zhuǎn)錄水平極顯著降低（P＜0.01）。其中尤其以Bax/Bcl-2 的比值變化更為顯著，呈極顯著升高（P＜0.01）（圖5A）。從western blot 結(jié)果顯示，與空白對照組相比，在作用后6 h 開始，細胞中Bax 的含量極顯著升高（P＜0.01），在刺激12 h 達峰值。LPS 陽性對照組中Bax 的含量約為對照組的3.6 倍（圖5C）；而Bcl-2 的含量整體呈下降趨勢（圖5B），與空白對照細胞相比，在刺激后6 h 開始，細胞中Bcl-2 的含量極顯著降低（P＜0.01），在刺激12 h 達到谷值，于刺激18 h 有所上升（圖5C）。表明Ts-Hsp70 可通過線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)H9c2 細胞發(fā)生凋亡。

圖5 Ts-Hsp70對H9c2細胞Bax和Bcl-2影響的檢測結(jié)果Fig.5 Effects of Ts-Hsp70 on Bax and Bcl-2 in H9c2 cell

2.6 Ts-Hsp70 刺激H9c2 細胞后凋亡相關(guān)蛋白表達水平的檢測結(jié)果Ts-Hsp70 刺激H9c2 細胞后，經(jīng)western blot 檢 測Cytochrome C、Pro-CASP-9、cl-CASP-9、Pro-CASP-3 及cl-CASP-3 蛋白水平表達，結(jié)果顯示，與空白對照組相比，在刺激后6 h 開始，Cytochrome C 的含量極顯著升高（P＜0.01），在刺激12 h 達峰值，約為空白對照組的3.5 倍（圖6B）。與空白對照細胞相比，在刺激后6 h 開始，Pro-CASP-9的含量極顯著降低（P＜0.01），于刺激12 h 達谷值（圖6C）；而cl-CASP-9 的含量在刺激后6 h 開始極顯著升高（P＜0.01），于刺激12 h 達峰值，約為對照組的2.8 倍（圖6D）。與空白對照組相比，在刺激后6 h開始，Pro-CASP-3 的含量極顯著降低（P＜0.01），于刺激12 h達谷值（圖6E）；而cl-CASP-3的含量在刺激后6 h開始極顯著升高（P＜0.01），于刺激12 h達峰值，約為空白對照組的2.9 倍（圖6F）。表明Ts-Hsp70 刺激H9c2 細胞后Cytochrome C 明顯增加，激活了線粒體通路凋亡執(zhí)行分子Caspase-9，引發(fā)下游凋亡因子Caspase-3 的激活，即激活了細胞線粒體的凋亡通路從而誘導(dǎo)細胞凋亡。

圖6 Western blot檢測線粒體凋亡相關(guān)基因的蛋白表達水平結(jié)果Fig.6 Western blot was used to detect the protein expression of mitochondrial apoptosis-related genes

3 討 論

心肌炎是旋毛蟲感染導(dǎo)致宿主死亡的最主要原因之一，旋毛蟲幼蟲在移行過程中可直接或間接引起宿主心肌損傷，旋毛蟲分泌的有毒物質(zhì)可隨血液或淋巴液到達心臟并引起心臟病理改變，寄生蟲感染過程中，機體與蟲體皆處于應(yīng)激狀態(tài)，各自產(chǎn)生的HSP 相互抵抗，寄生蟲產(chǎn)生的HSP 參與其分化、致病力及侵入過程[6]，HSP70 是多種熱應(yīng)激蛋白中研究最多的一種蛋白，目前對于Ts-Hsp70 已有初步研究進展，Ts-Hsp70 為分泌型抗原，其在排泄分泌性抗原（Excretory-secretory antigen，ES）中存在。

研究表明，低濃度的Ts-Hsp70 通過與細菌LPS相似的TLR4/TLR2 路徑刺激和活化樹突狀細胞引發(fā)抗旋毛蟲感染的保護性免疫[10]，高濃度的Ts-Hsp70對樹突狀細胞有毒性作用，也有研究顯示弓形蟲HSP70 可直接刺激肝臟誘發(fā)肝臟組織的氧化應(yīng)激，致肝細胞壞死或凋亡[11]。CK 和LDH 是傳統(tǒng)的心肌酶譜，CK 主要存在于細胞質(zhì)和線粒體中，其活性測定可以在一定程度上反映心肌損傷的嚴(yán)重程度[12]；LDH釋放常被作為評估細胞毒性和檢測細胞膜完整性的指標(biāo)；ROS 升高可產(chǎn)生氧化應(yīng)激，大量的活性氧不僅可以攻擊細胞膜、各種細胞器，還可以破壞蛋白質(zhì)、核酸等，最終導(dǎo)致細胞壞死或凋亡[13]。本研究發(fā)現(xiàn)高濃度的Ts-Hsp70 刺激大鼠H9c2 細胞后細胞上清液中CK、LDH 含量顯著升高，于12 h 達峰值，表明Ts-Hsp70 可導(dǎo)致H9c2 細胞損傷，破壞H9c2 細胞膜完整性而釋放LDH，促使心肌損傷標(biāo)志性因子CK升高，其作用H9c2 細胞12 h 時對H9c2 細胞造成的損傷最大，細胞內(nèi)的ROS含量也顯著增加，大量的ROS可以破壞細胞膜、各種細胞器，進一步表明Ts-Hsp70 可導(dǎo)致H9c2 細胞損傷。

本研究還發(fā)現(xiàn)高濃度的Ts-Hsp70 可誘導(dǎo)大鼠H9c2 細胞發(fā)生凋亡。本研究結(jié)果顯示，無論從基因轉(zhuǎn)錄水平還是蛋白表達水平來看，Bax 的含量均隨著刺激時間增加整體呈上升趨勢，而Bcl-2 的含量隨著刺激時間增加整體呈下降趨勢，Bax/Bcl-2 的比值則顯著升高。Bax 分散于基質(zhì)中，在受到凋亡刺激時，Bax 會快速遷移到線粒體膜上，發(fā)揮促凋亡作用，當(dāng)Bax的表達量過高時可以破壞Bcl-2對細胞的保護促進細胞死亡，所以Bax與Bcl-2的比值對線粒體凋亡途徑起重要調(diào)控作用[14-15]。因此，本研究結(jié)果表明Ts-Hsp70 可導(dǎo)致H9c2 細胞發(fā)生損傷，促使H9c2 細胞線粒體功能發(fā)生障礙。而線粒體功能發(fā)生障礙可導(dǎo)致細胞內(nèi)的Cytochrome C 釋放到細胞質(zhì)中，釋放到細胞質(zhì)中的Cytochrome C 可激活Caspase-9、Caspase-3，最終促使細胞凋亡[16]。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)高濃度的Ts-Hsp70 作用大鼠H9c2 細胞12 h 后，Cytochrome C 的含量及Caspase-9、Caspase-3 的激活最為顯著，該結(jié)果表明Ts-Hsp70 作用H9c2 細胞12 h 時對H9c2 細胞造成的損傷最大，且誘導(dǎo)H9c2 細胞發(fā)生內(nèi)源性凋亡。Rui 等的研究表明Ts-Hsp70 是一種潛在的疫苗抗原，將其注射小鼠后，肌肉組織中肌肉幼蟲數(shù)量減少了38.4%，并且誘導(dǎo)小鼠對旋毛蟲感染產(chǎn)生了保護性免疫[17]，出現(xiàn)這種情況極可能與其采用的HSP70濃度不一樣，本研究也發(fā)現(xiàn)低濃度的Ts-Hsp70 對大鼠H9c2 細胞無損傷作用。

綜上所述，本研究首次通過體外實驗證明Ts-Hsp70 可引起大鼠心肌細胞損傷，并通過線粒體途徑促進Caspase 級聯(lián)反應(yīng)，從而激活誘導(dǎo)H9c2 細胞發(fā)生內(nèi)源性凋亡，該結(jié)果為下一步深入研究旋毛蟲致心肌損傷分子機制提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。